蓝舌病新疆分离株VP7蛋白编码基因序列分析及一步法RT-PCR方法的建立

【目的】分析蓝舌病新疆分离株编码VP7蛋白S7基因保守序列,建立蓝舌病新疆分离株一步法RT-PCR方法,为新疆BTV分子流行病学调查及防控提供技术支持。【方法】采用二代测序技术获得新疆分离株S7基因序列,登陆GenBank对序列进行同源性Blast比对,用软件MEGA 5.0分析序列差异,根据蓝舌病新疆分离株编码VP7蛋白S7基因保守序列,运用软件Oligo6.0设计引物,对蓝舌病新疆分离株S7基因进行RT-PCR扩增,并验证该方法的特异性及敏感性。【结果】蓝舌病中国新疆分离株编码VP7蛋白S7基因序列与哈尔滨报道BTV分离株S7基因片段相似度较高为89.64%,与中国云南报道BTV-29型分离株、蒙古国BTV分离株S7基因片段相似度分别为87.49%和87.39%;与德国BTV分离株S7基因片段相似度为80.70%,其余均无同源性序列。中国新疆分离株S7基因片段序列与4条同源序列间存在26处核苷酸差异,9处氨基酸差异。【结论】建立的蓝舌病中国新疆分离株S7基因片段一步法RT-PCR方法具有良好的特异性,仅BTV中国新疆分离株扩增获得目的条带,该方法的敏感性为4.0×10^(3)copies/mL。

猪Linda病毒巢式RT-PCR检测方法的建立

猪Linda病毒能引起仔猪先天性震颤,严重危害养猪业的发展,目前在我国暂未发现感染病例。本研究根据猪Linda病毒Core-E~(ms)基因序列,设计并合成巢式RT-PCR引物,通过对退火温度、引物浓度等进行优化,建立了猪Linda病毒巢式RT-PCR检测方法。结果显示,该方法具有良好的特异性,与非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型均无交叉反应;敏感性好,对慢病毒阳性对照品的最低检出限为10~1 copies/μL,比普通RT-PCR灵敏10倍。使用该方法检测模拟病毒样品,发现最低检出限为10~1 TU/mL,与荧光定量RT-PCR方法一致。本研究首次建立了可检测猪Linda病毒的巢式RT-PCR方法,其特异性强、灵敏度高,为在口岸以及条件有限的场地对猪Linda病毒进行精准且快速的检测提供了有效技术手段,也为防范Linda病毒传入提供了有力技术支撑。

鸽微RNA病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

旨在建立鸽微RNA病毒(pigeon megrivirus,PiMeV)实时荧光定量RT-PCR检测方法。本研究根据GenBank中PiMeVs序列特征设计特异性检测引物,从信鸽粪便中检测到PiMeV阳性(命名为PiMeV-CHN001株),并对其3 C基因进行核苷酸同源性比较和遗传进化分析,明确其基因特征后,设计特异性实时荧光定量RT-PCR检测(RT-qPCR)引物组,建立检测PiMeV的RT-qPCR方法。结果显示:PiMeV-CHN001株3 C基因全长为591 bp,编码197个氨基酸,和其他2株野鸽源PiMeV(MeV-B1株和MeV-B2株)核苷酸相似性分别为89.5%和92.0%。建立的检测PiMeV的RT-qPCR方法的标准曲线Y轴截距为37.93,斜率为-3.335,相关系数为1.00,扩增效率为99.4%。特异性强,仅PiMeV出现特异性扩增信号和特异性峰值[Tm值为(81.69±0.22)℃],对鸽源禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)、鸽源禽I型副黏病毒(pigeon paramyxovirus type I,PPMV-1)、鸽输血传播病毒(pigeon torque teno virus,PTTV)、鸽腺病毒(pigeon adenovirus,PiAd)及鸽圆环病毒(pigeon circovirus,PiCV)检测均未见特异性扩增信号;敏感性优,最低检测限为54.0拷贝·μL^(-1);重复性好,批内和批间变异系数均低于1.5%。用建立的检测方法对42份信鸽粪便样品进行检测,发现2份阳性样品(阳性率为4.76%)。本研究首次证实我国大陆地区信鸽中存在PiMeV,丰富了PiMeV宿主谱信息;建立的RT-qPCR方法为后续开展PiMeV流行病学研究提供支撑。

