建立检测猕猴三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2的mRNA相对表达水平的RT-qPCR方法

目的本研究旨在建立一种实时荧光定量PCR方法,用于检测猕猴三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2(adenosine triphosphate-binding cassette transporter protein G2,ABCG2)mRNA的基因转录水平。方法使用NCBI上GenBank数据库猕猴(Macaca mulatta)的ABCG2核苷酸序列号NM_001032919.1及内参GAPDH核苷酸序列号NM_001195426.1,借助Primer premier 5.0软件设计PCR引物。提取猕猴新鲜肾组织的总RNA,并反转录合成cDNA。接着,利用PCR引物进行实时荧光定量PCR扩增,并根据反应体系中荧光的变化情况定量分析ABCG2的mRNA相对表达水平。结果PCR产物测序结果显示,扩增的ABCG2和GAPDH核苷酸序列与NCBI上猕猴的序列同源性分别为90.91%和91.14%。ABCG2和GAPDH的扩增效率均达到80%~120%,实时荧光定量PCR标准曲线的熔解曲线为单峰,R2接近1。结论本研究建立的检测猕猴ABCG2 mRNA实时荧光定量检测方法,为研究高尿酸血症的发病机制以及新药开发奠定基础。

PEDV、PoRVA和PDCoV TaqMan三重RT-qPCR检测方法的建立与初步应用

旨在建立一种可快速同时检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、猪A群轮状病毒(porcine rotavirus type A, PoRVA)和猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)三重荧光定量PCR方法。针对PEDV-N、PoRVA-VP6和PDCoV-M基因设计了引物和探针,条件优化后进行性能评估,并与商品化试剂盒检测对比。结果显示:本研究建立的三重RT-qPCR方法具有良好特异性,对PRRSV、PCV_2和PRV等阳性核酸不发生扩增;具有较高的敏感性,PEDV、PoRVA和PDCoV的最低检测限均达1 copies·μL^(-1);重复性良好,组内和组间变异系数均小于1%;样本适应性广,检测不同样本类型时,变异系数均小于1%。与商品化试剂盒对比,本研究建立的方法PEDV和PoRVA的检测符合率为92.5%和97.5%,并对PDCoV的检测范围更广,对其变异毒株仍有较好的检测效果。本研究建立的检测方法具有特异性好、敏感性高、稳定性强和样本适应性广等优势,为临床腹泻样本提供了一种好的检测方法。

用RT-qPCR方法评价4个不同猪品种骨骼肌候选内参基因

【目的】寻找合适的规范化策略研究猪骨骼肌相关基因。【方法】筛选TATA结合蛋白(TBP)、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)、核糖体蛋白L4(RPL4)、肽基脯氨酸异构酶A(PPIA)、β-2微球蛋白(B2M)、酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶活化蛋白(YWHAZ)、β-肌动蛋白(ACTB)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)8个候选内参基因,选取国外引进的长白、约克与杜洛克公猪,进行三元杂交生产的商品猪(DLY),长白、约克猪进行二元杂交的商品猪(LY),成华猪和藏猪共4个品种进行基因表达正常化评价。采用geNorm、NormFinder和BestKeeper3种常用算法评估候选内参基因的稳定性。将3种常用算法的结果进行综合排名。【结果】8个候选内参基因在不同猪种中表现出较高的表达稳定性,但表达循环阈值不同。【结论】运用3种不同的评估算法可以筛选出相似的候选内参基因,该结果可为猪骨骼肌基因表达RT-qPCR分析内参基因的选择提供参考。

