大鼠骨髓间充质干细胞促进RSC96细胞凋亡并抑制其增殖和迁移

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)对大鼠RSC96施万细胞增殖及迁移的影响。方法全骨髓细胞贴壁法分离并提取SD大鼠BMSC,倒置显微镜观察第3代BMSC形态;流式细胞术检测细胞表面CD19、CD34、CD73、CD105;第3代BMSC经成脂成骨诱导液分别诱导3周和2周后,分别应用油红O染色和碱性磷酸酶检测BMSC的多向分化能力。应用24 mm共培养板,将第3代BMSC与RSC96细胞共培养24 h,采用MTT法和平板克隆形成实验检测RSC96细胞增殖及克隆形成能力;划痕实验及TranswellTM小室实验检测RSC96细胞的迁移能力;Western blot法检测RSC96细胞Bax和Bcl-2蛋白表达水平。结果SD大鼠第3代BMSC显微镜下呈梭形、旋涡状排列,形态大小相似;BMSC表面标志CD73、CD105高表达,造血干细胞表面标志CD34和淋巴细胞表面标志CD19低表达;BMSC经成脂诱导培养3周后,细胞有大量脂滴;经成骨诱导培养2周后,碱性磷酸酶染色呈阳性;BMSC与RSC96细胞共培养后,与对照组相比,RSC96细胞的增殖活性显著降低,克隆形成能力显著减弱、细胞迁移能力降低;共培养后RSC96细胞Bax蛋白水平升高,Bcl-2蛋白表达降低。结论 BMSC能促进RSC96细胞凋亡,抑制其增殖、迁移。

人参环氧炔醇对体外培养RSC96细胞的实验观察

目的研究人参环氧炔醇(Panaxydol,PND)对体外培养RSC96细胞神经营养因子及髓鞘蛋白表达的影响并探讨其机制。方法用含不同血清浓度的培养基培养RSC96细胞,MTT检测其增殖能力,以获取最适宜RSC96细胞体外生长的血清浓度。在适宜的血清培养基中加入PND(10μmol/L)处理RSC96细胞,以RT-PCR、western blot及ELISA检测RSC96细胞NGF和BDNF的表达。另外,预先在培养基中加入钙离子通道阻滞剂尼非地平探讨PND可能的作用途径。结果培养基血清浓度为4mmol/L时,RSC96细胞生长形态最接近于原代Schwann细胞。PND增强RSC96细胞表达和释放NGF和BDNF(P<0.05)。尼非地平的使用,则削弱了PND对RSC96细胞的作用(P<0.05)。结论在适宜的血清培养基中,体外培养的RSC96细胞可替代原代Schwann细胞,作为研究药物对它的影响及机制的细胞模型。PND增强RSC96细胞的生物活性的作用机制可能通过Ca2+信号途径介导。

大鼠骨髓间充质干细胞培养上清液对RSC96细胞生物学功能的影响

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)培养上清液对大鼠RSC96细胞生物学功能的影响。方法:体外培养、纯化SD大鼠BMSC并进行鉴定;收集第3代BMSC培养上清液(BMSC-CM);采用MTT法检测BMSC-CM对RSC96细胞增殖的影响;平板克隆实验分析BMSC-CM对RSC96单个细胞增殖的影响;划痕实验和TranswellTM小室实验分析BMSC-CM对RSC96细胞迁移的作用,Western blot法检测BMSC-CM对RSC96细胞Bax和Bcl-2蛋白表达的改变。结果:SD大鼠第3代BMSC形态呈长梭形,旋涡样生长;成骨染色为阳性结果;成脂诱导后有脂滴出现;BMSC-CM作用后抑制RSC96细胞的增殖和迁移能力,且作用后的RSC96细胞Bax蛋白水平升高,Bcl-2蛋白表达降低。结论:BMSC-CM促进RSC96细胞凋亡,抑制其增殖和迁移。

