我国不同CMV分离物2b基因片段的RT-PCR扩增及其序列比较

本研究根据黄瓜花叶病毒2b基因的保守序列设计引物,利用一步RT-PCR技术对多个不同寄主和不同地理来源的黄瓜花叶病毒分离物的2b基因片段进行扩增,获得了含该基因全长约90％的cDNA片段(300bp)。序列测定与比较分析结果表明,国内不同CMV分离物2b基因片段核酸序列同源性达93％以上,推测的氨基酸序列同源性超过90％,且均属于亚组Ⅰ。

甲肝病毒减毒株(H_2)RNA的全长RT-PCR扩增

通过ＲＴＰＣＲ技术扩增了甲肝病毒减毒株（Ｈ２）全长ＲＮＡ，并对长片段ＲＴＰＣＲ扩增进行了方法学上的探讨．采用抗血清特异沉淀病毒；盐酸胍酸性酚、氯仿一步法分离纯化病毒ＲＮＡ，可得到高质量的ＲＮＡ样品；以此ＲＮＡ为模板，在无ＲＮＡ酶的逆转录酶作用下，合成单链ｃＤＮＡ；继续以此ｃＤＮＡ为模板，利用３２ｍｅｒ寡核苷酸引物，在Ｔａｑ和ＤｅｅｐＶｅｎｔＤＮＡ多聚酶的作用下进行ＰＣＲ扩增。

RT-PCR克隆人纤溶酶cDNA大片段

目的:以人胎儿肝脏总RNA为模板,克隆人纤溶酶(plasmin)cDNA大片段。方法:采用异硫氰酸胍一步法提取总RNA,RT-PCR技术获取目的基因。结果:成功地扩增出1.74kb的人纤溶酶基因,并研究了扩增人纤溶酶cDNA大片段的特定实验条件。结论:为克隆cDNA大片段研究提供了简便、快速的方法。

一种利用RT-PCR特异扩增甲型流感病毒HA基因多变区片段并测序确定分型的方法

针对甲型流感病毒HA基因的H1,H2,H3,H5,H7和H9亚型的序列特征,设计专用PCR引物,通过RT-PCR特异扩增相应片段并测定序列,可以准确地区分H1和H3感染人类的流感病毒及其亚型.这种基于流感病毒核酸序列测定的特异性检测方法,不仅可以用于新型甲型H1N1病毒的快速确诊和分型,并且还可推广应用于今后其他流感病毒或具有爆发潜力的新型流感病毒的监测.

VEGF-C真核表达载体的构建及蛋白表达

目的 构建人血管内皮生长因子(VEGF- C)编码序列基因真核表达载体,为探讨VEGF- C的生物学功能奠定基础。方法 根据已公布的序列设计引物,用PCR方法从肿瘤细胞株cDNA中扩增出人VEGF- C编码序列基因片段,测序正确后用限制性内切酶将目的片段插入PcDNA3.1/V5 His TOPO载体中。采用酶切和PCR鉴定后通过脂质体介导转染至CHO细胞中进行瞬时表达。结论 经RT -PCR扩增转染细胞cDNA和Westernblotting检测证实重组质粒pcDNA3.1 VEGF- C能在宿主细胞中高效表达。

ClassⅡ基因型Ⅶd亚型强毒引起鸡新城疫的诊断

2010年2月江苏省大丰市某农户散养的草鸡发病,病鸡主要表现为精神萎顿,食欲减退,呼吸困难,运动失调,排黄白色粪便,经临床和实验室诊断确诊为新城疫（ND）。将分离到的新城疫病毒（NDV）通过RT-PCR扩增F基因后测序及绘制系统发生树分析，表明该鸡群感染的新城疫病毒为ClassⅡ基因型的Ⅶd亚型强毒。诊断情况如下：

猪NPY受体Y1 cDNA的克隆及分析

[目的]研究猪NPY-Y1受体在猪激素分泌及发育生理功能中的调节作用。[方法]从初情期的苏姜猪母猪中提取下丘脑组织总RNA,RT-PCR扩增出NPY-Y1 cDNA,扩增产物克隆入pGEM-T easy载体中进行序列测定。[结果]试验扩增产物与GeneBank公布的猪NPY-Y1序列比较,其同源性达到100%。[结论]为下一步研究猪NPY-Y1基因的生理功能和作用机理奠定了基础。

大鼠背根神经节P2Y1与P2Y4嘌呤受体的表达比较

目的:探讨P2Y1和P2Y4亚基在大鼠背根神经节(D R G)神经元的表达。方法:应用组织水平和多细胞水平R T-PC R方法从不同角度检测了P2Y1和P2Y4受体的表达情况。结果:两种R T-PC R扩增结果均显示:P2Y1亚型有特异性表达阳性条带出现,而P2Y4亚型则无特异性表达条带出现。结论:大鼠D R G的大、中、小细胞中均有P2Y1亚型表达,而无P2Y4亚型的表达。