山羊地方性鼻内肿瘤病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

山羊地方性鼻内肿瘤(enzootic nasal tumor, ENT)是山羊的病毒性传染病,由山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus of goats, ENTV-2)所引起,感染后可以导致山羊的鼻道筛骨上皮细胞发生不可逆的癌变,已在世界范围内广泛存在,对山羊养殖业造成严重的经济损失。为建立快速、准确且能定量分析ENTV-2的检测方法,本研究根据GenBank上发布的ENTV-2 env基因(MT254061.1)保守区域设计引物和TaqMan探针,建立ENTV-2 TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法,并对其特异性、灵敏性、重复性与临床检测效果进行验证。结果显示,重组质粒标准品模板浓度为6.30×10^(2)~6.30×10^(7) copies·μL^(-1)呈现良好的线性关系,相关系数R^(2)为0.996 5,扩增效率为110%,线性方程的斜率为-2.953,最低检测限度为6.30×10^(1) copies·μL^(-1);组内变异系数和组间变异系数均小于2%,重复性好;与口蹄疫病毒((foot-and-mouth disease virus, FMDV)、小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus, PPRV)、蓝舌病毒(bluetongue virus)、羊内源性逆转录病毒(endogenous retroviruses)等均无交叉反应,表明该方法具有很好的特异性。利用本研究所建立的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法对29份临床样品进行检测,该方法较普通PCR方法的检出率更高。综上表明,本研究成功建立了ENTV-2 TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法,为ENTV-2的快速诊断和流行病学调查提供技术手段。

基于RT-PCR方法对河北省桃病毒和类病毒种类的调查鉴定

病毒是造成桃果实产量和品质下降的原因之一,RT-PCR是检测病毒的常用分子生物学方法。利用RT-PCR方法对河北省113份桃样品进行了13种病毒的检测,结果表明,检测到的10种病毒包括ACLSV、PBNSPaV、HSVd、NSPaV、PNRSV、PaLV、PLMVD、APCLSV、PeVD和PPV,其中ACLSV检测率最高,其次是PBNSPaV和HSVd 2种病毒。病毒具有复合侵染的现象,三重侵染和四重侵染的检测率最高,没有检测到不被病毒侵染和单一侵染的样品。研究结果为河北省桃病毒脱除、无病毒苗木繁育奠定了理论基础。

柑橘3种病毒类病原多重RT-PCR检测技术的建立及应用

【目的】建立柑橘黄化脉明病毒(citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)、柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus,CTV)和啤酒花矮化类病毒(hop stunt viroid,HSVd)的多重RT-PCR检测体系。【方法】设计多重RT-PCR引物,分析其特异性,确定其最佳浓度比、最适退火温度及灵敏度,在此基础上对福建地区的柑橘样品进行检测。【结果】确定了CYVCV-F/R、CTV-F/R和HSVd-F/R等3对引物的最佳浓度比例为1∶1∶2,最适退火温度为52.9℃,灵敏度结果显示该体系可检测模板稀释到10^(-2)的阳性样品。应用该体系对采自福建部分地区的157份柑橘样品进行检测,结果发现,CYVCV、CTV和HSVd的检出率分别为47.1%、56.7%和22.9%。【结论】成功建立了柑橘CYVCV、CTV和HSVd病原的多重RT-PCR检测方法,为该类病害的检测提供准确、快速的检测方法。

赤羽病病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速、灵敏的赤羽病病毒(Akabanediseasevirus,AKAV)核酸检测方法,以AKAV S基因为靶基因,设计特异性引物和Taq Man探针,通过优化反应体系和条件,建立了AKAV荧光定量RT-PCR检测方法,随后开展了敏感性、特异性及重复性评估,并利用该方法与AKAV检疫行业标准推荐方法同时对临床采集的80份牛羊血液样品进行检测,以检验方法的临床应用效果。结果显示:本研究建立的检测方法敏感性较高,最低检测限为13.4 copies/μL;特异性良好,与口蹄疫病毒、牛冠状病毒、牛结节性皮肤病病毒、牛病毒性腹泻病毒、传染性牛鼻气管炎病毒、蓝舌病病毒、牛白血病病毒等均无交叉反应;组内试验变异系数为0.93%~2.47%,组间试验为1.25%~2.76%,重复性良好;利用建立的方法从80份临床样品中检出AKAV阳性样品21份,该检测结果与AKAV检疫行业标准推荐方法的符合率为98.75%。结果表明,本研究建立的AKAV荧光定量RT-PCR检测方法敏感性高,特异性及重复性好,适用于赤羽病临床检测,为赤羽病病原学监测和诊断技术标准开发提供了技术支撑。