糖痛方对高糖诱导RSC96细胞凋亡与增殖的影响

目的筛选中药糖痛方的体外作用最佳剂量。方法采用含5~125 mmol/L不同浓度葡萄糖的DMEM培养基培养RSC96细胞,检测不同浓度(0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、5.0 mg/m L)糖痛方高糖培养RSC96细胞增殖。采用含100、125 mmol/L葡萄糖培养基培养RSC96细胞72 h后,AV/PI凋亡试剂盒和流式细胞仪检测细胞凋亡,计算细胞凋亡率;CCK-8法检测不同时点RSC96细胞增殖。结果 RSC96细胞在100、125 mmol/L葡萄糖培养基培养下发生凋亡,凋亡率分别为(7.46±0.96)%、(16.53±1.01)%,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);不同浓度糖痛方可明显改善高糖对RSC96细胞增殖的抑制作用,24 h起效浓度为0.25 mg/m L;0.5、1.0、1.5 mg/m L 3个剂量糖痛方可明显抑制高糖诱导的细胞凋亡,与125 mmol/L高糖组比较,细胞凋亡率显著降低(P<0.05,P<0.01)。结论在3个不同剂量中,1.5 mg/m L糖痛方抑制细胞凋亡作用最佳。

不同状态巨噬细胞对RSC96细胞NGF及Laminin表达的影响

目的研究不同活化状态的巨噬细胞与雪旺细胞株(RSC96)共培养条件下雪旺细胞神经营养因子(NGF)及层粘连蛋白(Laminin,LN)的表达情况。方法利用Transwell建立大鼠腹膜腔巨噬细胞和RSC96细胞的共培养体系,分别将RSC96细胞与未激活巨噬细胞、激活态巨噬细胞共培养;采用Real-time PCR检测、Western blot分析、以及酶联ELISA测定等研究手段,比较各组NGF及LN的表达差异。结果与未激活巨噬细胞共培养组RSC96细胞NGF表达增强,激活态组表达明显增强;而各组LN表达差异不明显。结论巨噬细胞对RSC96细胞NGF表达有促进作用,受其活化状态的影响,激活状态的巨噬细胞的促进作用更明显;对影响RSC96细胞迁移功能的LN的表达作用不明显,无统计学意义,有待进一步研究。

不同空间排列静电纺丝对RSC96细胞表达NGF及Laminin的研究

目的研究不同空间排列静电纺丝对雪旺细胞株(RSC96)神经营养因子(NGF)及层粘连蛋白(Laminin,LN)的表达情况。方法根据培养条件不同分3组,即平行静电纺丝培养组(A)、随机静电纺丝培养组(B)及膜上培养组(C)培养3天后用Trizol法提取细胞总RNA,用Oligo(d T)逆转录酶得到c DNA。经特定引物PCR扩增,取相同量的逆转录产物进行q PCR反应,检测NGF及LN的表达差异。结果平行静电纺丝组,随机静电纺丝组,膜上培养组上NGF基因表达依次递增,各组间差异明显;LN基因的表达依次递减,各组间差异明显。结论不同空间排列的静电纺丝对RSC96细胞表达NGF和Laminin影响不同,平行的静电纺丝有促进细胞向成熟分化的可能。

不同剂量枸杞多糖对高糖诱导的RSC96 雪旺细胞增殖的影响比较

目的研究不同剂量枸杞多糖(LBP)对高糖诱导的RSC96雪旺细胞增殖的影响。方法分别采用不同葡萄糖浓度(12.5、25、50、100 mmol/L)的杜氏改良Eagle培养基(DMEM)培养大鼠RSC9648h,用四唑盐比色法(MTT)检测不同葡萄糖浓度对RSC96细胞活力的影响。确定下一步实验的正常对照组及高糖组的葡萄糖浓度,在此基础上给予不同剂量(100、200、400、800μg/mL)LBP培养48 h,用MTT法检测不同剂量LBP对RSC96细胞增殖的影响。结果在不同浓度的葡萄糖中,25 mmol/L葡萄糖浓度组RSC96细胞活力最高,100 mmol/L组RSC96细胞活力下降最为显著;与高糖组比较,200、400、800μg/mL的LBP均有促进RSC96细胞增殖的作用,LBP为400μg/mL作用最明显(P<0.05)。结论LBP为400μg/mL对高糖诱导的RSC96细胞增殖作用最佳。