一心维纳斯蝴蝶兰花香物质合成相关基因RT-qPCR内参基因筛选

一心维纳斯蝴蝶兰(PhalaenopsisI-HsinVenus)花型优雅、花期持久、花香馥郁,是优良的香花品种,具有较高的园林观赏价值和经济价值。为筛选适用于一心维纳斯蝴蝶兰花香物质合成相关基因表达分析的内参基因,本研究以一心维纳斯蝴蝶兰不同花期(中蕾期、初开期、盛开前期、盛开中期、盛开后期、衰败期)的转录组数据为基础,选取了ACT1、ACT2、ACT3、GAPDH、EF1α、TUA、TUB和Ubi共8个管家基因作为候选内参基因,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测候选内参基因在花朵不同发育时期的表达情况,并利用geNorm、NormFinder、BestKeeper三个内参基因稳定性分析软件对候选内参基因进行分析。综合分析结果表明,ACT1的稳定性最高,可作为一心维纳斯蝴蝶兰相关基因表达分析的最适内参基因。

基于转录组测序和RT-qPCR技术的烟草糖酯合成基因挖掘

为挖掘调控烟草糖酯合成的功能基因,采用转录组测序对烟草腺毛细胞和叶细胞的差异表达基因及其功能进行分析,并利用RT-qPCR对分析结果进行验证。结果表明:共获得11962个腺毛细胞和叶细胞的差异表达基因,其中5145个上调表达基因,6817个下调表达基因;上调表达基因主要包括生物学进程(2265个)、分子功能(1169个)、细胞成分(363个)3大类,可将基因序列定位到122条代谢通路中,其中与糖酯合成相关的糖酵解/糖异生、淀粉和蔗糖代谢、苯丙烷类生物合成被高度富集,腺毛细胞中酰基糖通路显著上调,有12个基因在功能上与酰基转移酶有关;在腺毛细胞中,分析得到的12个基因中有11个基因的表达量都高于叶细胞,其中gene63826、gene16194和gene37511表达分别上调195.79倍、166.23倍和132.65倍。上述11个基因可能参与调控腺毛细胞合成糖酯,为下一步验证基因功能提供依据。

齿兰环斑病毒RT-qPCR检测方法的建立

【目的】针对齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)建立快速、有效检测方法,对于保障兰花规模化生产有重要意义。【方法】以齿兰环斑病毒为材料,根据NCBI上已登录的齿兰环斑病毒外壳蛋白(coat protein,cp)基因序列分析其序列保守区,使用Primer Premier 5.0设计反转录荧光定量PCR引物及TaqMan荧光探针,建立检测齿兰环斑病毒的一步法RT-qPCR。构建齿兰环斑病毒cp基因克隆质粒,并以该质粒作为标准品进行荧光定量PCR标准曲线测定;以齿兰环斑病毒、建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的病毒RNA为模板进行一步法RT-qPCR特异性检测;以10倍倍比稀释的cp基因质粒为模板进行灵敏性检测;用该法对大田18个兰花样品进行齿兰环斑病毒感染情况监测。【结果】齿兰环斑病毒一步法RT-qPCR检测法仅检出齿兰环斑病毒阳性模板,其余模板检测结果为阴性,说明检测方法具有特异性;该方法能够检测到的齿兰环斑病毒cp基因最低拷贝数为130;大田兰花样品感染齿兰环斑病毒的检出率为100%。【结论】一步法RT-qPCR是一种特异性强、灵敏度高,且适合监测实际生产过程中兰花感染齿兰环斑病毒情况的检测方法。

油菜蜂花粉总RNA(含小RNA)大量提取及RT-qPCR检测

大量提取含小RNA的油菜蜂花粉总RNA,为研究油菜蜂花粉所含外源性miRNA在动物和人体内发挥的生理和病理功能研究奠定基础。改良苯酚-氯仿法大量提取油菜蜂花粉总RNA,Nanodrop 2000检测浓度和质量,琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性;所得的总RNA经过RT-qPCR扩增。提取的总RNA260/280为2.11,产量高于1‰。电泳条带清晰,完整性良好。可扩增出油菜基因组中的miR-159和miR-166a,且可进行丰度差异比较。本方法能大量提取包括油菜蜂花粉在内的植物RNA(含小RNA),为中草药和其他植物来源天然产物中功能性miRNA在动物和人体内发挥的生物学功能研究奠定基础。