帕利亚姆病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

本研究拟建立帕利亚姆病毒(Palyam virus,PALV)血清型特异性实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)方法用于临床样本或媒介中PALV血清型鉴定。根据我国流行PALV毒株的基因节段2序列,设计扩增引物和TaqMan探针,建立PALV血清型特异型qRT-PCR方法,对方法的特异性、灵敏性与重复性进行评估;以我国分离的28株PALV和90份核酸阳性血液样本评估检测方法的可靠性;利用建立的方法对采集库蠓样本中携带的PALV进行血清型鉴定。结果显示,建立的PALV血清型qRT-PCR检测方法具有良好的特异性与灵敏性,可检出核酸拷贝数下限在22至28 copies·μL^(-1)。对28株PALV的qRT-PCR检测结果与病毒测序鉴定结果一致;对PALV不同感染阶段哨兵动物血液(90份)中的qRT-PCR鉴定结果与分离病毒的血清型鉴定结果一致;建立的方法可准确鉴定库蠓中携带PALV的血清型。本研究建立的PALV血清型qRT-PCR定型方法具有良好的特异强、敏感性与重复性,可用于PALV感染动物与媒介中PALV血清型的鉴定,具有良好的应用价值。

一步RT-PCR法检测苹果锈果类病毒和苹果凹果类病毒

由类病毒引起的苹果病害在中国苹果主产区普遍发生,严重制约苹果产业的健康发展。对采自不同地区的带有典型症状的弘前富士、南方脆及惠民短枝富士果实,进行苹果锈果类病毒(ASSVd)和凹果类病毒(ADFVd)检测,发现两种病毒能够共侵染。根据ASSVd和ADFVd保守序列设计通用引物,建立了能快速、同时检测两种类病毒的RT-PCR方法。

高致病性猪蓝耳病RT-PCR检测

为了解当地生猪养殖场猪蓝耳病感染情况,这次调查研究和结果为高致病性猪蓝耳病的预防和控制提供了实验数据的依据。本实验就当地一些规模养猪场和一些个体养猪户猪场养的猪突然出现以食欲废绝、耳末梢发紫、体温高、发病率、死亡率高为特征的疾病,对病死猪进行了无菌采样,实验室检测。

猪支原体肺炎RT-PCR诊断方法的建立和应用

目的:建立一种猪支原体肺炎RT-PCR诊断方法。方法:选择云南省大理地区患有猪支原体肺炎疾病的60只猪作为研究对象,针对猪肺炎支原体的保守序列p36基因设计了引物和探针,建立猪支原体肺炎RT-PCR检测反应体系,并对其灵敏度、特异性、重复性进行分析及临床样本验证。结果:RT-PCR检测灵敏度为10^(2)拷贝、与PRRSV、PPV、FMDV、PCV、CSFV、APP等无交叉反应,批内和批间变异系数均小于2.00%,肺组织样本检出阳性数26例(86.67%),鼻拭子样本检出阳性数19例(63.33%)。结论:该研究成功建立了一种猪支原体肺炎RT-PCR诊断方法,具有较高的检测灵敏度和特异性,重复性能良好,这为后期MPS的临床精准诊断和疫病科学防控提供试验依据。

马病毒性动脉炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立检测马病毒性动脉炎病毒(EAV)的荧光定量RT-PCR检测方法,本研究针对EAV ORF7基因序列设计引物及探针,并对其反应体系进行优化,建立标准曲线,结果显示,EAV荧光定量RT-PCR方法在退火温度为61℃、引物和探针终浓度均为0.6μmol/L的反应条件下效果最优;质粒标准品体外转录的cRNA在1.6×10^(7)拷贝/μL~1.6×10^(2)拷贝/μL时与Ct值之间呈现良好的线性关系,标准曲线方程为y=-2.68x+32.88,R^(2)=0.9927,初步建立了EAV荧光定量RT-PCR方法。采用该方法检测EAV、马焦虫、马疱疹病毒1型、马疱疹病毒4型、马流感病毒,结果显示,该方法仅能特异性检测到EAV,其他病原检测均为阴性,该方法特异性强;将体外转录合成的质粒标准品cRNA 10倍倍比稀释后利用该方法检测,结果显示该方法最低检测限为1.6×10^(2)拷贝/μL,灵敏性高;重复性试验结果显示,该方法组内及组间变异系数均小于2.0%,重复性好。采用本实验建立的荧光定量RT-PCR方法和文献发表的EAV荧光定量RT-PCR方法分别对234份临床样品进行检测,两者的阳性检出率均为14.1%(33/234),两种方法的符合率为100%。本研究建立的荧光定量RT-PCR检测方法为马病毒性动脉炎的防控提供了新的技术手段和思路。

