韦塞尔斯布朗病病毒RT-PCR快速检测方法的建立及应用

为实现对韦塞尔斯布朗病病毒(Wesselsbron virus,WSLV)的快速检测,根据WSLV NS5基因保守序列,设计特异性扩增引物和探针,建立WSLV的TaqMan荧光定量RT-PCR和RT-PCR检测方法,并验证方法的敏感性、特异性及临床可行性。结果显示:所建立的两种方法的核酸检测下限分别为10、100 copies/μL,对日本脑炎病毒、西尼罗病毒和坦布苏病毒核酸均无交叉反应;分别利用建立的两种检测方法对100份入境马匹样品进行检测,未检出WSLV阳性,与南非参考实验室提供的双重荧光RT-PCR检测方法结果一致。结果说明,所建的两种方法敏感性高、特异性强,可用于临床样本检测,为韦塞尔斯布朗病的出入境检验检疫、流行病学调查及防控提供了技术支撑。

十字花科蔬菜芜菁花叶病毒的RT-PCR快速检测

利用RT PCR技术 ,建立了一种简便、快速、准确地检测十字花科蔬菜芜菁花叶病毒的方法。应用该方法 ,不需复杂的提取、纯化病毒RNA过程 ,直接对田间病样简单处理后进行RT PCR检测。通过获得包含该病毒CP基因的cDNA片段 。

RT-PCR快速检测口蹄疫病毒

根据口蹄疫病毒VP1基因的序列 ,设计了 1对引物 ,建立了检测口蹄疫病毒的RT -PCR方法。对FMDV各毒株检测 ,结果均为阳性 ,而对猪病毒性疾病相关病毒进行检测 ,结果均为阴性 ;检测 19份已知阳性样品 ,检出率 10 0 % ;与动物接种试验比较 ,符合率 10 0 % ,证明该方法特异。与经典方法动物接种试验比较 ,其灵敏度提高10 0倍左右 ;对O3I3株的细胞毒进行检测 ,其敏感度达 10个TCID50 。初步结果表明所建立的RT

荧光定量RT-PCR快速检测B型流感病毒的研究

目的:利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测B型流感病毒的方法。方法:根据B型流感病毒HA基因的相对保守序列分别设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立、优化反应体系后,利用10倍稀释法检验方法的灵敏度并建立相对定量标准曲线;特异性检验后利用临床标本与普通RT-PCR法进行比较。结果:B型流感病毒检测反应的灵敏度为5.0×10-6TCID50,标准曲线相关系数为0.998,扩增效率为107.8%,5种非B型流感病毒病原体检测均为阴性,说明此方法具有很好的稳定性、重现性和特异性。结论:本研究建立荧光定量RT-PCR技术可以准确检测B型流感病毒,不仅灵敏度高、稳定性好,而且可以对病毒滴度进行定量检测。

应用Taq Man荧光定量RT-PCR快速检测肠道病毒的研究

目的建立一种快速、灵敏、特异的荧光定量RT-PCR检测肠道病毒的方法。方法根据GenBank中肠道病毒5′UTR序列,应用生物软件在保守区设计与筛选特异引物和TaqMan探针,对荧光定量RT-PCR反应体系与条件进行优化,验证方法的特异性、敏感性和重复性。并通过对急性临床样本的检测,评价该方法的实际应用价值。结果该方法对肠道病毒包括脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型及柯萨奇病毒和埃可病毒等的检测有高度特异性,甲肝病毒、乙脑病毒、登革病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、诺如病毒等均呈阴性。该方法的检测下限达10-1TCID50/100μl。12份急性结膜炎病例结膜拭子标本中7份肠道病毒核酸阳性,普通RT-PCR方法5份阳性。结论TaqMan荧光定量RT-PCR方法快速、敏感、特异,适于肠道病毒的快速检测。

利用RT-PCR快速检测马铃薯X病毒(PVX)