敲除L-periaxin基因的大鼠RSC96细胞系的建立

轴周蛋白(Periaxin)是外周神经系统非致密性髓鞘中特异表达的蛋白,编码Periaxin的基因经由选择性剪接产生两种蛋白异构体L-periaxin和S-periaxin,对髓鞘形成的初始化有重要作用。至今在Periaxin基因上已发现有18种不同的位点突变导致外周脱髓鞘神经疾病腓骨肌萎缩症4F亚型(CMT4F)的发生。利用转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)靶向基因敲除技术对大鼠RSC96细胞的periaxin基因进行敲除,根据TALENs设计原则,确定L-periaxin基因的敲除靶点在其编码NLS结构域部分,设计相应的TALEN左臂与右臂的识别序列,构建含上述识别序列的L-periaxin基因敲除载体TALEN-L和TALEN-R,并将其转入RSC96细胞,经嘌呤霉素药物筛选,获得L-periaxin基因敲除细胞株,经测序确认大鼠RSC96细胞中的基因组中L-periaxin基因区段已被敲除,成功构建了L-periaxin基因敲除细胞模型。计算L-periaxin基因敲除载体的突变率为21.6%。Western blotting实验证明,在RSC96细胞中只能检测到S-periaxin蛋白的表达。通过流式细胞术及MTT实验检测基因敲除细胞的细胞周期和生长速度,发现敲除L-periaxin基因的细胞生长速度缓慢,G1期细胞增多,S期细胞减少。

慢病毒介导PTEN基因表达降低的RSC96施万细胞系模型建立

背景:第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10,PTEN)是一种抑癌基因,可以通过调节PI3K/AKT/mTOR等信号通路在细胞增殖凋亡中起到作用。最新研究证实,PTEN可在脊髓损伤、周围神经缺损等骨科疾病中起到重要作用,而相关的细胞模型却鲜有报道。目的:构建携载大鼠PTEN基因的慢病毒载体,建立PTEN基因表达降低的RSC96施万细胞系模型。方法:设计大鼠PTEN基因RNAi序列,将其构建并包装成可转染的慢病毒,转染RSC96施万细胞后,通过RT-PCR检测RSC96施万细胞中PTEN基因的表达情况。结果:成功构建病毒滴度为8E+8TU/ml的PTEN-RNAi慢病毒,将其转染RSC9施万细胞后,细胞中PTEN基因的相对表达量为0.2322±0.0187,敲减效率为76.78%,与阴性对照慢病毒转染组(1.0044±0.0022)相比,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:成功建立PTEN基因表达降低的RSC96施万细胞系模型,为研究PTEN基因相关的创伤骨科、脊柱外科、手外科疾病提供实验基础。

葛根素对高糖诱导的RSC96细胞凋亡和自噬相关蛋白的影响

目的探讨葛根素对高糖诱导的RSC96细胞损伤的保护作用是否与自噬调节有关。方法建立体外RSC96细胞高糖损伤模型,根据Westernblot检测CleavedCaspase-3蛋白判断造模成功与否。通过CCK-8法确定葛根素干预浓度。免疫细胞化学法检测Beclin-1蛋白的表达;Western blot检测Cleaved Caspase-3、LC3-Ⅱ、p62、Beclin-1蛋白的表达。结果与高糖组相比,葛根素预处理可显著提高高糖诱导后RSC96细胞的存活率(P<0.05),抑制Cleaved Caspase-3蛋白的表达(P<0.05),抑制LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白的表达(P<0.05),增强p62蛋白的表达(P<0.05)。结论葛根素可改善由高糖诱导的RSC96细胞损伤,其机制可能与其抑制LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达、提高p62蛋白表达有关。[营养学报,2020,42(3):281-286]