牛病毒性腹泻病毒TaqMan探针荧光RT-PCR方法的建立和临床应用

为建立一种牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的快速检测方法,本研究根据国内BVDV流行毒株5'-UTR序列保守区域设计1对特异性引物和TaqMan探针,并优化了反应条件,最终建立了一种检测BVDV基因1型(BVDV-1)的TaqMan探针荧光RT-PCR检测方法,并开展7省份BVDV-1型检测和流行情况分析。结果显示:所建立方法能够特异性检测出BVDV-1,与基因2型BVDV、猪瘟病毒、边界病毒、牛冠状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒等病原无交叉反应;灵敏度高,最低检测下限为4.3 copies/μL;批内和批间变异系数均小于2%,重复性良好。7省份规模化牛养殖场BVDV-1型平均阳性率为17.40%(161/925),序列分析表明我国主要流行的为BVDV-1a,BVDV-1c亚型。本研究成功建立了一种良好的诊断BVDV的方法,监测地区优势流行毒株为BVDV-1a与1c亚型,为临床中BVDV早期诊断和流行病学调查监测提供了技术和数据支持。

猪流感病毒通用型微滴式数字RT-PCR绝对定量检测方法的建立

为建立灵敏且可绝对定量检测猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的微滴式数字RT-PCR(ddRT-PCR)方法,以SIV M基因的保守序列为靶基因,设计并合成一套特异性引物和TaqMan探针,建立了可对主要流行的H1N1、H1N2和H3N2亚型SIV绝对定量检测的通用型ddRT-PCR方法。随后,对该方法的敏感性、特异性和重复性进行评价,并利用临床猪鼻咽拭子样品进行检测验证。结果显示:建立的ddRT-PCR方法检测限达到1.6 copies/µL,灵敏度极高;能特异性检出H1N1、H1N2和H3N2亚型SIV,与猪瘟病毒等其他常见猪病病原均无交叉反应;重复检测结果的批内和批间变异系数(CV)分别为0.75%、3.17%,重复性良好;经临床样品检测验证,建立的ddRT-PCR和荧光RT-qPCR方法分别检出阳性样品72、66份,提示前者在检测低病毒拷贝样品时较荧光RT-qPCR更优。结果表明,本研究建立的SIV通用型ddRT-PCR方法灵敏度高,特异性和重复性均良好,且在检测低病毒含量临床样本时更具优势,可作为一种对SIV感染进行早期诊断和绝对定量检测的有效方法。

蜜蜂慢性麻痹病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立慢性蜜蜂麻痹病毒(CBPV)快速诊断方法,本研究根据CBPV RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针,建立了荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,以构建的重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光定量PCR方法,标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数达0.998;该方法最低检出限为10拷贝/μL,与蜜蜂急性麻痹病毒等常见蜜蜂病毒无交叉反应,具有良好的灵敏性和特异性;组内和组间变异系数分别低于0.5%和2%,具有较好的稳定性。本研究建立的CBPV荧光定量RT-PCR检测方法,可用于实验室检测、流行病学调查和疫情监测。

胡子鲇qRT-PCR内参基因的筛选

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)是研究基因表达有效的工具之一,选取合适的内参基因,是获得可靠的基因表达结果的关键。本研究以胡子鲇(Clarias fuscus)为研究对象,采用qRT-PCR技术检测了13个候选基因(actb1、actb2、ef1a、eef1b2、rpl13a、rpl13、ccdc124、cfl1、nm23、eif3g、rap1a、ikbkg和ywhab)在胡子鲇性腺不同发育阶段和成鱼不同组织中的基因表达情况,并利用BestKeeper、GeNorm、NormFinder和RefFinder软件分析其表达稳定性,以筛选在胡子鲇性腺发育和不同组织中稳定表达的内参基因。结果显示,13个候选内参基因的定量PCR引物均可获得特异性扩增产物。在性腺不同发育阶段,候选基因表达稳定性顺序为actb2>rpl13>actb1>cfl1>rap1a>ef1a>rpl13a>ikbkg>eif3g>nm23>eef1b2>ywhab>ccdc124,成鱼不同组织中稳定性顺序为actb2>rpl13>cfl1>rap1a>ef1a>rpl13a>ikbkg>eif3g>nm23>actb1>eef1b2>ywhab>ccdc124。随后,选择稳定性前二的actb2和rpl13作为候选内参基因,分析zp3、atp2b3、slc13a5和parp8基因在胡子鲇雌、雄性腺中的相对表达量,结果进一步证实,以actb2为内参时,其雌雄性状差异基因表达水平更接近于转录组结果。综合分析表明,actb2基因可作为内参基因用于今后胡子鲇性腺不同发育时期和不同组织间功能基因表达特征的研究。

