梅花鹿DLX5基因克隆及表达分析

为研究梅花鹿(Cervus nippon)DLX5基因的结构和功能,进一步探究其与梅花鹿茸角骨化机制间的关系,采用RT-PCR技术对梅花鹿DLX5基因进行克隆,获得包含全部编码区的c DNA序列,对该基因的氨基酸序列进行生物信息学分析并构建系统进化树,通过KEGG富集分析其信号通路,运用实时荧光定量RT-PCR检测该基因在鹿茸生长不同时期的表达情况。结果表明:梅花鹿DLX5基因编码区长为870 bp,共编码289个氨基酸。DLX5蛋白为可溶性的不稳定蛋白,有2个保守结构域,主要定位于细胞核。梅花鹿DLX5蛋白与许多不同物种来源的DLX5蛋白氨基酸序列有较高相似度,比较保守。DLX5蛋白二级结构中无规则卷曲占比最大(78.89%),其后依次是α-螺旋、延伸链,占比分别为16.96%和4.15%。DLX5基因主要的作用通路为TGFβ信号通路、MAPK信号通路和Wnt信号通路等。实时荧光定量RT-PCR结果表明,DLX5基因在鹿茸生长后期(三杈茸)表达量显著增高,这种上调表达暗示了其在鹿茸骨化过程中发挥重要作用,说明其可能是鹿茸骨化相关候选基因。

羽衣甘蓝BoLMI基因的克隆及时空表达分析

【目的】探究羽衣甘蓝裂叶表型形成的分子机制,研究BoLMI基因对裂叶形成的作用。【方法】以裂叶羽衣甘蓝DH系为试验材料,利用同源克隆技术,成功获取基因完整的cDNA序列,将其命名为BoLMI。【结果】序列分析发现,BoLMI基因全长531个碱基对,共编码176个氨基酸,其蛋白分子量为20 789.35 Da,理论等电点为7.24。根据Pfam保守结构域分析,BoLMI蛋白包含homeobox保守结构域。系统发育分析结果显示,羽衣甘蓝的BoLMI基因与甘蓝型油菜以及结球甘蓝的BoLMI基因同属于一个分支,亲缘关系较近。BoLMI蛋白是位于细胞核内的可溶性蛋白,包含1个跨膜结构域,无信号肽序列。qRT-PCR分析表明,BoLMI基因在裂叶羽衣甘蓝的幼苗期表达水平较高,在莲座期表达水平较低;在羽衣甘蓝莲座期,裂叶品种不同部位叶片BoLMI基因的表达水平均高于圆叶品种,其中在第1片叶的表达量最高。裂叶品种和圆叶品种不同叶片BoLMI基因的表达量差异显著。【结论】推测BoLMI基因在羽衣甘蓝裂叶形成中起重要作用,为加速羽衣甘蓝叶形育种提供了理论基础。

木薯MeMLO12基因克隆及其CRISPR-Cas9表达载体的构建

MLO基因是植物中特有的一类抗病性负调控因子,该基因突变导致植物产生广谱抗病性。本研究从木薯全基因组中克隆获得木薯MLO12基因的DNA和cDNA序列,并将其命名为MeMLO12。该基因全长3743 nt、编码区(ORF)全长1728 nt,具有一个完整的开放阅读框,含有15个外显子和14个内含子,编码586个氨基酸,蛋白的分子质量为67.2 kDa,等电点为8.85。该基因编码的蛋白定位在内质网膜上,无信号肽,在23~45、74~96、161~183、285~307、312~334、371~393、413~435 aa处形成7次跨膜结构域。qRT-PCR定量分析发现,受木薯黄单胞病菌侵染后,MeMLO12基因在木薯抗、感品种中的表达量存在明显的差异,参与木薯与黄单胞菌之间的互作,表现出负调控作用。选择该基因第11个外显子进行Snap Gene Viewer分析,获得了10 455条sgRNA的种子序列,从中选取3条靶序列约23 nt,碱基组成上3'末端含G结尾,将其构建到CRISPR-Cas9载体上,经验证,确认MeMLO12的3条靶序列已经成功构建到基因编辑载体上,将其命名为pSGR-Cas9-AT-MeMLO12载体。