大鼠雪旺细胞系RSC96条件培养液对少突胶质前体细胞的体外增殖作用

目的观察大鼠雪旺细胞系RSC96细胞条件培养液(RSC96-CM)对少突胶质前体细胞(OPCs)增殖的影响,探讨其作用机制。方法应用免疫粘附法从胚胎15d的SD大鼠脊髓分离OPCs,应用Brd U掺入实验检测OPCs的增殖,应用RT-PCR技术检测PDGF-AA和bFGF在RSC96细胞的表达,应用ELISA技术检测RSC96-CM中PDGF-AA和bFGF蛋白的浓度,以特异性抑制剂阻断观察PDGF-AA和bFGF在RSC96-CM诱导OPCs增殖中的作用,以特异性抑制剂观察ERK和JNK信号途径在RSC96-CM诱导OPCs增殖中的作用。结果不同浓度的RSC96-CM培养的OPCs,其BrdU+细胞的比例与对照组相比均显著增加(P<0.05),其中,在含50%RSC96-CM的培养液中培养的OPCs的BrdU+细胞的比例达高峰。RT-PCR证实RSC96细胞显著表达PDGF-AA和bFGF的mRNAs,ELISA结果发现,RSC96-CM中PDGF-AA和bFGF的蛋白浓度分别是我们前期报道的B104CM中PDGF-AA和bFGF的蛋白水平的0.87倍和0.92倍。PDGFR的特异性抑制剂AG1295和bFGFR特异性抑制剂PD173074均显著降低RSC96-CM诱导的OPCs增殖;此外,Erk1/2特异性抑制剂U0126和JNK特异性抑制SP600125的预孵也显著降低RSC96-CM诱导的BrdU+OPCs的比例(P<0.01)。结论 RSC96-CM显著诱导OPCs的增殖,其通过RSC96分泌的PDGF-AA和bFGF激活Erk1/2和JNK信号途径而发挥作用;RSC96-CM也可以作为OPCs常规培养的扩增剂。

Wnt5a基因慢病毒的构建与RSC96雪旺细胞的感染研究

目的 构建大鼠Wnt5a基因慢病毒并感染RSC96雪旺细胞,观察慢病毒感染情况及Wnt5a表达情况。方法 设计大鼠Wnt5a基因特异性RNAi序列,构建并包装成可感染细胞的慢病毒,感染RSC96雪旺细胞后通过Celigo观察细胞中荧光表达,并通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT-q PCR)检测细胞中Wnt5am RNA的表达情况。结果 构建的Wnt5a基因慢病毒在感染RSC96雪旺细胞后可表达绿色荧光,细胞中Wnt5am RNA的平均表达量为0.206±0.056。结论 Wnt5a基因慢病毒构建成功,可为研究Wnt5a调控的周围神经损伤修复时雪旺细胞功能的相关研究提供便利。

消渴痹通胶囊对高糖诱导的RSC96雪旺细胞损伤的保护作用及其机制

目的:探讨消渴痹通胶囊对高糖诱导的RSC96雪旺细胞损伤的保护作用及其机制。方法:将RSC96雪旺细胞复苏及培养,采用免疫细胞化学法检测RSC96细胞的特异性蛋白S-100的表达情况,进行雪旺细胞鉴定;以高糖诱导造成RSC96雪旺细胞损伤,梯度高糖浓度比较,确定后续研究所采用的高糖浓度;通过MTT法检测消渴痹痛胶囊对高糖诱导的RSC96雪旺细胞的保护作用,采用免疫组织化学检测NGF蛋白水平和蛋白质印迹法检测P-AKT/AKT通路及caspase-3的蛋白水平。结果:1)RSC96雪旺细胞存活率随着消渴痹痛胶囊药物浓度的升高而增加(P<0.05)。2)NGF蛋白表达量随着消渴痹痛胶囊药物浓度增加(P<0.05)。3)p-AKT/t-AKT和caspase-3蛋白表达下调,且随着消渴痹痛胶囊药物浓度增加而减少(P<0.05)。结论:消渴痹痛胶囊可能通过抑制PI3K/AKT信号转导通路的激活,从而下调caspase-3蛋白的表达水平,抑制雪旺细胞的细胞凋亡,同时又上调NGF的表达水平,为周围神经的髓鞘细胞提供神经营养物质,从而对高糖诱导的RSC96雪旺细胞起到保护作用。

