慢病毒介导PTEN基因表达降低的RSC96施万细胞系模型建立

背景:第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10,PTEN)是一种抑癌基因,可以通过调节PI3K/AKT/mTOR等信号通路在细胞增殖凋亡中起到作用。最新研究证实,PTEN可在脊髓损伤、周围神经缺损等骨科疾病中起到重要作用,而相关的细胞模型却鲜有报道。目的:构建携载大鼠PTEN基因的慢病毒载体,建立PTEN基因表达降低的RSC96施万细胞系模型。方法:设计大鼠PTEN基因RNAi序列,将其构建并包装成可转染的慢病毒,转染RSC96施万细胞后,通过RT-PCR检测RSC96施万细胞中PTEN基因的表达情况。结果:成功构建病毒滴度为8E+8TU/ml的PTEN-RNAi慢病毒,将其转染RSC9施万细胞后,细胞中PTEN基因的相对表达量为0.2322±0.0187,敲减效率为76.78%,与阴性对照慢病毒转染组(1.0044±0.0022)相比,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:成功建立PTEN基因表达降低的RSC96施万细胞系模型,为研究PTEN基因相关的创伤骨科、脊柱外科、手外科疾病提供实验基础。

大鼠雪旺细胞系RSC96条件培养液对少突胶质前体细胞的体外增殖作用

目的观察大鼠雪旺细胞系RSC96细胞条件培养液(RSC96-CM)对少突胶质前体细胞(OPCs)增殖的影响,探讨其作用机制。方法应用免疫粘附法从胚胎15d的SD大鼠脊髓分离OPCs,应用Brd U掺入实验检测OPCs的增殖,应用RT-PCR技术检测PDGF-AA和bFGF在RSC96细胞的表达,应用ELISA技术检测RSC96-CM中PDGF-AA和bFGF蛋白的浓度,以特异性抑制剂阻断观察PDGF-AA和bFGF在RSC96-CM诱导OPCs增殖中的作用,以特异性抑制剂观察ERK和JNK信号途径在RSC96-CM诱导OPCs增殖中的作用。结果不同浓度的RSC96-CM培养的OPCs,其BrdU+细胞的比例与对照组相比均显著增加(P<0.05),其中,在含50%RSC96-CM的培养液中培养的OPCs的BrdU+细胞的比例达高峰。RT-PCR证实RSC96细胞显著表达PDGF-AA和bFGF的mRNAs,ELISA结果发现,RSC96-CM中PDGF-AA和bFGF的蛋白浓度分别是我们前期报道的B104CM中PDGF-AA和bFGF的蛋白水平的0.87倍和0.92倍。PDGFR的特异性抑制剂AG1295和bFGFR特异性抑制剂PD173074均显著降低RSC96-CM诱导的OPCs增殖;此外,Erk1/2特异性抑制剂U0126和JNK特异性抑制SP600125的预孵也显著降低RSC96-CM诱导的BrdU+OPCs的比例(P<0.01)。结论 RSC96-CM显著诱导OPCs的增殖,其通过RSC96分泌的PDGF-AA和bFGF激活Erk1/2和JNK信号途径而发挥作用;RSC96-CM也可以作为OPCs常规培养的扩增剂。

胰岛素样生长因子-1对共培养的神经细胞和施万细胞超微结构的影响

目的分析胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)对体外培养的神经细胞和施万细胞超微结构的影响。方法建立VSC4.1大鼠神经细胞与RSC96大鼠施万细胞共培养模型:将VSC4.1神经细胞与RSC96施万细胞共同培养,通过改善培养条件,使之共同生长。经相差显微镜观察,确定共培养的两种细胞可发生相互作用。透射电镜观察单独培养的神经细胞、施万细胞及共培养时细胞超微结构的变化。观察IGF-1的影响:实验分为共培养对照组和IGF-1组(20 ng/ml)。培养5天后,收集细胞进行扫描电镜和透射电镜观察。结果透射电镜观察单独培养的神经细胞及施万细胞均可见不同的分化状态,其超微结构各异。透射电镜结果:与对照组相比,IGF-1组中细胞表面绒毛状或指状突起明显增多且联系紧密。扫描电镜结果:对照组与IGF-1组中均可见RSC96细胞包绕轴突形成髓鞘(可称之为成髓的施万细胞)。对照组中所有的细胞表面均比较平滑,绒毛样突起不明显。IGF-1组的细胞表面不再光滑,神经细胞和未成髓的施万细胞表面呈明显的绒毛样突起,而包裹轴突的成髓施万细胞表面主要呈片层状突起。结论 IGF-1可引起VSC4.1神经细胞和RSC96施万细胞超微结构及表面形态的改变。这或许是引起其功能改变的外在表现形式。