草莓FaWRKY70基因克隆与表达模式分析

【目的】WRKY是植物特异性转录因子家族之一,参与植物多种生命活动,但在草莓中鲜见WRKY70相关报道。深入解析WRKY70同源基因在草莓响应胁迫过程中的作用,加快分子育种技术应用,培育新草莓种质资源。【方法】用同源克隆法从‘红颜’草莓果实中克隆得到FaWRKY70基因,用生物信息学分析其保守结构域、理化性质、蛋白质结构及进化关系等,并结合qRT-PCR数据进行表达模式分析。【结果】FaWRKY70基因全长1020 bp,编码339个氨基酸;同源基因比对发现,FaWRKY70与苹果、牡丹等同科物种氨基酸序列相似度较高,且同源基因多与植物对生物、非生物胁迫响应相关,暗示FaWRKY70可能参与草莓抵御胁迫的过程;FaWRKY70在草莓不同器官中均有表达,且差异显著,在花中表达量最高,在果实中最低;水杨酸处理后,FaWRKY70基因快速响应,表达量在3 h后达到最高,随后逐渐降低;茉莉酸甲酯处理后FaWRKY70基因受诱导响应程度小,整体呈下调趋势。【结论】FaWRKY70能通过不同响应方式参与草莓生命活动及激素信号转导过程。

穿心莲糖苷水解酶基因ApGH的克隆、生物信息学分析及表达研究

目的:对穿心莲糖苷水解酶(ApGH)基因进行克隆、生物信息学分析、原核表达和相对表达量分析。方法:取穿心莲新鲜叶片,提取RNA并反转录为互补脱氧核糖核酸(cDNA)作为模板,以穿心莲转录组中筛选到的糖苷水解酶ApGH基因开放阅读框(ORF)设计特异性引物,进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,经测序后获得的基因序列利用生物信息学软件预测基因编码蛋白特征,构建原核表达载体在大肠埃希菌中诱导表达目的蛋白质,并利用实时荧光定量PCR分析ApGH基因的表达模式。结果:克隆所得ApGH基因的ORF全长1734 bp,编码577个氨基酸(GenBank登录号:OR887606)。ApGH为稳定亲水蛋白质,无信号肽和跨膜结构域,属于糖苷水解酶家族;系统进化分析表明,ApGH归属于GH1家族。将ApGH基因构建到原核表达载体HIS-MBP-pET28a上,在大肠埃希菌Transetta(DE3)中成功表达出重组蛋白质。实时荧光定量PCR检测结果表明,ApGH基因在叶中表达量最高,茎和根中表达量较低。结论:克隆得到穿心莲ApGH基因并对其蛋白质序列特征进行了系统分析,证明其在大肠埃希菌中成功表达重组蛋白质,且主要在穿心莲叶中表达。研究结果为进一步探索穿心莲糖苷水解酶的催化功能提供了依据。

芝麻热胁迫响应基因SiHsfB-2b的克隆及表达特性分析

为探究B类热激转录因子(HSFs)在芝麻耐热性中的分子功能,基于前期转录组分析鉴定到的编码B类HSF家族蛋白HsfB2b的基因序列,以郑太芝3号耐热白芝麻品种为材料,采用同源克隆方法克隆了芝麻SiHsfB-2b基因,对其进行生物信息学分析,同时分析其在芝麻不同器官和热胁迫下的表达特性,并对其进行亚细胞定位。结果表明:SiHsfB-2b基因CDS序列全长为936 bp,编码311个氨基酸;系统进化树分析表明SiHsfB-2b与松蒿、独脚金和锈鳞木樨榄的同源蛋白关系较近,含保守DNA结合结构域;亚细胞定位于细胞核内;SiHsfB-2b基因启动子区域含有13类顺式作用元件,其中与胁迫响应和激素响应相关的各有3类。RT-qPCR分析结果显示,热胁迫可诱导SiHsfB-2b在芝麻根、茎和叶中上调表达,叶中相对表达量最高;在持续高温胁迫下,SiHsfB-2b在芝麻茎和叶中的表达量呈上升趋势,且在胁迫后期的叶中表现出显著上调,而根中的表达量呈现出先上升后下降趋势。综上推测,SiHsfB-2b基因可能通过介导胁迫和激素信号等通路积极响应热胁迫,这可为后期深入研究芝麻耐热性的分子机制奠定理论基础。