不同温度胁迫下瓜实蝇RT-qPCR内参基因筛选

特定条件下稳定表达内参基因的筛选是利用实时荧光定量PCR研究基因表达的关键基础。本研究以不同温度胁迫后后的瓜实蝇Bactrocera cucurbitae 2龄幼虫、雌虫和雄虫为试验材料,对其9个候选内参基因表达进行了RT-qPCR分析,并利用ge Norm、Norm Finder、Best Keeper和Ref Finder 4款软件分析各候选内参基因在3种虫态中的表达稳定性。结果表明,18S rRNA基因Ct值(≤5)较小,不适合作为内参基因使用,其它8个内参基因在瓜实蝇2龄幼虫中的稳定性排序为Rp L32> RPS13> TBP>β-tubulin> TUBE> Actin2> G6PDH> Actin3。雌虫表达稳定性由高到低为:RPS13> Rp L32>β-tubulin> TBP> TUBE> Actin2> Actin3> G6PDH。雄虫表达稳定性为Rp L32> RPS13>β-tubulin> TBP> TUBE> Actin2> G6PDH> Actin3。ge Norm软件分析各个虫态内参基因最佳组合均为2个。RPS13和Rp L32组合可作为瓜实蝇不同虫态下温度胁迫后的内参基因。

RT-qPCR法定量检测乳腺癌FFPE样本ER、PR、HER2、Ki-67表达的初步分析

目的初步探索实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)法与免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)法检测乳腺癌福尔马林固定石蜡包埋(formalin fixed and paraffin embedded,FFPE)样本ER、PR、HER2、Ki-67的一致性及评估RT-qPCR法的应用前景。方法纳入术前穿刺诊断为乳腺浸润性导管癌、临床病理资料完整、肿瘤成分大于20%的FFPE样本73例。RT-qPCR采用人乳腺癌分子分型定量检测试剂盒(MammaTyper)检测。结果 RT-qPCR法与IHC法一致率ER、PR、HER2、Ki-67分别为90. 41%、87. 67%、84. 93%、94. 52%;一致性分析Kappa值分别为0. 777 5、0. 752 2、0. 701 2、0. 800 8。结论 RT-qPCR法与IHC法检测ER、PR、HER2、Ki-67具有较高的一致性;但在检测ER、PR和HER2时应注意导管原位癌和残存乳腺组织的可能影响,并进一步扩大检测样本量,不断优化RT-qPCR的截断值。与ER、PR和HER2相比,RT-qPCR法检测Ki-67可能具有更好的应用前景。

大蒲莲猪不同发育阶段组织RT-qPCR分析中适宜内参基因筛选

利用适宜数量且表达稳定的内参基因对目的基因的表达量进行标准化是获得准确、可靠RT-qPCR数据的重要条件。以不同日龄大蒲莲猪8种组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠组织、肌肉、血液)为试验材料,使用ge Norm、Norm Find软件对8个常用候选内参基因(ACTB、B2M、GAPDH、RPL4、SDHA、TBP、YWHAZ、PPIA)的表达稳定性进行分析,筛选适宜内参基因及其组合。ge Norm、Norm Find软件联合分析结果表明,不同日龄大蒲莲猪心脏中表达最稳定的内参基因为TBP、PPIA和YWHAZ,肝脏、肾脏、肠组织和肌肉中最稳定的内参基因均为TBP和PPIA,脾脏中表达最稳定内参基因为TBP和RPL4,肺脏中表达最稳定内参基因为TBP、RPL4、PPIA和ACTB,血液中表达最稳定内参基因为ACTB、YWHAZ和GAPDH。由于大蒲莲猪8种体组织中最适宜内参基因组合和数量不同,因此内参基因筛选是进行RT-qPCR数据分析的必要条件。结果可为研究大蒲莲猪目的基因表达时适宜内参基因的选择提供帮助。

