全自动免疫组织化学染色与手工染色在胃肠道肿瘤患者中的应用价值比较

目的比较全自动免疫组织化学染色与手工染色在胃肠道肿瘤患者中的应用价值。方法选取2022年1月至12月宝鸡市中医医院收治的300例胃肠道肿瘤患者为研究对象。所有患者各采集病灶组织2份,分别采用全自动免疫组化仪染色(自动组)和手工染色(手工组)。比较不同染色方式的染色质量、切片背景着色、边缘着色发生率、阳性细胞检出率、染色时间及染色方式满意度。结果自动组的染色质量优良率高于手工组,差异具有统计学意义(P<0.05)。自动组的切片背景着色、边缘着色发生率低于手工组,阳性细胞检出率高于手工组,差异具有统计学意义(P<0.05)。自动组的人力工作时间、步骤完成时间短于手工组,差异具有统计学意义(P<0.05)。自动组的显色情况、染色结果、诊断结果及应用价值满意度评分高于手工组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论全自动免疫组织化学染色在胃肠道肿瘤患者中应用的价值优于手工染色,其可提高染色质量、阳性细胞检出率、染色效率与染色满意度。

犬髓外浆细胞瘤的组织病理学诊断和免疫组织化学分析

髓外浆细胞瘤(EMP)在犬中属于相对罕见的肿瘤,为了明确犬EMP的组织病理学和免疫标志物表达特征,本试验采用苏木精-伊红(H. E.)染色和刚果红染色法对患犬的皮肤肿物进行组织病理学诊断,进一步使用EMP免疫标志物配对盒基因5(PAX5)、白细胞分化抗原20(CD20)、白细胞分化抗原79a(CD79a)、多发性骨髓瘤基因1(MUM1)和犬免疫球蛋白G(Canine IgG)进行免疫组织化学(IHC)染色,并总结免疫标志物表达特征。结果显示,2例病例的肿物均无包膜结构,并与周围组织边界清晰,肿瘤细胞呈浆细胞样或浆母细胞样特征,病例2肿物内见淀粉样沉积。病例1肿瘤细胞免疫标志物PAX5、CD20和MUM1呈阴性,CD79a和Canine IgG呈阳性;病例2肿瘤细胞免疫标志物PAX5呈阴性,CD20、CD79a、MUM1和Canine IgG呈阳性。结果表明,通过组织病理学检查结合IHC染色结果,确诊2例病例均为犬皮肤型EMP。本试验为犬EMP的精确诊断提供重要的病理学依据,具有重要的参考价值。

4例犬恶性黑色素瘤病理学和PNL-2免疫组织化学染色检查

为了对4例疑似犬肿瘤的临床病例进行确诊,本文对临床送检的4例疑似犬肿瘤的肿物样本进行组织切片制作,经苏木精-伊红(H.E.)染色后,镜下可见增生的细胞排列呈束状、片状、巢状和螺纹状等,细胞呈梭形或多角形,部分细胞胞浆内含有黑色素颗粒,符合黑色素细胞肿瘤的特征;为了进一步观察细胞形态并对肿物进行确诊,使用黑色素瘤相关抗原(PNL-2)对肿瘤细胞进行免疫组织化学(IHC)染色,并用二氨基联苯胺(DAB)和3-氨基-9-乙基卡唑(AEC)显色液对其显色,结果均为恶性黑色素瘤(MM)。本试验通过对肿物的细胞形态学特征和IHC染色结果综合分析,将4例病例诊断为MM。试验结果不仅为犬MM的病理诊断提供参考,还为比较医学中MM的确诊提供参考依据。

淋巴瘤免疫组织化学标志物的合理应用

对多数病理医生尤其是初学者而言,淋巴瘤病理诊断较为困难。主要有两方面原因:(1)淋巴瘤发病率低,在所有恶性肿瘤中排名第10位[1],世界范围内我国淋巴瘤发病率远低于美国和其他发达国家[2],因此在一般非肿瘤专科医院的病理医生的日常工作中并不常见。(2)与多数实体肿瘤单纯形态观察即可诊断不同,淋巴瘤诊断需结合形态与免疫表型且淋巴瘤分类复杂[3],初学者难于掌握。