AIF重组质粒的构建、表达和功能的研究

目的构建人凋亡诱导因子(AIF)基因功能片段的真核表达载体pcDNA3.1(+)AIF,并初步研究AIF在细胞凋亡中的作用。方法从人细胞中提取总RNA,RTPCR扩增AIF基因片段;克隆到pMD18T载体上,通过酶切和测序进行鉴定;将AIF基因片段插入pcDNA3.1(+),构建真核表达载体;电转化淋巴母细胞Raji细胞,观察AIF的表达水平和功能。结果成熟AIF蛋白分子在真核细胞中表达,并转移到细胞核中,诱导Caspase非依赖性细胞凋亡。结论成功构建了pcDNA3.1(+)AIF真核表达载体,AIF在Caspase非依赖性细胞凋亡中发挥重要作用。

流感病毒泰山分离株H1N1亚型血凝素HA1基因特征分析

目的分析泰安市2005～2008年流感病毒H1N1亚型的基因特征及抗原变异情况，为流感防治提供技术支持。方法采集流感样病例的鼻咽拭子标本，用MDCK细胞进行流感病毒的病原分离，采用红细胞凝集试验测定病毒的滴度，用血凝抑制实验和RT-PCR进行流感病毒型别鉴定，通过RT-PCR扩增血凝素HA1片段的基因，电泳、纯化后进行基因序列测定，利用生物信息学进行序列分析。

抗人膀胱癌单克隆抗体重链可变区基因的克隆及其原核表达载体的构建

目的 克隆抗人膀胱癌单克隆抗体重链可变区基因(VH)，并构建其原核表达载体。方法从能分泌抗人膀胱癌单克隆抗体的杂交瘤细胞BDI-1中提取总RNA，通过RT-PCR扩增出VHcDNA。用HindⅢ和XhoⅠ酶切纯化的RT-PCR产物和原核表达载体pET28a(+)，在T4DNA连接酶作用下室温连接。重组质粒经酶切鉴定，阳性克隆测序并进行序列分析。结果扩增出VHcDNA片段，大小约为370bp，重组质粒的酶切鉴定结果与预期一致。VH基因序列长度为366bp，编码122个氨基酸。VH基因属于鼠免疫球蛋白重链11亚类。结论成功克隆出抗人膀胱癌单克隆抗体重链可变区基因，并成功构建其原核表达载体。

1株塞内卡病毒A型的基因组序列与演化分析

旨在分析塞内卡病毒A型(Senecavirus A,SVA)CH-HNCY-2019株的基因组特性和演化,参考SVA毒株SVV-001(GenBank No.NC011349)全基因组序列设计8对引物,通过RT-PCR扩增和测序获得SVA CH-HNCY-2019株全基因序列并进行序列分析。结果显示,SVA分离株CH-HNCY-2019基因组全长为7294个核苷酸,与中国分离株核苷酸相似性为95.9%~99%,与美国经典株SVV-001核苷酸相似性最低。CH-HNCY-2019与大多数中国2017—2018年分离毒株亲缘关系较近,处于同一分支,而与中国2015—2016年分离株亲缘关系较远。与包括2019年中国广东4个SVA分离株在内的其他国内外分离株相比,CH-HNCY-2019的VP1蛋白的722位氨基酸由L突变为Q;VP3蛋白的499位氨基酸由A突变为V,528位氨基酸由P突变为S,582位氨基酸由E突变为K。本研究成功获得1株SVA CH-HNCY-2019全基因组序列,研究结果提示,SVA中国流行株具有多样性,而且在不断地演变,应加强SVA的分子流行病学调查、生物安全措施和疫苗研发以防止SVA在我国猪群中的广泛传播。

一株塞内卡病毒A全基因组序列测定与致病性分析

本研究旨在明确塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)FJLY株的基因组特性及其与其他毒株的同源性关系,并了解SVA-FJLY株的致病性。以分离自福建省某养殖场中的一株SVA-FJLY株为研究对象,参照其原型毒株SVV-001(GenBank No.DQ641257.1)全基因组序列设计5对引物,通过RT-PCR扩增、测序、拼接,获得SVA-FJLY株全基因组序列并进行序列分析;并通过滴鼻攻毒3~4周龄仔猪。结果表明,SVA-FJLY株基因组全长7275 bp(不包括PolyA),SVA-FJLY株基因组存在一个多聚蛋白、VP1蛋白和VP2蛋白。SVA-FJLY株与参考毒株之间的基因组一级结构有较高的相似性,与HeB01-2017株(MF967574.1)相似性最高,达98.5%;而与SVA原型毒株SVV-001株(DQ641257.1)的相似性较低,为93.9%。SVA-FJLY株与国内几个毒株属于同一个分支,与国内的HeB01-2017株亲缘关系最近,同时与国外Colombia-2016株(KX857728.1)的亲缘关系最近。通过动物试验发现试验组猪攻毒10 d后,试验组2/3发病,对照组3/3正常,未出现仔猪死亡。通过全基因组序列测定获得了SVA-FJLY株全基因组序列并进行序列分析,明确SVA-FJLY株的基因组特性及其与其他毒株的相似性关系,了解了SVA-FJLY株的致病性,为SVA的反向遗传学和疫苗的研制提供参考依据,同时也丰富了SVA的基因组信息数据库。