枳PtrPP2C51基因克隆与非生物胁迫表达分析

克隆枳PP2C基因家族的PtrPP2C51基因,分析其在低温、高温和干旱等胁迫下的表达规律,探究其在非生物胁迫中的功能。以1年生枳苗为试材,从嫩叶克隆到PtrPP2C51基因cDNA序列,采用生物信息学方法对其进行分析,利用实时荧光定量PCR仪(qRT-PCR)检测枳苗在低温、高温和干旱(15%PEG-6000)处理下的PtrPP2C51基因表达模式。克隆获得PtrPP2C51基因编码区CDS序列长度为879 bp,编码292个氨基酸,其蛋白分子量为31.36 ku,理论等电点4.9,脂肪系数79.52,不稳定系数39.57,亲水性平均值-0.279。PtrPP2C51蛋白的二级结构中α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲占比分别为40.07%、7.88%、18.15%和33.90%。PtrPP2C51蛋白与克里曼丁橘的PP2C蛋白在同一小分支上,亲缘关系最近。经低温(0℃)、高温(38℃)和干旱(15%PEG-6000)3种不同胁迫处理,PtrPP2C51基因的相对表达量均表现持续上调趋势,并且均在处理12 h时表达量达到最高值。PtrPP2C51基因可能参与枳的抗逆胁迫调控机制。

番木瓜环斑病毒甜瓜分离物的基因组及其侵染性克隆

番木瓜环斑病毒(papaya ringspot virus,PRSV)是瓜类作物主要病毒之一,分析了甜瓜分离物HaNHK10的基因组序列和分子变异,构建了具有侵染性的全长cDNA克隆。结果显示,HaNHK10分离物基因组全长为10332 nt,与其他分离物的核苷酸和氨基酸序列一致性分别为74.60%~97.80%和85.30%~98.50%。基于全基因组序列的系统进化分析显示,HaNHK10与来自中国的所有分离物均聚集于II组中,并与中国山东的西葫芦分离物PRSV-SD亲缘关系最近。接种试验显示,HaNHK10分离物的全长cDNA克隆具有侵染性,它能系统侵染甜瓜、黄瓜、西瓜、南瓜、西葫芦和瓠瓜6种作物,经接种产生的病毒后代也能够通过摩擦接种侵染植株。