US-FNAC结合CT、CgA和TG免疫组织化学染色在甲状腺髓样癌诊断中的应用

目的探讨超声引导下细针穿刺细胞学(ultrasound-guided fine-needle aspiration cytology,US-FNAC)联合降钙素(calcitonin,CT)、嗜铬素A(chromogranin A,Cg A)、甲状腺球蛋白(thyroglobulin,Tg)诊断甲状腺髓样癌(medullary thyroid cancer,MTC)的应用价值。方法对7例US-FNAC诊断且术后组织病理学确诊的MTC临床资料和超声特点、细胞病理学特征进行综合分析。细针穿刺标本采用常规涂片1~2张自然风干后刘氏染色液快速染色,现场进行细胞病理学评判,确保取得满意的细胞量,同时将剩余标本注入液基细胞保存液中保存,采用液基薄层制片,HE染色及CT、CgA和Tg免疫组织化学染色。结果7例MTC细胞均中等量到大量,均有散在突出的大细胞、双核细胞、浆样细胞或核偏位不规则细胞;6例伴梭形细胞,细胞病理学表现与MTC细胞学诊断标准基本相符,CT、CgA胞质均弥漫强阳性表达,Tg阴性,细胞病理学诊断为MTC。结论US-FNAC技术可提高甲状腺结节细针穿刺标本满意度,结合液基薄层制片与CT、CgA免疫组织化学染色可提高MTC术前诊断准确性,对MTC治疗具有重大的临床意义。

基于数据挖掘及免疫组织化学技术分析EPHA5在肺腺癌中的表达

目的探索促红细胞生成素产生型人肝细胞受体A5(erythropoietin-producing hepatocellular receptor A5,EPHA5)在肺腺癌中的表达。方法通过网络数据库获得EPHA5在不同肿瘤中的变异情况,构建EPHA5蛋白互作网络图,分析EPHA5在肺腺癌中的预后情况。收集肺腺癌患者的手术标本及临床资料,采用免疫组织化学方法检测EPHA5的表达情况,分析肺腺癌中EPHA5表达与患者临床特征的相关性。结果EPHA5在肺腺癌中的突变频率最高,以错义突变为主。除EPH家族的配体之外,EPHA5与RhoA、ADAM10蛋白密切相关。EPHA5的高表达与肺腺癌患者的总生存时间和首次进展时间相关。EPHA5在肺腺癌组织中表达上调,与患者淋巴结转移、分化程度、TNM分期显著相关。结论EPHA5在肺腺癌组织中高表达,可以作为预测肺腺癌预后的一个因素。

“免疫组织化学与技术”课程教学改革研究

随着科技的进步,药学研究的深入发展,免疫组织化学与技术作为揭示生物体内蛋白质、酶及其他生物分子分布、定位与功能的重要手段,其重要性日益凸显。然而,传统的免疫组织化学与技术课程教学往往侧重于理论知识的传授,忽视了对学生实践能力、创新思维和思想政治觉悟的培养,难以满足当前科研和药学工作的需求。因此,对免疫组织化学与技术课程进行教学改革研究,是一个具有深远意义的课题,旨在提升教学质量,培养具有扎实理论基础和卓越实践技能的高素质药学专业人才。本文就免疫组织化学与技术课程教学改革研究内容进行几点阐述。

术中快速与术后常规免疫组织化学染色效果比较

目的:探讨术中冷冻切片快速免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)技术在术中快速病理诊断中的应用效果。方法:对17例术中常见送检的乳腺、肺、甲状腺病变标本应用术中冷冻切片快速免疫组织化学技术检测广谱细胞角蛋白(Cytokeratin Pan,CKpan)、细胞角蛋白5/6(Cytokeratin 5/6,CK5/6)、细胞角蛋白19(Cytokeratin 19,CK19)、甲状腺转录因子-1(thyriod transcription factor-1,TTF-1)和P63蛋白的表达,并与术后常规免疫组织化学染色效果进行比较。结果:术中冷冻切片快速IHC与术后常规IHC对CKpan、CK5/6、CK19和TTF-1蛋白的染色部位一致,染色强度相似。结论:术中快速免疫组织化学技术对常见阳性标志物的染色效果与常规免疫组织化学技术接近。