同步检测PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3的三重RT-qPCR方法的初步建立

目前我国菠萝产区已相继报道3种菠萝凋萎相关病毒(PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3)。通过建立这3种菠萝凋萎相关病毒实时荧光定量RT-PCR(RT-q PCR)同步定量检测方法,为菠萝凋萎病毒的定性定量研究提供技术手段。根据这3种菠萝凋萎相关病毒的外壳蛋白基因序列分别设计特异性引物和Taq Man水解探针,在优化PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重RT-q PCR反应体系后,以PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3 CP基因目的片段的重组质粒为标准品绘制标准曲线,初步建立了PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重RT-q PCR检测方法。其中PMWaV-1标准曲线为y=-3.283logx+39.02,其扩增效率达101.7%,线性相关系数R2=0.999;PMWaV-2标准曲线为y=-3.393logx+37.53,其扩增效率为97.1%,线性相关系数R2=0.998;PMWaV-3标准曲线为y=-3.171 logx+38.48,其扩增效率为106.7%,线性相关系数R2=0.996;这表明3种菠萝凋萎相关病毒质粒标准品在同一反应体系中可稳定扩增,且线性关系表现良好,可用于后续试验。灵敏度试验数据表明,该方法对PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3的最低检测线分别为99,98,868拷贝;重复性试验表明PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重RT-q PCR扩增曲线的标准差小于0.267,变异系数小于1.44%。这表明建立的三重RT-q PCR检测方法可快速、准确、稳定地定量检测PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3等3种病毒,为PMWaV的定性定量研究和复合侵染机制的探索提供了技术基础。

三阴性乳腺癌IL-17基因Real-time RT-qPCR检测法的建立与应用

目的:建立Real-time RT-qPCR(实时荧光定量RT-PCR)检测IL-17的方法,应用该方法检测三阴性乳腺癌(three negative breast cancer,TNBC)组织IL-17 mRNA的水平。方法:以TNBC组织为实验组,纤维腺瘤旁正常乳腺组织为对照组,并经HE染色病理分析确诊,Trizol法提取总RNA并反转录为c DNA。选β-actin作为内参,建立SYBR GreenⅠReal-time RT-qPCR检测法。利用该方法检测两组IL-17和β-actin的初始模板量,IL-17/β-actin计算IL-17 mRNA的相对表达量。结果:IL-17扩增效率为98.6%,相关系数0.997,溶解曲线为特异单峰,变异系数小于2.0%,IL-17 mRNA在TNBC组[(0.64±0.12)×10^(-2)]的相对表达高于正常对照组[(0.43±0.07)×10^(-2)],差异有统计学意义(P=0.025)。结论:成功建立了人源IL-17的Real-time RT-qPCR检测方法,TNBC组IL-17的高表达提示其可能与TNBC有一定关系,为研究TNBC的发病机制奠定了理论基础。

均匀设计在候选内参基因RT-qPCR实验条件优化中的应用

目的探讨均匀设计在候选内参基因RT-qPCR实验条件优化中的应用,有助于后期实验筛选不同状态下THP-1细胞的稳定内参基因。方法以THP-1细胞cDNA为模板,cDNA模板量、引物浓度和退火温度3个因素为影响因素,应用均匀设计3因素8水平,探索影响候选内参基因RT-qPCR的扩增条件,检测不同实验条件下的扩增效果,在最优扩增条件下建立候选内参基因定量扩增的相对标准曲线,并检测扩增效率。结果通过均匀设计,完成对cDNA模板量、引物浓度和退火温度3因素8水平的实验条件优化,建立候选内参基因RT-qPCR检测的最佳组合为cDNA模板量0.5μg、引物浓度200μmol/L、退火温度55℃。结论本实验选用均匀设计优化RT-qPCR实验条件,筛选出THP-1细胞候选内参基因RT-qPCR的最优实验条件。均匀设计适合于本实验研究多因素多水平试验条件的配比。