采用TR IZOL试剂盒和异硫氰酸胍法2种方法提取了带PVX马铃薯试管苗的总RNA。根据设计好的1对特异性引物,运用反转录PCR技术对提取的总RNA进行了体外扩增。结果表明,所用2种方法都能有效地提取马铃薯RNA,并适合于反转录合成病毒cDNA,得到了与预期大小相一致的720 bp片段,而对照未得到任何产物。但利用TR IZOL试剂盒进行RNA提取价格较贵,而异硫氰酸胍法所用试剂可自己配制,方法灵活,价格较TR IZOL试剂盒便宜。从而建立了经济简便的PVX RT-PCR检测体系,为PVX的防治、脱毒种薯和核心种苗的检测提供有效手段。

Taq Man荧光定量RT-PCR快速检测甲3型流感病毒

目的建立一种特异、灵敏、快速的荧光定量RTPCR方法用于检测甲3型流感病毒核酸。方法根据GenBank登录的流感毒株序列,应用生物学软件进行序列比对,在甲3型流感病毒血凝素(HA)基因的保守区设计引物和TaqMan探针、并进行筛选。对荧光RT-PCR反应条件进行优化,检测该方法的特异性和灵敏度。并对疑似流感含漱液标本进行检测。结果该方法对甲3型流感病毒的检测有高度的特异性,对甲1型、乙型、禽流感病毒H5、SARS病毒及其他呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.01TCID50,可从疑似流感患者含漱液中直接检测流感病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右。结论本研究建立的TaqMan荧光定量RTPCR是一种快速检测甲3型流感病毒特异、敏感的新方法。

PVY^N与PVY^O病毒RT-PCR快速检测体系研究

马铃薯Y病毒(PVY)是侵染马铃薯的重要病毒之一,严重影响马铃薯的生产。本文通过对PVY病毒N株系(PVYN)与O株系(PVYO)的基因序列进行比较,在其外壳蛋白同源区设计一对通用引物,建立了PVY病毒的RT-PCR检测体系。另外在N株系与O株系同源区设计一条3′引物,选择N株系与O株系差异区设计两条5′端引物,建立了可鉴定PVYN与PVYO的复合RT-PCR体系。这个体系的建立,对于马铃薯脱毒苗的检测与PVY病毒的调查及病理研究都具有一定的应用价值。

RT-PCR快速检测牛病毒性腹泻病毒方法的建立与应用

根据已发表的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5'-UTR序列,设计1对特异性引物,建立了快速检测BVDV的RT-PCR方法。利用该方法能从BVDV中扩增出196bp特异性目的片段。应用此方法检测了26份疑似病例临床样品,14份为阳性。试验表明,该方法特异性强、敏感性好,能检测到1pg的病毒RNA,是一种快速准确的检测方法。

RT-PCR快速检测猪繁殖与呼吸综合征临床组织样品的研究

根据猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)已发表的核苷酸序列 ,在其核衣壳蛋白基因 (ORF7)保守区设计了一对跨幅约 380bp的特异性引物N1/N2 ,对已知PRRSVJK10 0 1毒株和PRRS临床病料进行RT PCR扩增 ,均扩增出约 380bp的特异片段。用此方法检测 5份疑似PRRS病例肺组织病料 ,结果均为阳性 ,对 2个阳性样品扩增产物进行克隆、测序 ,全长均为 372bp ,与PRRSVVR 2 332毒株ORF7同源性为 95%,证实为PRRSV的核衣壳蛋白基因。结果表明 ,建立的RT PCR检测PRRS临床组织病料特异、快速 。

蓝莓休克病毒的RT-PCR快速检测方法建立

以蓝莓叶片为试材,提取病毒RNA,根据已报道的蓝莓休克病毒(Blueberry shock virus,BlShV)外壳蛋白基因序列设计特异性引物,建立RT-PCR快速检测方法,并对采集的20份疑似病例进行检测。结果表明:建立的RT-PCR方法具有良好的特异性和较高的灵敏度。仅从感染BlShV的样品中扩增出与预期大小相符的特异性目的片段,而从其它蓝莓病毒及健康样品中未扩增到目的片段;该方法能检测到RNA原液的10-4倍稀释液,灵敏度较高。疑似病例检测结果与ELISA验证结果完全相符。试验表明,建立的RT-PCR方法能够用于BlShV的现地检测。