联合p16、Ki-67免疫组织化学染色在宫颈上皮内瘤变分级诊断中的应用效果观察

[目的]探究与分析联合应用p16、Ki-67免疫组织化学染色对宫颈上皮内瘤变(CIN)分级诊断的影响.[方法]回顾性分析自2019年3月至2021年11月间收治的接受宫颈液基薄层细胞学检查(TCT)且检查结果异常的60例患者的临床资料.全部患者按照苏木精-伊红染色法(HE)结果分为慢性宫颈炎组(n=19)、CINⅠ组(n=15)、CINⅡ组(n=12)、CINⅢ组(n=10)、宫颈癌组(n=4),全部患者均进行了宫颈阴道镜活检、人乳头瘤病毒(HPV)分型检测,并配合采用P16、Ki-67免疫组织化学染色的半定量评分,以判断患者宫颈病变程度.[结果]随着宫颈CIN病变程度的升高,CINⅢ组分别与CINⅠ组、CINⅡ组相比,CINⅡ组与CINⅠ组相比,P16表达阳性程度及Ki-67表达阳性程度升高,差异有统计学意义(P<0.05).慢性宫颈炎组P16、Ki-67免疫组织化学结合半定量评分与HE染色CIN分级诊断结果相符,CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组诊断结果相符率为94.59%,差异具有统计学意义(P<0.05).P16呈阳性表达时与HPV感染呈正相关(P<0.05).HPV-16、HPV-18、HPV-35、HPV-39、HPV-51在P16表达阳性与阴性方面差异具有统计学意义(P<0.05).[结论]CIN分级与P16、Ki-67的表达呈正相关,且P16与患者HPV感染有密切的关系.

H3.3G34W、p63及SATB2免疫组织化学染色联合应用对骨巨细胞瘤的诊断价值

目的探讨H3.3G34W、p63及SATB2在骨巨细胞瘤(giant cell tumor of bone,GCTB)中的表达情况及其联合应用对GCTB的诊断作用和价值。方法收集西安交通大学附属红会医院病理科2020年至2022年诊断的54例GCTB、83例非骨巨细胞瘤(non-giant cell tumor of bone,NGCTB)(包含14例动脉瘤样骨囊肿、16例软骨母细胞瘤和53例非骨化性纤维瘤)患者的样本和病历资料,采用免疫组织化学EliVision法检测H3.3G34W、p63及SATB2的表达情况。通过χ^(2)检验判断H3.3G34W、p63及SATB2的阳性率在各组间是否存在统计学差异;通过Logistic回归分析建立包括H3.3G34W、p63及SATB2的联合诊断模型,通过受试者工作特征(ROC)曲线分析评价模型的诊断价值。结果H3.3G34W、p63及SATB2在GCTB组中阳性率分别为81.5%、90.7%、92.6%;在NGCTB组中阳性率分别为2.4%、28.9%、62.7%。与NGCTB组相比,GCTB组患者年龄显著较大[(41.222±14.849)vs.(16.566±9.439);P<0.001],女性比男性患病率更高(51.9%vs.48.1%,P<0.001)。与NGCTB组相比,GCTB组中H3.3G34W(81.5%vs.2.4%,P<0.001);p63(90.7%vs.28.9%,P<0.001)和SATB2(92.6%vs.62.7%,P<0.001)的阳性率更高。单因素Logistic回归分析构建单因素预测模型,同时行ROC曲线分析,表明年龄(AUC=92.9%,P<0.001)、性别(AUC=64.5%,P=0.004)、H3.3G34W阳性率(AUC=89.5%,P<0.001)、p63阳性率(AUC=80.9%,P<0.001)、SATB2阳性率(AUC=65.0%,P=0.003)是GCTB诊断的独立预测因素。进一步的多因素Logistic回归分析构建混合预测模型,并行ROC曲线分析,发现混合模型展现出比单因素模型更好的预测价值(AUC=98.4%,P<0.001)。结论H3.3G34W、p63及SATB2是有效诊断GCTB的分子标记物,且三者联合应用更能提高GCTB的诊断预测效能。