草珊瑚不同光质条件下RT-qPCR内参基因筛选与验证

为分析不同光质对草珊瑚目的基因表达量的影响,筛选出稳定表达的内参基因,根据草珊瑚转录组数据,选择激动蛋白(Actin)、β-微管蛋白(TUB)、SAND家族蛋白(SAND)、泛素蛋白(UBQ)、网格蛋白适配器复合物(CAC)等10个基因作为候选内参基因。以不同光质条件下草珊瑚幼苗的根、茎和叶组织为材料,利用实时荧光PCR技术,并结合geNorm、NormFinder、BestKeeper、The comparative delta-Ct和RefFinder等软件分析内参基因的表达稳定性,从而筛选出最佳内参基因,并通过对草珊瑚叶片碳代谢中7个关键酶基因的表达量分析,验证内参基因的准确性。结果表明,内参基因CAC在不同光质条件下草珊瑚幼苗的根、茎和叶组织中表达最稳定。在不同光质条件下,草珊瑚叶片碳代谢中7个关键酶基因相对表达量的变化趋势与转录组的相对一致。本研究筛选的最佳内参基因CAC可为后续准确分析草珊瑚功能基因在不同光质条件下的表达模式提供参考。

MALDI-TOF-MS和RT-qPCR对于SLCO1B1和ApoE多态性检测的比较

目的探讨基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测脂质及药物代谢相关的基因位点的方法学比对,以评估MALDI-TOF-MS是否可用于临床SLCO1B1和ApoE多态性检测。方法纳入2018年7月至9月在北京协和医院诊断为高脂血症、高血压或动脉粥样硬化的患者共计71例。收集EDTA抗凝全血并提取基因组DNA,分别采用MALDI-TOF-MS和RT-qPCR检测SLCO1B1的rs2306283(388A>G)和rs4149056(521T>C)位点以及ApoE的rs429358(388T>C)和rs7412(526C>T)位点,并利用Kappa系数比较结果的一致性。结果两种方法对相关基因位点的检测结果具有较高的一致性,仅1例患者rs4149056(521T>C)位点出现分型差异且在MALDI-TOF-MS复检后得到与RT-qPCR一致的结果。结论MALDI-TOF-MS可应用于脂质及药物代谢相关基因SLCO1B1和ApoE多态性的检测,从而指导临床他汀类用药。

马铃薯S病毒RT-qPCR通用检测体系的建立与应用

为实现准确和快速鉴定PVS及其株系,明确PVS在马铃薯叶片、叶柄、茎、根和休眠块茎中含量以筛选适合的检测部位,设计PVS通用简并引物,建立实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术体系,分析熔解曲线鉴定PVS^(O)和PVS^(A)株系。以马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯M病毒(PVM)、马铃薯A病毒(PVA)和马铃薯卷叶病毒(PLRV)阳性样品为对照检测其特异性。应用PVS^(O)和PVS^(A)重组质粒分别建立标准曲线,检测接种PVS^(O)和PVS^(A)马铃薯品种尤金和冀张薯12号的5个部位PVS含量。另外,应用该体系检测来源于11个省(市、自治区)的90个PVS阳性样品验证其实用性。PVS^(O)和PVS^(A)扩增后熔解曲线分别在85.77~86.00℃和87.78~87.91℃出现特异峰,PVS阴性样品及PVX、PVY、PVM、PVA和PLRV阳性样品的熔解曲线均无上述特异峰。PVS^(O)和PVS^(A)的标准曲线重组质粒浓度分别在1.09×105~1.09×10^(9)拷贝/μL和1.26×10^(5)~1.26×10^(9)拷贝/μL时,荧光信号基线的循环数平均值(Cycle threshold,Ct值)与PVS病毒粒子拷贝数对数之间具有良好的线性关系(决定系数R2=0.9942和0.9912)。尤金和冀张薯12号5个部位PVS^(O)和PVS^(A)拷贝数均大于107数量级,均可用于检测,以PVS^(O)在叶柄中含量最高。11个省(市、自治区)的90个PVS阳性样品均可检测到。本研究建立的PVS RT-qPCR检测体系快速、准确、特异,并可依据样品熔解曲线鉴定PVS^(O)和PVS^(A)株系。叶片、叶柄、茎、根和休眠块茎等5个部位组织均可用于检测,实用性强,可为生产脱毒种薯提供技术支持。