荔枝蒂蛀虫海藻糖酶基因克隆及生物信息学分析

【目的】海藻糖酶(Trehalase,Tre)是昆虫体内海藻糖代谢的关键酶,通过专一性地将海藻糖分解为葡萄糖,在昆虫能量代谢和生长发育中发挥着重要的作用。旨在克隆荔枝蒂蛀虫(Conopomorpha sinensis Bradley)可溶型海藻糖酶基因(CsTre1)和膜结合型海藻糖酶基因(CsTre2),探讨其在荔枝蒂蛀虫不同发育阶段和不同组织中的表达模式,解析这2个基因及其酶蛋白的分子特征。【方法】利用荔枝蒂蛀虫转录组数据和RACE技术,克隆CsTre1和CsTre2的全长cDNA序列,并应用ORF Finder、ProtParam、SignalP 4.1、ProtScale、NetPhos2.0 Server和IQ-TREE等软件对其进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析CsTre1和CsTre2在荔枝蒂蛀虫不同发育阶段及成虫不同组织的mRNA表达模式。【结果】CsTre1的开放阅读框(ORF)长1701 bp,编码566个氨基酸,蛋白分子量为64.53 kD。CsTre2的ORF长1821 bp,编码606个氨基酸,蛋白分子量为69.08 kD。信号肽预测分析表明,CsTre1和CsTre2前端均有1个信号肽,其位置分别为1-16和1-17。蛋白二级结构分析结果显示,二者均主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,CsTre1有24个Ser、15个Tyr、10个Thr可能成为蛋白激酶的结合位点,而CsTre2有27个Ser、10个Tyr、13个Thr可能成为蛋白激酶的结合位点。RT-qPCR结果显示,CsTre在荔枝蒂蛀虫的蛹和成虫期均有表达。在成虫期中,CsTre1的表达水平远高于CsTre2,且CsTre1在雄成虫第2 d和第5 d的表达水平陡然下降,在雌成虫中则保持稳定高表达。【结论】该研究成功克隆了荔枝蒂蛀虫的2个海藻糖酶基因,其分子特征及表达模式结果表明,CsTre1可能是荔枝蒂蛀虫主要调控海藻糖代谢的基因。研究结果可为阐明海藻糖酶基因的功能提供重要线索,为开展害虫防治策略的研究奠定基础。

野大麦肌动蛋白基因片段的克隆及其表达特征分析

野大麦(Hordeum brevisubulatum)是重要的野生禾本科牧草,具有多种抗逆性。为深入挖掘野大麦的抗逆基因,本研究以RT-PCR法克隆了野大麦肌动蛋白基因(Actin,ACT)的核心片段。采用BLAST序列比对,qRT-PCR实时定量方法对其序列特征和表达特性进行了分析。结果表明,野大麦ACT的基因片段长518 bp,编码171个氨基酸。BLAST分析表明,野大麦的肌动蛋白基因片段与大麦(Hordeum vulgare)ACT基因核苷酸序列的一致性达97%,与ACT蛋白氨基酸序列的同源性达91%,并将其命名为HbACT。与11种相关植物进行ACT氨基酸序列比对发现,HbACT含152个保守氨基酸和19个非保守氨基酸,说明HbACT蛋白具有高度保守性。qRT-PCR分析表明,在不同盐浓度处理条件下,不同处理时间野大麦各器官的HbACT的Ct平均值为19.30,地上部的变异系数为3.5,峰度系数为0.262;地下部的变异系数为5.3,峰度系数为0.409,均属于尖峰分布,Ct值的稳定系数均小于1.7。综上所述,HbACT基因表达稳定,可作为内参基因用于研究野大麦功能基因的表达模式分析。

大白菜BrCYP83B1基因的克隆及表达分析

【目的】细胞色素P450家族是十字花科植物硫苷合成重要的酶系,其中CYP83亚家族主要参与核心结构的合成,旨在探究大白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis)CYP83B1基因的功能。【方法】利用RT-PCR技术克隆BrCYP83B1基因,通过生物信息学软件分析其编码蛋白理化性质、同源性及启动子顺式作用元件,利用RT-qPCR技术分析BrCYP83B1的表达模式,并构建其植物超表达载体。【结果】BrCYP83B1 cDNA序列全长为1500 bp,编码499个氨基酸,编码蛋白属于细胞色素P450超家族,主要定位于细胞质,二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,与甘蓝型油菜、青花菜的CYP83B1蛋白具有较高的同源性。启动子分析表明,该基因启动子区域包含水杨酸、脱落酸及茉莉酸甲酯等激素响应的顺式作用元件,说明BrCYP83B1基因表达可能受激素调控。RT-qPCR分析结果表明,BrCYP83B1基因在大白菜的根、茎、叶、花和果中均有表达,且以叶中的表达量最高;茉莉酸甲酯够显著促进该基因的表达,而水杨酸处理对其表达具有一定的抑制作用,脱落酸处理下基因先上调后又下调。【结论】BrCYP83B1可能参与大白菜对激素的响应调控。