传染性法氏囊病毒新型变异株荧光定量RT-PCR检测方法的建立

传染性法氏囊病病毒新型变异株(Novel variant Infectious bursal disease virus,nVarIBDV)给我国养禽业防控法氏囊带来更大的挑战。目前缺乏快速、灵敏的针对nVarIBDV的检测方法。为解决这一问题,该试验根据已发表的nVarIBD的VP2基因序列,设计了一对引物和一条特异性Taq Man探针,建立了一种nVarIBD的Taq Man荧光定量RT-PCR检测方法,该方法可通过特异性扩增nVarIBD VP2基因来确定样品是否为IBDV新型变异株。通过构建重组质粒pMD18-T-VP2对引物和探针进行灵敏性和重复性试验,以及特异性检测,最后使用该检测方法对临床样品进行验证。荧光定量RT-PCR结果显示灵敏性可达1.32×10^(1)copies/μL,高于常规RT-PCR的100倍。批内和批间重复试验变异系数(CV)均小于0.5%,结果表明该检测方法有良好的重复性与稳定性。该方法与常见禽病毒核酸无交叉反应,说明检测方法具有较好的特异性。综合本研究结果表明,该研究建立的nVarIBD荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、灵敏性高、重复性好,可用于临床样品中IBDV新型变异株的监测。

球茎甘蓝qRT-PCR内参基因的筛选及稳定性验证

【目的】通过对已知内参基因进行筛选,确定球茎甘蓝最合适的内参基因,确保实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的准确表达。【方法】本试验选择了11种参考基因,利用GeNorm、Normalfinder和Bestkeep软件对紫色球茎甘蓝和绿色球茎甘蓝不同部位的内部参考基因进行了分析。【结果】3个分析结果显示,内参基因Tip41在球茎甘蓝不同组织部位表达最稳定。【结论】Tip41是作为内参基因的最佳选择,为球茎甘蓝后续的分子生物学相关研究提供基础。

IHC、FISH、qRT-PCR检测NSCLC ALK融合基因的对比分析

目的对比分析免疫组化(IHC)、荧光原位杂交(FISH)、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测非小细胞肺癌(NSCLC)ALK融合基因情况。方法收集453例NSCLC标本。随机选取IHC检测的ALK融合基因不同表达程度标本40例[ALK(-)、(+)、(2+)、(3+)标本各10例],采用FISH和qRT-PCR法分别检测各组ALK融合基因表达水平,并进行一致性分析。结果IHC与FISH、qRT-PCR的ALK融合基因检测结果比较,IHC ALK(-)/(3+)与FISH、qRT-PCR检测结果一致率均为100%,具有高度一致性(r=0.781、r=0.740,P<0.05)。FISH与qRT-PCR的检测结果一致率为97.5%,具有高度一致性(r=0.943,P<0.05)。结论FISH、qRT-PCR法与IHC法检测在不同表达程度ALK融合基因样本中检测结果存在差别,IHC敏感性更高。FISH、qRT-PCR法在ALK融合基因样本的检测结果具有高度一致性。

小麦叶锈菌2个候选效应因子的克隆及其qRT-PCR分析

小麦叶锈病是由隐匿柄锈菌(Puccinia triticina,Pt)侵染的一种气传性真菌病害,对小麦造成严重的产量损失。Pt产生的吸器是产生效应因子的主要场所,而效应因子是Pt致病的关键。本研究基于早期构建的小麦叶锈菌单胞菌系13-5-28-1(JHKT)在休眠孢子、萌发夏孢子和侵染6 d的转录组文库,在系统筛选候选效应因子的基础上,选取两个候选效应因子Pt12448和Pt34354进行克隆,利用qRT-PCR分析候选效应因子的表达模式,结果发现其中Pt12448基因表现为后期诱导上调,Pt34354基因则为前期诱导上调。研究结果将推进对小麦叶锈菌致病机制的研究进程。