永生化施万细胞和神经细胞建立体外共培养模型及神经细胞对髓鞘特异性基因表达的影响

目的通过体外共培养永生化施万细胞株RSC96细胞和神经细胞株VSC4.1细胞,建立施万-神经细胞共培养模型,观察髓鞘化过程中神经细胞对细胞增殖和髓鞘特异性基因MBP、PMP22表达的影响。方法建立施万细胞和神经细胞共培养模型:本研究选用RSC96和VSC4.1细胞进行共同培养。实验分为3组:单独培养的RSC96细胞组(RSC96组)、VSC4.1细胞组(VSC4.1组)、共培养组。免疫荧光染色对细胞进行鉴定。经光镜及电子显微镜观察,确定共培养的两种细胞可发生相互作用。利用MTT法检测细胞增殖情况。RT-PCR方法检测髓鞘特异性基因MBP、PMP22的表达。结果 RSC96细胞包绕VSC4.1细胞的轴突形成髓鞘。MTT示:RSC96细胞增殖速度明显快于VSC4.1细胞。但当两种细胞共培养时,细胞的增殖速度与单独的RSC96细胞相比,明显下降。在单独培养的RSC96细胞中,PMP22基因的表达有先增高后降低的现象。在共培养模型中,PMP22基因的表达是逐渐增高的。在前2d的表达量低于单独培养的RSC96细胞。单独培养的RSC96细胞及共培养组细胞在前3d均无MBP的表达。结论永生化施万细胞株RSC96细胞和神经细胞株VSC4.1细胞可以建立施万-神经细胞共培养模型。神经细胞可以调控施万细胞的增殖速度与髓鞘特异性基因的表达模式。

胰岛素样生长因子-1对共培养的神经细胞和施万细胞超微结构的影响

目的分析胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)对体外培养的神经细胞和施万细胞超微结构的影响。方法建立VSC4.1大鼠神经细胞与RSC96大鼠施万细胞共培养模型:将VSC4.1神经细胞与RSC96施万细胞共同培养,通过改善培养条件,使之共同生长。经相差显微镜观察,确定共培养的两种细胞可发生相互作用。透射电镜观察单独培养的神经细胞、施万细胞及共培养时细胞超微结构的变化。观察IGF-1的影响:实验分为共培养对照组和IGF-1组(20 ng/ml)。培养5天后,收集细胞进行扫描电镜和透射电镜观察。结果透射电镜观察单独培养的神经细胞及施万细胞均可见不同的分化状态,其超微结构各异。透射电镜结果:与对照组相比,IGF-1组中细胞表面绒毛状或指状突起明显增多且联系紧密。扫描电镜结果:对照组与IGF-1组中均可见RSC96细胞包绕轴突形成髓鞘(可称之为成髓的施万细胞)。对照组中所有的细胞表面均比较平滑,绒毛样突起不明显。IGF-1组的细胞表面不再光滑,神经细胞和未成髓的施万细胞表面呈明显的绒毛样突起,而包裹轴突的成髓施万细胞表面主要呈片层状突起。结论 IGF-1可引起VSC4.1神经细胞和RSC96施万细胞超微结构及表面形态的改变。这或许是引起其功能改变的外在表现形式。

富血小板凝胶上清对施万细胞活性的影响

目的:观察富血小板凝胶上清(PRP-r)对大鼠施万细胞(SCs)增殖和分泌神经再生相关活性物质的影响。方法:实验分为PRP-r组和control组。利用大鼠腹主动脉血制备富血小板血浆(PRP),用CaCl激活PRP得到PRP-r。CCK-8检测RSC96的增殖能力,ELISA检测RSC96培养上清中神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)水平,Western Blot检测RSC96细胞中神经细胞黏附分子(NCAM)、p75神经营养因子受体(p75NTR)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和S100钙结合蛋白B(S100B)的表达。结果:RSC96的增殖能力在PRP-r作用下显著提高,与对照组相比,培养上清中NGF、BDNF、GDNF水平增加,细胞中NCAM、p75NTR、GFAP、S100B蛋白表达上调。结论:PRP-r可以促进RSC96细胞增殖,促进神经营养因子分泌及相关蛋白的表达。