非小细胞肺癌BRAF V600E突变免疫组织化学检测中国专家共识

我国肺癌的发病率和病死率均位居恶性肿瘤的首位[1],其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)约占85%[2]。BRAF是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)/细胞外信号调节激酶(extracellular-signal regulated kinases,ERK)信号通路的关键调节因子[3]。NSCLC中BRAF基因突变率为1.5%~5.5%,其中以BRAF V600E突变(Ⅰ类突变)为主,占所有BRAF基因突变的30%~50%[3-5]。BRAF突变NSCLC患者预后不良,且常规的化疗或免疫治疗临床获益有限[6]。国内外临床研究显示:BRAF抑制剂(达拉非尼)与丝裂原活化细胞外信号调节激酶(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase,MEK)抑制剂(曲美替尼)联用,在初治和经治的BRAF V600E突变的晚期NSCLC患者中均显示良好的疗效及生存获益[7-8]。基于此,该联合疗法已获得中国、美国、欧洲、日本等多个国家和地区的批准,用于治疗BRAF V600E突变的转移性NSCLC,并纳入国内外权威指南推荐。

宫颈鳞癌中PD-L1不同抗体免疫组织化学染色的一致性分析

目的探讨宫颈鳞癌中程序性死亡配体1(PD-L1)表达情况及22C3、SP263、E1L3N 3种抗体免疫组化染色的一致性。方法收集解放军总医院两个医学中心89例复发或转移性宫颈鳞癌样本,用PD-L13种克隆号抗体22C3、SP263、E1L3N进行染色,并采用联合阳性评分(CPS)、肿瘤细胞比例评分(TPS)两种评分标准,在不同阈值下对抗体的一致性进行统计学分析。结果宫颈鳞癌在CPS阳性阈值为1时,PD-L1阳性率从高到低依次为22C3(98.31%)、E1L3N(97.75%)、SP263(93.90%);CPS为10时,阳性率依次为E1L3N(76.40%)、22C3(72.88%)、SP263(69.51%);TPS阈值为1%时,阳性率依次为E1L3N(95.51%)、22C3(93.22%)、SP263(92.68%);TPS为10%时,阳性率依次E1L3N(65.17%)、22C3(64.41%)、SP263(60.98%)。当CPS为1或10时、TPS为1%或10%时,E1L3N与22C3、SP263与22C3、SP263与E1L3N均表现较好的一致性(Kappa=0.66~0.98)。无论使用CPS或TPS,组内相关系数检验显示3个克隆号抗体判读数据有高度一致性(ICC分别为0.987、0.984)。结论E1L3N、SP263与22C3之间具有较高的可互换性,为临床检测PD-L1在宫颈癌组织中的表达情况,提供了更多选择。

免疫组织化学室内质控对照组织的新型保存设置方法

目的研究一种新型免疫组织化学阳性对照组织保存和设置方法,将目前在用的免疫组织化学阳性对照设置方法化繁为简。方法以胸腔积液为例,将新鲜胸腔积液离心固定破除红细胞,制成细胞悬液,然后将细胞悬液进行脱水处理,保存在按比例混合的石蜡和液体石蜡制成的膏状物中,灌注在唇膏管中,旋出膏体,涂抹在黏附玻片上,膏体中保存的细胞即可被黏附于玻片上,进行后续的免疫组织化学染色。结果显微镜下观察涂抹的细胞分布均匀,细胞密度适宜,细胞形态完整,在苏木精-伊红(HE)染色中,细胞核与细胞质染色对比清晰,细胞核着苏木精的紫色,细胞质着伊红的淡粉红色,组织细胞,淋巴细胞,间皮细胞等清晰可辨。在免疫组织化学CD68染色中,组织细胞细胞质棕黄色着色。在免疫组织化学Ki-67染色中,增殖期的细胞细胞核棕黄色着色。免疫组织化学染色结果表达清晰,定位准确。结论免疫组织化学阳性组织对照棒涂抹的阳性对照细胞可以代替蜡块切成蜡片制备的阳性对照,免疫组织化学阳性组织对照棒可以应用于免疫组织化学制片过程中阳性对照设置这一步骤中。