灰毡毛忍冬bZIP25基因的克隆及其表达模式分析

目的克隆灰毡毛忍冬bZIP25基因序列全长,并进行生信分析及表达模式分析,以初步探索其在灰毡毛忍冬中的生物学功能。方法通过逆转录PCR技术克隆bZIP25基因的序列全长,采用生物信息学分析方法对bZIP25及其编码的蛋白进行分析。运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术测定其在茎、叶及七个花期花中的表达水平。结果克隆得到LmbZIP25基因(OR551766),其编码191个氨基酸,具有典型的bZIP家族结构,在bZIP结构域中与其他植物同源性较高。LmbZIP25基因具有组织特异性,在茎中的表达量显著高于花和叶,在七个花期中黄色花蕾期的表达量最高。结论克隆得到LmbZIP25基因全长,分析其在不同器官和不同花期的表达差异,为进一步探索其在灰毡毛忍冬中花发育中的功能奠定了研究基础。

马铃薯野生种烯酰水合酶超家族基因ScDHNS的克隆与功能分析

【目的】1,4-二氢氧-2-石脑-CoA合成酶(1,4-dihydroxy-2-naphthoyl-CoA synthase,DHNS)基因是茄科植物糖苷生物碱合成代谢的潜在重要基因,开展马铃薯DHNS基因功能研究与验证,为低糖苷生物碱马铃薯品种(系)的选育提供基因和材料来源。【方法】利用RACE方法克隆得到马铃薯野生种恰柯薯(Solanum chacoense)ScDHNS基因,对其进行生物信息学分析和亚细胞定位,通过构建过表达载体pBWA(V)HS-DHNS转化马铃薯栽培种进行功能验证。【结果】ScDHNS cDNA序列开放阅读框1023 bp,编码340个氨基酸,分子量为37.34 kD,等电点pI为8.592,具有典型的ECH保守结构域,属于烯酰水合酶超家族成员,在二穗短柄草(Brachypodium distachyon)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)等植物基因组中都有其同源基因,且存在基因扩张和收缩事件。过表达ScDHNS基因后发现转化株ScDHNS和SGT1基因表达量显著上调,且表达量显著高于马铃薯WT植株。且对应转化植株的总糖苷生物碱含量显著高于马铃薯WT植株,最高可达到364.3 mg/kg,是对照的2.4倍。亚细胞定位结果显示ScDHNS定位于过氧化物酶体。【结论】马铃薯ScDHNS基因可能参与调控糖苷生物碱合成关键基因SGT1的表达,通过β-氧化途径和甲羟戊酸通路协同影响糖苷生物碱的合成,该基因与糖苷生物碱在亚细胞水平上的区室化有重要关系,对于培育低糖苷生物碱的马铃薯品种(系)具有重要的应用价值。

高邮鸭Akt1基因克隆及生物信息学分析

Akt1是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族基因,通过响应生长因子刺激磷酸化一系列下游底物来调节许多过程,包括代谢、增殖、细胞存活、生长和血管生成等。实验室前期对全转录组差异分析获得了与高邮鸭双黄蛋率显著相关的候选关键基因Akt1,并且Akt1显著富集于差异表达信号通路——PI3K-AKT信号通路。为了对高邮鸭双黄蛋候选基因Akt1进行系统的功能研究,本研究通过PCR技术克隆高邮鸭卵巢组织Akt1全长,构建了Akt1-EGFP融合表达载体,结合生物信息学技术对AKT1蛋白的理化性质进行系统分析。结果:AKT1为种间保守型非分泌蛋白,表达于质膜,具有丰富的丝氨酸和苏氨酸磷酸化位点,可与10种蛋白(TSC1、MAPK1、PIK3R1、PIK3CA、TSC2、CDKN1A、IKBKB、PIK3CD、PDPK1和ILK)发生互相作用。研究结果为揭示Akt1基因编码的蛋白在调控高邮鸭双黄蛋形成过程中的功能和分子机制提供理论基础。