前列腺特异性膜抗原RNA探针的制备

从前列腺癌细胞系 LNCa P中提取总 RNA,经 RT-PCR扩增前列腺特异性膜抗原 (PSM)靶序列 ,将其定向插入带 T7RNA聚合酶启动子的 p SPORT1质粒 ,转入大肠杆菌 DH5 α,经蓝白斑筛选获得重组质粒 .以此重组质粒线性化 DNA为模板 ,以地高辛标记的 r UTP及其他三种 r NTP为底物 ,经 T7RNA聚合酶体外转录 ,成功地制备了地高辛标记的 PSM特异性 RNA探针 ,为研究以 PSM为分子生物学指标的前列腺癌分期诊断奠定了基础 .

辽宁省乙型脑炎病毒分离及进化树分析

目的分离鉴定2007年辽宁省蚊虫携带流行型乙型脑炎(乙脑)病毒及基因型别。方法用细胞培养方法分离病毒,对致金黄色地鼠肾细胞系(BHK-21)细胞病变(CPE)的病毒进行逆转录-聚合酶链式扩增(RT-PCR)检测;扩增的目标片段进行序列测定;用Mega3.1软件、以邻位相连法构建进化树。结果共分离到22株病毒,RT-PCR检测结果表明,均为乙型脑炎病毒;随机选择其中3株病毒的基因序列进行基因型鉴定分析,均为Ⅰ型乙型脑炎病毒。3株病毒E基因编码结构域(Domain)区段分析结果显示,其核苷酸和氨基酸同源性分别为99.3%和100%;与疫苗株SA14-14-2的Domain区相比,共有12个氨基酸位点变异。结论辽宁省蚊虫标本中分离的病毒均为基因Ⅰ型乙型脑炎病毒,其中E基因所编码Domain区E-327(S→T)位点发生的变异,提示在辽宁省首次分离到乙型脑炎病毒变异株。

四川某猪场猪蓝耳病感染情况检测分析

为了解四川某猪场猪蓝耳病的感染和带毒情况,本试验采集未免疫过蓝耳病疫苗的3~4个月大架子猪的血液样本,用间接ELISA方法检测猪血清中的蓝耳病抗体,同时根据猪蓝耳病病毒ORF6基因设计引物,进行RT-PCR扩增。结果显示:蓝耳病ELISA抗体阳性率为63.4%(149/235);19份血液样本中,RT-PCR扩增出阳性1份,阳性率为5.26%。说明该猪场存在猪蓝耳病病毒感染,且架子猪的感染率较高,需要采取进一步防控措施。

实验兔出血症病毒检测方法的建立与免疫效果调查

目的检测全省六个实验兔场的兔子所携带的兔出血症病毒(RHDV)情况,调查实验兔RHDV抗体水平,评价不同疫苗的免疫效果,比较HAI与ELISA两种方法的符合率。方法采用HAI、ELISA方法对1168份实验兔RHDV抗体进行了检测,并与RT-PCR方法的检测结果进行对比分析。结果我省实验兔免疫情况较好,不同饲养场的实验兔免疫合格率虽有不同,但未发生疫情。通过比较发现ELISA法检测的抗体合格率明显高于HAI法。结论LISA、HAI和RT-PCR方法均适合实验兔RHDV的检测。

2017年盐田区禽流感预警监测结果与分析

一、样品采集与检测项目共进行了4次检测样品采集,共采集鸡喉拭子109份分别进行禽流感病毒分离,具体情况见表1。二、检测内容及结果将鸡喉拭子样品做10000xg,4℃,15min离心处理,经0.45μm过滤器过滤除菌,经尿囊腔接种9日龄SPF鸡胚,3枚/份,0.1ml/枚,置37℃孵化机孵化。弃24h内死亡的鸡胚,收集并检测24h至72h的鸡胚尿囊液,进行血凝试验(HA),对HA价达2log以上胚液,分别用H5亚型禽流感HI标准血清、H7亚型禽流感HI标准血清、H9亚型禽流感HI标准血清进行血凝抑制试验(HI)。对HA检测阳性样品鸡胚尿囊液进行RNA抽提,经禽流感(H5、H7、H9)特异性引物进行RT-PCR扩增,检测结果具体情况见表2。