免疫组织化学和RT-PCR法检测乳腺癌骨髓和前哨淋巴结微小转移的临床研究

目的探讨免疫组织化学(IHC)和RT-PCR法检测乳腺癌骨髓和前哨淋巴结(SLN)微小转移的灵敏度及临床意义。方法留取乳腺癌改良根治术腋窝淋巴结HE染色证实阴性的病人的胸骨骨髓血和SLN,分别采用IHC和RT-PCR方法检测其微小转移情况。结果62例中,骨髓样本RT-PCR检测15例阳性表达,其中9例IHC检测也为阳性,二者结果有较好一致性(kappa=0.6945),检出率有统计学差异(P=0.0412);SLN样本RT-PCR法有13例KT19mRNA表达,其中7例IHC检出KT19阳性细胞,二者结果一致性较好(kappa=0.6483),检出率有统计学差异(P=0.0412);骨髓和SLN同时表达KT19mRNA仅3例,无显著相关(P=0.796);原发肿瘤大小和骨髓KT19mRNA表达率有关联(P=0.003)。结论常规检查未发现远处和腋窝淋巴结转移,骨髓和SLN可检出微小转移,RT-PCR较IHC更灵敏,肿瘤大小与骨髓微小转移有关联。由于骨髓和腋窝淋巴结微小转移不一定同步出现,选用灵敏方法对不同组织同时进行检测可能更具临床价值。

多组织包埋在人表皮生长因子受体2免疫组织化学阳性对照制作中的应用

目的探讨多组织包埋在人表皮生长因子受体2(HER2)免疫组织化学阳性对照制作中的应用。方法收集2022年8月至2023年8月满足中山大学孙逸仙纪念医院病理科临床诊断后剩余的乳腺癌组织,通过免疫组织化学定位,选取HER2均一表达0、+、++、+++的组织,进行多组织包埋,制作成阳性对照蜡块。结果每张组织化学片中对照组织中均能HER2表达0、+、++、+++。结论多组织包埋可以很好地应用在HER2免疫组织化学阳性对照制作中。

免疫组织化学特异性抗体诊断浆膜腔积液转移性腺癌与增生性间皮细胞的应用价值

目的探讨免疫组织化学特异性抗体诊断浆膜腔积液转移性腺癌(MA)与增生性间皮细胞的应用价值。方法选取2021年1月至2023年10月广西华银医学检验所病理科浆膜腔积液标本181例,其中,113例有转移性腺癌细胞,68例有增生性间皮细胞。制备细胞石蜡切片,采用免疫组织化学标记法检测抗体绒毛蛋白(Villin)、细胞角蛋白7(CK 7)、上皮特异抗原(Ber-Ep 4)、上皮细胞表面糖蛋白单克隆抗体(MOC-31)、癌胚抗原(CEA)水平,分析上述抗体诊断MA与增生性间皮细胞的应用价值。结果Villin、CK7、Ber-Ep4、MOC-31及CEA鉴别诊断转移性腺癌细胞与增生性间皮细胞的灵敏度分别为54.87%、69.91%、78.76%、93.81%、81.42%,特异度分别为94.12%、92.65%、88.24%、92.65%、92.65%。结论免疫组织化学特异性抗体鉴别诊断浆膜腔积液中转移性腺癌细胞与增生性间皮细胞的准确性高,在细胞病理学诊断中的应用价值较高。

多组织蜡块在免疫组织化学染色阳性对照中的应用

目的:目前免疫组织化学染色阳性对照的制作方法多种多样,单组织对照制作简单,但使用时由于免疫组织化学染色指标过多,容易出错。一些多组织对照使用方便,但制作方法繁琐、难度高。本研究旨在探讨一种新型、简单的多组织蜡块的制作及其在免疫组织化学染色对照中的应用。方法:依据国际特设专家委员会对常见抗体对照组织的推荐,选取包含肝、阑尾、扁桃体、肺、胰腺组织蜡块各1个为1组,共10组,进行厚度为6μm的连续切片,将切好的组织片依次卷曲叠在一起,形成一个长条形的致密组织卷,经过切割和包埋,制成多组织免疫组织化学染色阳性对照蜡块,然后用于免疫组织化学染色。结果:该阳性对照蜡块染色效果好,包含5种阳性对照组织,可适用于68种常用的免疫组织化学染色标志物。一次至少可制作对照蜡块2个,耗时约20 min,组织大小平均约为4.7 mm×4.1 mm,不同对照蜡块之间以及同一对照蜡块的不同切面之间,切片后免疫组织化学染色结果一致性较好,一个蜡块平均可切约800张有效的免疫组织化学染色对照片。结论:多组织阳性对照蜡块制作方法简单,耗时少、组织面积小、一致性好、重复性高,可以满足68种常用抗体对照组织的设置需求,对日常免疫组织化学染色检测有较好的临床应用价值。