双孢蘑菇中一种4R型MYB转录因子的基因克隆和生物信息学分析

MYB转录因子广泛存在于真核生物中,在植物的生长发育、逆境胁迫等过程中发挥重要作用。与植物相比,对食用菌中MYB转录因子的研究有限。为探究MYB转录因子在食用菌中的生物学功能,对前期转录组发现的一个编码双孢蘑菇(Agaricus bisporus)MYB转录因子的基因进行克隆和生物信息学分析。结果表明,该基因编码区长1209 bp,翻译402个氨基酸;编码的蛋白分子量为45.95 kDa,等电点9.17,是一种不存在跨膜结构、不含信号肽的亲水性蛋白,具有4个高度保守的SANT结构域,属于4R型MYB转录因子,与白环蘑(Leucoagaricus)中的4RMYB转录因子亲缘关系最近;二级结构预测显示以无规则卷曲和α-螺旋结构为主;亚细胞定位分析显示该转录因子位于细胞核中;此外启动子序列分析表明,该基因启动子区域含有多个与生物抗逆应答、激素响应等相关的顺式作用元件。

酿酒酵母液泡电导1的抗原表位预测及抗原编码基因的克隆

为了制备酵母菌液泡电导1(Yvc1)的抗原蛋白,本文首先通过生物信息学方法预测Yvc1抗原表位,并克隆其抗原编码基因。利用NCBI GenBank数据库、ORP Finder、EXPASY ProtScale、SOPMA、IEDB和NetMHCⅡpan等生物信息学工具对酿酒酵母S288c的Yvc1抗原表位进行预测,并根据预测的结果设计引物并克隆其抗原编码基因。结果显示,YVC1基因全长2028 bp,有33个开放阅读框,最长一个被通读的序列,编码675个氨基酸。Yvc1分子量7.7937×10^(4),属于稳定、亲水性蛋白质;该蛋白含有4个膜外区域,亚细胞定位于液泡膜;二级结构中的无规则卷曲和β转角分别占29.48%和3.11%;分别含有5个B细胞优势抗原表位和2个Th优势表位区域;最终预测,优势抗原表位在1~236位氨基酸区域。扩增的酿酒酵母DL5168抗原编码基因序列与预测抗原的基因序列487707~489734 bp位点的相似性达到99%。本研究表明,生物信息学方法成功预测并克隆到Yvc1抗原编码基因,这为其抗原蛋白制备奠定基础。

论非法植入基因编辑、克隆胚胎罪保护法益

随着世界范围内基因编辑技术的发展,人类有了攻克遗传疾病的希望。但是“基因编辑婴儿”案的出现,使我们必须思考如何通过法律来防范基因编辑技术对人类生活的冲击。在刑法规制层面,准确把握非法植入基因编辑、克隆胚胎罪的保护法益是进一步思考的前提。既往的研究将该罪法益限定为人性尊严、医疗秩序或人类遗传安全,但这并非真正的适格法益,无助于法益机能的发挥。合理界定该罪法益的方向应当是综合分析规范目的、法益性质、价值判断以及行为对象。基于以上方法,将非法植入基因编辑、克隆胚胎罪的保护法益确定为人类遗传基因具有合理性。该法益界定一方面明确了“情节严重”的类型,另一方面可以作为出罪事由的判定标准,划定了犯罪行为与科研行为的界限。

