慢病毒介导PTEN基因表达降低的RSC96施万细胞系模型建立

背景:第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10,PTEN)是一种抑癌基因,可以通过调节PI3K/AKT/mTOR等信号通路在细胞增殖凋亡中起到作用。最新研究证实,PTEN可在脊髓损伤、周围神经缺损等骨科疾病中起到重要作用,而相关的细胞模型却鲜有报道。目的:构建携载大鼠PTEN基因的慢病毒载体,建立PTEN基因表达降低的RSC96施万细胞系模型。方法:设计大鼠PTEN基因RNAi序列,将其构建并包装成可转染的慢病毒,转染RSC96施万细胞后,通过RT-PCR检测RSC96施万细胞中PTEN基因的表达情况。结果:成功构建病毒滴度为8E+8TU/ml的PTEN-RNAi慢病毒,将其转染RSC9施万细胞后,细胞中PTEN基因的相对表达量为0.2322±0.0187,敲减效率为76.78%,与阴性对照慢病毒转染组(1.0044±0.0022)相比,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:成功建立PTEN基因表达降低的RSC96施万细胞系模型,为研究PTEN基因相关的创伤骨科、脊柱外科、手外科疾病提供实验基础。

Etifoxine通过上调CELSR2蛋白表达促进RSC96增殖及迁移

目的探讨艾替伏辛(Etifoxine)对大鼠许旺细胞(RSC96)增殖和迁移的影响及分子机制。方法2020年3月-2020年10月,观察Etifoxine对RSC96 SCs增殖和迁移的影响,将细胞分为20μmol/L Etifoxine组和生理盐水组,处理48 h后使用EDU细胞增殖检测试剂盒、Transwell实验以及划痕实验检测细胞增殖和迁移能力的变化。观察Etifoxine对RSC96、表皮生长因子样蛋白2抗原(CELSR2)蛋白表达的影响,建立Etifoxine浓度梯度,将细胞分别用生理盐水组和5μmol/L、10μmol/L和20μmol/L Etifoxine进行培养,48 h后通过Western blot检测各组细胞CELSR2蛋白表达。探讨CELSR2是否为Etifoxine的潜在作用靶点,将细胞分为20μmol/L Etifoxine加CELSR2 siRNA组和20μmol/L Etifoxine加Control siRNA组,处理48 h后再次检测细胞增殖和迁移情况。采用非参数Mann-Whitney检验进行数据分析,P<0.05表示差异有统计学意义。结果EdU和Transwell实验结果显示,20μmol/L Etifoxine处理组RSC96细胞增殖率(36.30±3.09)%、迁移细胞数量(132.30±6.77)均高于对照组[分别为(19.40±2.50)%和65.33±7.37],24 h和36 h划痕愈合率分别为(30.67±2.16)%和(86.00±2.19)%,均高于对照组[分别为(23.00±2.61)%和(49.67±2.81)%],差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示,随着Etifoxine浓度升高,RSC96细胞CELSR2蛋白表达增多(P<0.05),但10μmol/L和20μmol/L Etifoxine组蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05)。经20μmol/L Etifoxine处理的RSC96细胞转染CELSR2 siRNA后,与对照组相比,细胞增殖率、迁移细胞数量以及24 h/36 h划痕愈合率均明显下降(P<0.05)。结论Etifoxine可促进RSC96增殖及迁移,而且Etifoxine诱导的增殖和迁移促进作用与RSC96 CELSR2蛋白表达上调相关。