乳腺癌病理诊断中免疫组织化学检测的临床价值分析

目的:分析乳腺癌病理诊断中免疫组织化学检测的临床价值。方法:筛选120例山东省莱州市人民医院在2015年1月至2022年12月收治的乳腺癌患者参与研究。所有患者均接受免疫组织化学检测,检测指标包括雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人表皮生长因子受体-2(HER2)。观察120例患者ER、PR、HER2的阳性率,分析ER、PR、HER2阳性率与肿瘤大小、发生淋巴结转移的相关性。结果:120例乳腺癌患者的ER阳性表达率为65.8%,PR阳性表达率为62.5%,HER2阳性表达率为41.7%。ER和PR的阳性表达率与肿瘤直径呈负相关性(r=-0.342、-0.358,P均<0.05)。ER和PR的阳性表达率与发生淋巴结转移呈负相关性(r=-0.286、-0.331,P均<0.05)。HER2的阳性表达率与肿瘤大小、发生淋巴结转移均呈显著正相关性(r=0.402、0.371,P均<0.05)。讨论:免疫组织化学检测在乳腺癌病理诊断中具有重要的价值,可用于评估患者的病情,为对临床制定治疗方案起到指导作用。

冰冻切片联合快速免疫组织化学检测在乳腺癌前哨淋巴结转移诊断中的应用价值

目的:观察冰冻切片联合快速免疫组织化学检测在乳腺癌前哨淋巴结转移诊断中的应用价值。方法:收集2022年3月-2023年10月贵州医科大学附属白云医院收治的190例乳腺癌患者病理组织标本,均采取冰冻切片、快速免疫组织化学法、石蜡切片进行前哨淋巴结活检,以石蜡切片病理结果作为“金标准”,评估冰冻切片、快速免疫组织化学法以及两者联合检测对乳腺癌前哨淋巴结转移的诊断效能。结果:190例患者石蜡切片病理结果显示,乳腺癌前哨淋巴结转移56例。冰冻切片联合快速免疫组织化学检测诊断乳腺癌前哨淋巴结转移的准确率、灵敏度、阴性预测值高于冰冻切片、快速免疫组织化学法,诊断乳腺癌前哨淋巴结转移的特异度、阳性预测值低于冰冻切片、快速免疫组织化学法,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:冰冻切片联合快速免疫组织化学检测在乳腺癌前哨淋巴结转移诊断中的临床价值较高,能够提高诊断准确率、灵敏度、阴性预测。

肾组织石蜡切片Ⅳ型胶原α链免疫组织化学染色在诊断Alport综合征中的应用

目的对Alport综合征(AS)患者肾脏穿刺组织进行石蜡切片Ⅳ型胶原α链免疫组织化学检测,探讨其临床应用价值。方法选取2018年11月至2022年7月浙江大学医学院附属第一医院肾脏病中心确诊的10例AS患者(AS病例组)、10例心脏死亡器官捐献者(DCD)供肾及10例确诊为免疫球蛋白A肾病患者(对照组)的肾组织进行石蜡切片Ⅳ型胶原α1、α3、α5链全自动免疫组织化学染色,将其与冰冻切片免疫荧光染色结果进行比较。将对照组肾组织石蜡切片分别采用多种方法进行抗原修复,比较修复效果。结果对照组肾组织2种染色方法Ⅳ型胶原α1、α3、α5链染色在肾小球基底膜(GBM)中均为连续线状阳性表达。AS病例组肾组织2种染色方法Ⅳ型胶原α1链染色在GBM均呈连续线状阳性表达,α3、α5链染色在GBM为阴性或节段弱阳性表达。2种染色方法染色结果具有较高的一致性(Kappa=0.615,P=0.035)。结论石蜡切片全自动免疫组织化学检测Ⅳ型胶原α1、α3和α5能较好地用于AS的诊断,为AS的诊断和研究提供了一种可靠的技术手段。