高糖对RSC96雪旺细胞的损伤机制

目的观察高浓度葡萄糖对雪旺细胞增殖及凋亡的影响并初步探讨其可能机制。方法将体外培养的RSC96雪旺细胞分为正常对照组(25 mmol/L)和高糖组(100 mmol/L),分别应用M TT及流式细胞技术观察高糖对RSC96细胞增殖及细胞凋亡的影响。应用Western blotting观察高糖对Lipin-1、神经生长因子(NGF)蛋白表达的影响,并应用免疫荧光技术进一步验证在高糖刺激下Lipin-1蛋白表达变化。结果与正常对照组比较,高糖组对RSC96细胞增殖具有显著抑制作用(P<0.05)。与正常对照组晚期凋亡率(1.56±0.72)%相比,高糖组细胞晚期凋亡率(12.40±0.65)%明显增加。高糖显著降低Lipin-1和NGF蛋白表达(P<0.05)。结论高糖显著抑制雪旺细胞增殖并促进细胞凋亡;同时显著降低了Lipin-1和NGF的蛋白表达。提示高糖对神经细胞的损伤作用可能存在多种机制。

糖络宁对高血糖大鼠血清外泌体中miR-322和IRE1α-RIDD表达的影响

目的探讨糖络宁通过高血糖大鼠血清外泌体抑制细胞凋亡的机制。方法SD大鼠分为对照组、模型组和糖络宁(10.9 g/kg)组。除对照组外,其余组大鼠ip链脲佐菌素诱导高血糖大鼠模型。给药组大鼠ig药物,对照组和模型组大鼠ig等体积蒸馏水,1次/d,连续12周。给药结束后,收集大鼠血清,采用差异离心法提取血清外泌体,使用大鼠雪旺细胞RSC96内化外泌体,将RSC96细胞分别与对照组、模型组、糖络宁组的大鼠血清外泌体共培养24h。采用CCK-8法测定RSC96细胞活力;采用Western blotting法测定RSC96细胞中肌醇酶1α(inositol-requiring enzyme 1α,IRE1α)、磷酸化IRE1α(p-IRE1α)和蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase A6,PDIA6)蛋白表达;采用qRT-PCR法测定外泌体中miR-322 mRNA表达,RSC96细胞中miR-322、IRE1α及IRE1依赖性衰解(IRE1-dependent decay,RIDD)底物CD59、蛋白激酶D2(protein kinase D2,PKD2)、A类清道夫受体(scavenger receptor class A,SCARA)、蛋白水解酶D(peptidase D,PEPD)m RNA表达。结果与对照组比较,模型组血清外泌体数量显著增加(<0.01),外泌体及RSC96细胞中miR-322m RNA水平显著降低(<0.05、0.01),RSC96细胞活力显著降低(<0.01),RSC96细胞IRE1α蛋白和mRNA表达水平显著升高(<0.01),PDIA6蛋白表达水平显著降低(<0.01),RIDD底物CD59、PKD2、SCARA和PEPD m RNA表达水平显著降低(<0.01);与模型组比较,糖络宁组血清外泌体数量明显降低(<0.05),外泌体及RSC96细胞中mi R-322 m RNA水平显著升高(<0.05、0.01),RSC96细胞活力显著增加(<0.05),RSC96细胞IRE1α蛋白和mRNA表达水平显著降低(<0.05),PDIA6蛋白表达水平显著升高(<0.01),RIDD底物CD59、PKD2、SCARA和PEPD mRNA表达水平显著升高(<0.05、0.01)。结论糖络宁通过增加高血糖大鼠血清外泌体中miR-322 mRNA水平,从而抑制IRE1α-RIDD诱导的细胞凋亡。