猪瘟病毒荧光RT-PCR快速检测方法的建立

以猪瘟病毒5′端非编码区为靶核酸序列设计引物和探针,建立了一步法荧光RT-PCR检测猪瘟病毒。荧光RT-PCR仅检测出猪瘟C株、T株,未能检测出牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪呼吸系统冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、PK-15细胞和牛睾丸原代细胞;对猪瘟病毒T株的扩增反应产物进行了测序分析,与预期序列相符。荧光RT-PCR的检测极限可达到1 TCID50/mL,整个试验流程只需2 h。采用荧光RT-PCR和抗原捕获ELISA同时检测临床病料、猪副产品共207份样本,两种方法的检出率分别为17.4%和13.5%,两者符合率为95.7%(198/207);荧光RT-PCR的检出率高于ELISA,两者差异显著。结果表明,建立的荧光RT-PCR可用于猪产品、临床病料中猪瘟病毒的快速检测。

RT-PCR快速检测腮腺炎病毒

目的 建立腮腺炎病毒的核酸快速诊断技术。方法 在腮腺炎病毒核蛋白基因 (NP)的保守区域设计一对半引物 ,采用逆转录聚合酶链 (RT -PCR)和半巢式PCR方法扩增腮腺炎病毒特异性核酸片段。结果 该方法能特异性地扩增腮腺炎病毒 3 5 7bp和 2 3 2bp的核酸片段 ,而对麻疹、风疹和流感病毒无交叉反应。检测腮腺炎病毒的灵敏度 ,1次PCR可检测出 10CCID50 ,2次PCR反应可达 0 1CCID50 。采用该方法从流行性腮腺炎患者含漱液标本中能直接检出腮腺炎病毒核酸条带。结论 该方法能特异、敏感地检测临床标本中腮腺炎病毒 。

烟草芜菁花叶病毒的ELISA和RT-PCR快速检测技术研究

采用间接ELISA和RT-PCR,建立了烟草芜菁花叶病毒(Turnipmosaic virus,TuMV)快速检测的技术体系。间接ELISA测定结果表明,TuMV多抗按1∶3000浓度稀释后,具有较高的检测灵敏度,其检测极限浓度为1∶3215;通过改进RNA提取技术,从少量的烟草病叶中提取出高质量总RNA,进行cDNA合成及PCR扩增,得到一条长度约986 bp的特异PCR扩增产物,与理论设计的大小一致,可有效地对田间烟株进行快速检测。

鸡传染性支气管炎病毒RT-PCR快速检测方法的建立

根据鸡传染性支气管炎病毒(IBV)N基因序列(FJ767920),利用引物软件Premier5.0,设计并合成了1对特异引物,通过RT-PCR扩增条件的优化,建立了一种快速检测IBV的RT-PCR方法。应用该方法成功地从IBV M41和河南株HN99中扩增出318bp的目的片段,而传染性喉气管炎病毒、新城疫病毒及马立克病毒基因组均未扩增出相应的片段。将回收的RT-PCR产物克隆到pGEM-T Easy载体后测序,进一步证实RT-PCR检测方法的特异性。对IBV的最低检出量为0.6pg的cDNA。经初步应用表明,该方法的建立为IBV的早期诊断和临床检测奠定基础。

一步法实时RT-PCR快速检测手足口病肠道病毒

目的探讨实时荧光RT-PCR在手足口病(HFMD)肠道病毒快速检测中的应用价值。方法以实时荧光RT-PCR检测64例临床初诊为HFMD患儿标本中总肠道病毒(EV)、柯萨奇病毒A组16型(CA16)和肠道病毒71型(EV71),用RD细胞、Vero细胞和Hep-2细胞进行病毒分离培养,以免疫荧光法鉴别分离培养的EV71。结果64例标本中,EV(+)/EV71(+)为23.4%(15/64)、EV(+)/CA16(+)为48.4%(31/64)、EV(+)/EV71(-)/CA16(-)为10.9%(7/64)、EV(-)/EV71(-)/CA16(-)为17.2%(11/64)。实时荧光RT-PCR检测为EV71且病毒分离培养出现细胞病变效应的培养细胞经抗EV71单克隆抗体免疫荧光检测均为阳性,未发生细胞病变效应或非EV71的培养细胞均为阴性。结论实时荧光RT-PCR检测HFMD病原具有特异和快速等优点,与病毒分离培养具有较高的一致性,可用于手足口病的早期诊断和鉴别诊断。