海洋链霉菌酮合成酶结构域基因的克隆及分析

海洋链霉菌通过聚酮合酶(PKS)合成许多结构和功能多样且具有药用价值的聚酮化合物(PKs),酮合成酶结构域(KS)作为PKS的核心结构域,可催化底物与伸长的聚酮之间的脱羧缩合,在聚酮化合物生物合成中起着重要作用。本文通过对从海洋链霉菌Streptomyces sp.X66基因组DNA克隆获得的ks基因的生物信息学分析表明,该ks基因序列长945 bp,BLAST序列比对显示其具有典型的酮合酶结构域的功能区域。理化分析显示其拟编码309个氨基酸,理论等电点为6.60,原子组成为C1401H2239N425O419S8,不稳定指数为42.11,平均亲水系数为0.112,编码产物为酸性疏水不稳定蛋白,且不含信号肽和跨膜结构,二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主,SDS-PAGE显示其分子量约为55 kDa。通过对ks基因的研究,为进一步解析聚酮化合物合成代谢中的调控机制及组合生物学和体外酶系合成聚酮化合物提供参考。

芍药PlHDR基因的克隆及生物信息学分析

为了预测芍药4-羟基-3-甲丁-2-烯基二磷酸还原酶(PlHDR)基因的功能,以芍药叶为材料,基于RT-PCR技术克隆了芍药PlHDR基因并对其进行了序列分析,用生物信息学软件预测了PlHDR的物理化学性质及结构特征。结果表明,芍药PlHDR基因cDNA全长1559 bp,共编码462个氨基酸,分子量52.11 kDa,等电点为5.46;芍药PlHDR与喜树HDR亲缘关系最近,氨基酸相似性高达87.45%;芍药PlHDR是定位于叶绿体内的亲水性蛋白,不存在跨膜结构域及信号肽,含有5个糖基化位点和50个磷酸化位点;二级结构中α-螺旋和无规则卷曲分别占比48.48%和29.22%;3D结构预测为单体;芍药PlHDR与HDS、DXR、CDPMEK、MK和MVD1等蛋白存在相互作用。本研究报道了芍药PlHDR基因序列并对其进行了生物信息学分析,为进一步开展该基因在芍药萜类物质合成中的功能研究奠定了基础。

钩藤UrTSA基因克隆及组织表达特异性分析

【目的】克隆钩藤碱的合成关键酶即色氨酸合成酶α链基因(UrTSA),并分析其组织表达特异性,为探究该基因的钩藤碱生物合成机制提供理论参考。【方法】从生物项目数据库(BioProject)筛选得到钩藤碱的生物合成相关酶基因UrTSA,以钩藤的根、叶、茎钩和蒴果的cDNA为模板,PCR克隆UrTSA基因的开放阅读框(ORF),并进行生物信息学分析,结合实时荧光定量PCR检测UrTSA基因在钩藤不同组织中的表达模式。【结果】UrTSA基因的ORF为963bp,编码320个氨基酸残基,相对分子量为33924.49Da,理论等电点(pI)为9.11,不稳定指数Ⅰ为33.50,脂溶指数为102.12,总平均亲水性指数为0.117,说明UrTSA蛋白为稳定、脂溶性好的疏水蛋白。UrTSA蛋白亚细胞定位于叶绿体,不含信号肽和跨膜区,为非分泌型蛋白;不具有潜在的糖基化位点,有30个潜在的磷酸化位点,包括16个丝氨酸(Ser)、13个苏氨酸(Thr)和1个酪氨酸(Tyr);二级结构由α-螺旋(43.44%)、无规则卷曲(31.87%)、延伸链(15.94%)和β-折叠(8.75%)组成。UrTSA蛋白与其他11个植物物种的TSA蛋白具有较高的氨基酸序列相似性(69.78%~92.77%),其中与阿拉比卡咖啡(Coffeearabica)和欧基尼奥伊德斯种咖啡(Coffeaeugenioides)TSA蛋白的亲缘关系较近。UrTSA基因在钩藤的根、叶、茎钩和蒴果中均有表达,其中在蒴果、根和叶中相对表达量均极显著高于茎钩中的相对表达量(P<0.01),分别是茎钩的2.17、1.58和1.20倍。【结论】UrTSA基因具有组织表达特异性,主要在蒴果钩藤碱合成中发挥调控作用,为后续研究钩藤碱在钩藤中不同部位的累积及其生物合成途径提供思路和线索。