Rspo1-EGFP重组腺相关病毒载体的构建

本文通过构建携带Rspo1-EGFP融合基因的重组腺相关病毒载体,包装出含有目标基因的重组腺相关病毒。首先利用PCR从cDNA文库中把Rspo1基因扩增出来,插入到pcDNA6-EGFP中EGFP的上游形成融合基因Rspo1-EGFP。采用AAVHelper-free包装系统,将融合基因用PCR方法从质粒pcDNA6-Rspo1-EGFP上扩增出来,亚克隆到AAV表达质粒pAAV-MCS多克隆位点中,构建出重组质粒pAAV-Rspo1-EGFP。重组质粒与包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper磷酸钙法共转染AAV-293细胞制备重组病毒rAAV-Rspo1-EGFP。重组病毒感染AAV-HT1080细胞,荧光显微镜检测病毒介导的目标基因表达,流式细胞技术测定病毒滴度。结果:酶切鉴定和测序确定重组病毒载体pAAV-Rspo1-EGFP构建成功。病毒感染的细胞中检测到绿色荧光,表明重组病毒包装成功并介导融合基因在宿主细胞里表达,病毒滴度达107VP/mL。本研究成功包装出具有侵染性的重组腺相关病毒AAV-Rspo1-EGFP,为今后利用腺相关病毒载体进行Rspo1相关的体内体外研究提供了实验基础。

RSPO1蛋白的纯化及其免疫淘选

目的通过噬菌体展示技术,从免疫骆驼的外周淋巴血液中获得与RSPO1结合的纳米抗体,纯化后构建RSPO1噬菌体展示文库,并进行免疫淘选。方法将RSPO1基因与pCMV-Fc载体连接后,构建质粒RSPO1-pCMVFc,瞬时转染HEK-293F细胞,表达RSPO1蛋白;经Protein A凝胶柱、HiLoad^(TM)16/600 Superdex^(TM)200pg柱、Superdex^(TM)24 Increase10/300 GL柱依次纯化RSPO1蛋白后,免疫骆驼,收集外周血并分离淋巴细胞;提取细胞RNA,反转录合成cDNA,通过2步巣式PCR扩增VHH片段,克隆至pMECS噬菌粒载体中,构建噬菌体展示文库,经2轮淘选使与RSPO1结合的噬菌体得到聚集后,进行ELISA鉴定并测序。结果质粒RSPO1-pCMV-Fc经PCR及测序鉴定证明构建正确。表达的RSPO1蛋白相对分子质量约172000,纯度约为70%;RSPO1噬菌体展示文库库容为1.2×10^(8)cfu,经2轮淘选使噬菌体富集度达到12;共获得19个纳米抗体序列。结论获得了多样性良好的纳米抗体序列,为了解与RSPO1相关的Wnt信号通路提供了可能。