BVDV、BRV和BCoV TaqMan三重RT-qPCR检测方法的建立

为建立牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛轮状病毒(BRV)和牛冠状病毒(BCoV)的快速检测方法,根据GenBank中登录的BVDV 5'-UTR、BRV NSP5和BCoV N基因序列设计特异性引物和探针,通过优化反应体系和条件,建立了同时检测上述3种病毒的TaqMan三重RT-qPCR方法。该方法仅对BVDV 5'-UTR、BRV NSP5和BCoV N基因扩增呈阳性,而对牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒、魏氏梭菌(A型、B型和D型)、多杀性巴氏杆菌(A型和B型)等犊牛腹泻相关病原扩增均呈阴性;最低检出限为10拷贝/μL;组内和组间变异系数均小于2%。利用本研究建立的TaqMan三重RT-qPCR方法对29份临床样品进行检测,获得BVDV、BRV、BCoV的4种混合感染型,其中BVDV与BCoV的混合感染率最高(27.6%);与已有单重RT-qPCR方法比较,发现两种方法检测BVDV、BRV和BCoV的符合率分别为100%、96.5%、100%。结果表明,本研究建立的TaqMan三重RT-qPCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好、可行性高等优点,可为今后BVDV、BRV和BCoV共感染引起的牛腹泻性疾病的鉴别诊断和流行病学调查提供新技术手段。

双重RT-qPCR鉴别CSFV和BVDV方法的建立及初步应用

为建立猪瘟病毒(CSFV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的鉴别检测方法,本研究根据CSFV Npro基因、BVDV 5'-UTR基因保守区域设计特异性引物和Taq Man探针,构建阳性重组质粒,优化反应条件,建立了双重RT-q PCR检测方法。该方法 CSFV和BVDV的检测灵敏度均为100拷贝/μL,具有良好的特异性和重复性;对206份猪病料进行检测,CSFV阳性59份、BVDV皆为阴性,与本实验室常用单项RT-q PCR试剂盒检测结果一致。本研究建立的双重RT-q PCR整个检测过程不到3 h,采取闭管反应,检测完毕直接处理,避免开盖造成气溶胶污染,具有简单、快捷、灵敏度高、生物安全性好等优点,可用于CSFV和BVDV的临床鉴别检测,为2种病毒的交叉污染的检测提供一种方便、快捷的方法。

基于新冠病毒荧光检测的RT-qPCR温控系统

实时荧光定量聚合酶链式反应是新型冠状病毒COVID-19快速检测的重要手段,病毒样本经过一系列复杂的化学反应处理后通过RT-qPCR温控系统得到检测结果,RT-qPCR温控仪实际就是一台精准的测温、控温仪和光谱检测设备。采用ARM处理器+H桥驱动器+帕尔贴的设计架构,通过归一化PID算法解决温度的快速升降问题,从而构建低成本、小型化的温控系统。该系统可以根据不同的温度设定和荧光剂选择适用其他病毒的核酸检测,整体控温指标可以达到升温速度不小于15℃/s、降温速度不小于8℃/s、温度精度0.1℃以内、升降温过冲小于4℃,稳定时间3 s。

长茎葡萄蕨藻胁迫条件下RT-qPCR内参基因的筛选与验证

为了筛选出长茎葡萄蕨藻中稳定表达的内参基因用于实时荧光定量PCR的分析,以不同胁迫条件下长茎葡萄蕨藻的匍匐茎和直立枝为材料,使用比较Ct值法、BestKeeper、geNorm、NormFinder软件综合比较了常用的5个候选内参基因的稳定性,并对筛选出的内参基因进行了验证。不同内参基因在长茎葡萄蕨藻中的表达稳定性差异较大,ClACT和ClGAPDH在长茎葡萄蕨藻不同组织、不同胁迫条件下的表达稳定性均较好,而ClTUB表达稳定性则较差。在使用RT-qPCR对胁迫条件下长茎葡萄蕨藻进行基因表达分析时,采用ClACT和ClGAPDH组合作为内参基因可得出较为准确的结果。