荧光定量RT-PCR快速检测乙型流感病毒核酸

目的 建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RT -PCR方法用于检测乙型流感病毒核酸。方法 根据GenBank登录的流感毒株序列 ,应用生物学软件进行序列比对 ,在乙型流感病毒核蛋白(NP)基因的保守区设计引物和TaqMan探针进行筛选 ,对荧光定量RT -PCR反应条件进行优化 ,检测该方法的特异性和灵敏度。此外还对疑似乙型流感含漱液标本进行检测。结果 该方法对乙型流感病毒的检测有高度的特异性 ,对甲1 型、甲3型、禽流感病毒H5、SARS病毒及其他呼吸道病毒均无交叉反应 ,检测的灵敏度达 0 0 1TCID50 ,可从疑似流感患者含漱液中直接检测流感病毒核酸 ,从病毒核酸提取至完成检测仅需 3h左右。结论 本研究建立的TaqMan荧光定量RT -PCR是一种快速检测乙型流感病毒特异、敏感的新方法。

荧光定量RT-PCR快速检测A、B型流感病毒的研究

目的利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测A、B型流感病毒的方法。方法根据A型流感M基因和B型流感HA基因的相对保守序列,分别设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立、优化单一和双重反应体系后,利用10倍稀释法对已知滴度的流感病毒进行梯度稀释,检验方法的灵敏度并建立相对定量标准曲线。结果A、B型流感病毒双重反应的灵敏度为分别为2·56×10-5和5·0×10-5TCID50,标准曲线相关系数分别为0·997和0·998,扩增效率分别为114·1%和107·8%,说明双重反应中A、B型的引物、探针、模板之间无相互干扰,具有很好的稳定性和重现性。结论研究建立的荧光定量RT-PCR技术可以准确同时检测A、B型流感病毒,不仅灵敏度高、稳定性好,而且可以对病毒滴度进行定量检测。

荧光定量RT-PCR快速检测A型流感病毒的研究

目的利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测A型流感病毒的方法。方法根据A型流感M基因的相对保守序列分别设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立、优化反应体系后,利用10倍稀释法检验方法的灵敏度并建立相对定量标准曲线;特异性检验后利用临床标本与传统的血凝抑制法进行比较。结果A型流感病毒检测反应的灵敏度为2.56×10-6TCID50,标准曲线相关系数为0.999,扩增效率为108.5%,5种非A型流感病毒病原体检测均为阴性,说明此方法只有很好的稳定性、重现性和特异性。结论本研究建立荧光定量RT-PCR技术可以准确检测A型流感病毒,不仅灵敏度高、稳定性好,而且可以对病毒滴度进行定量检测。

多重RT-PCR快速检测东南沿海城市生食水产品中致病菌污染状况

为实现生食水产品中致病菌的快速、定量检测,构建了副溶血性弧菌及单增李斯特菌的多重RT-PCR体系。对东南沿海地区的92份生食水产品样品进行检测,并同国标方法进行比对,同时对检测结果的变化趋势进行分析。快速检测结果在36 h后得到,国标方法的结果在3-5 d后得到;经过比对,二者检出率相同,致病菌总体检出率为41.30%:其中副溶血性弧菌检出率为39.13%,单增李斯特菌检出率为20.65%。比对结果表明多重RT-PCR方法具有快速、灵敏、特异性强的优点;对检出率的分析表明东南沿海地区生食水产品中致病菌污染情况较为严重,相关部门应加强管理及控制。