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鸡球虫病7价多表位嵌合重组抗原ET seven真核质粒的构建、表达及其初步功能分析
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作者 倪君丽 刘欣超 +7 位作者 孙栋 方肆云 王定爱 申翰钦 严专强 戚南山 孙铭飞 顾有方 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第11期5159-5172,共14页
为构建以鸡柔嫩艾美耳球虫EtAMA1、EtAMA2、EtMIC3、EtMIC4、EtMIC13、EtROP5和EtSAG1等入侵相关蛋白分子为抗原基础的多表位嵌合重组抗原ET seven真核表达质粒,同时验证其在DF-1细胞中的表达和通过不同辅助递送方式在鸡体内的表达及其... 为构建以鸡柔嫩艾美耳球虫EtAMA1、EtAMA2、EtMIC3、EtMIC4、EtMIC13、EtROP5和EtSAG1等入侵相关蛋白分子为抗原基础的多表位嵌合重组抗原ET seven真核表达质粒,同时验证其在DF-1细胞中的表达和通过不同辅助递送方式在鸡体内的表达及其免疫功能。本研究利用生信分析获得7个抗原表位,分别提取柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段虫体总RNA,通过RT-PCR扩增获得EtAMA1、EtAMA2、EtMIC3、EtMIC4、EtMIC13、EtROP5和EtSAG1等7个抗原的表位区域编码基因,构建基因图谱由公司合成以pcDNA3.1(+)为真核表达载体,构建真核表达质粒pcDNA3.1-ET seven;将鉴定阳性、测序正确的质粒pcDNA3.1-ET seven转染至DF-1细胞,利用RT-PCR和Western blot方法检测ET seven重组基因片段在DF-1细胞中的表达;以磷酸钙纳米颗粒作为辅助质粒递送佐剂检测pcDNA3.1-ET seven在鸡体内引起的细胞因子水平变化,间接ELISA检测特异性IgG抗体水平。结果显示:成功构建真核表达质粒pcDNA3.1-ET seven,RT-PCR和Western blot检测到ET seven的特异性表达,质粒通过磷酸钙纳米佐剂免疫鸡体后,检测细胞因子IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ、CD-40均在三次免疫后7 d高水平表达,其中CD-40与IL-6的表达水平最高。pcDNA3.1-ET seven重组质粒结合磷酸钙佐剂肌肉注射二次免疫后7 d间接ELISA检测特异性IgG抗体呈阳性。结果表明,pcDNA3.1-ET seven重组质粒构建成功,在鸡体内有良好的免疫原性,为鸡球虫病的疫苗防控提供新的思路和技术支撑。 展开更多
关键词 柔嫩艾美耳球虫 多表位重组质粒 真核表达 DNA疫苗
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猪萨佩罗病毒VP1基因重组质粒实时荧光定量PCR标准曲线的建立
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作者 刘熠凡 张静雯 王平利 《河南畜牧兽医》 2024年第3期7-9,18,共4页
为建立用实时SYBRGreenI荧光定量PCR方法检测PSVVP1基因表达量的标准曲线,试验根据目的基因在NCBI上CDS区的序列设计合成引物,用T4连接酶将目的片段与pMD18-T载体连接,构建重组质粒,采用real-time RT-PCR的检测方法,建立了检测猪萨佩罗... 为建立用实时SYBRGreenI荧光定量PCR方法检测PSVVP1基因表达量的标准曲线,试验根据目的基因在NCBI上CDS区的序列设计合成引物,用T4连接酶将目的片段与pMD18-T载体连接,构建重组质粒,采用real-time RT-PCR的检测方法,建立了检测猪萨佩罗病毒VP1基因表达量的标准曲线。试验结果显示,线性回归系数为0.9981,且熔解曲线只有一个峰值,表明由VP1目的基因所建立的标准曲线线性关系良好。试验成功建立了用SYBRGreenI荧光定量RT-PCR方法检测猪萨佩罗病毒VP1基因表达量的标准曲线,为后续检测基因表达量的变化奠定了基础。 展开更多
关键词 PSV 重组质粒 实时荧光定量PCR 标准曲线
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AGK基因启动子重组质粒构建及其在T淋巴细胞白血病中转录活性的研究
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作者 肖晓依楠 王瑞琨 +6 位作者 韩萌 刘思含 禚方圻 陈敏宽 杜祎萌 车永胜 徐小洁 《中国癌症防治杂志》 CAS 2024年第5期586-592,共7页
目的研究T淋巴细胞白血病中酰基甘油激酶(acylglycerol kinase,AGK)上游转录机制,构建AGK基因启动子不同截短片段的重组质粒并检测其转录活性。方法利用TIMER2.0、The Human Protein Atlas、Gene Expression Profiling Interactive Anal... 目的研究T淋巴细胞白血病中酰基甘油激酶(acylglycerol kinase,AGK)上游转录机制,构建AGK基因启动子不同截短片段的重组质粒并检测其转录活性。方法利用TIMER2.0、The Human Protein Atlas、Gene Expression Profiling Interactive Analysis等公共数据库探索AGK在白血病中的作用,以pGL4.20-pAGK promoter-luciferase全长质粒为模板,利用PCR法分别扩增AGK启动子不同长度的截短片段;将扩增片段分别插入pGL4.20-basic载体,构建AGK启动子不同截短片段重组质粒;经双酶切及序列鉴定正确后,将重组质粒电击转染至人T淋巴细胞白血病细胞Jurkat中,采用双荧光素酶报告基因实验测定AGK启动子不同截短片段的双荧光素酶活性。结果AGK在多种类型肿瘤中表达上调(P<0.05),且在白血病细胞中处于较高水平。Log-rank检验结果显示AGK高表达患者的总生存期短于低表达患者(P=0.028)。JASPAR网站预测出3个评分高的转录因子TEAD与AGK的结合区域,并成功构建含AGK基因启动子不同截短片段重组质粒。双荧光素酶报告基因实验发现T淋巴细胞白血病细胞中AGK启动子转录活性在-540bp至-80 bp区域较高。结论人T淋巴细胞白血病细胞中AGK基因启动子在-540 bp至-80 bp区域的转录活性较高,可为进一步研究T淋巴细胞白血病中AGK的转录及其上游调控机制奠定基础。 展开更多
关键词 T淋巴细胞白血病 酰基甘油激酶 转录因子 重组质粒 双荧光酶报告基因
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表达SFTSV Gn基因的重组5型腺病毒的构建与鉴定
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作者 张璇 王新宇 +4 位作者 刘宇婷 涂影叶 梁耀文 易昌华 殷国平 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2024年第9期8-12,17,共6页
为了构建出表达新布尼亚病毒(SFTSV)Gn基因的重组5型腺病毒,试验根据GenBank上发表的SFTSV Gn基因序列(登录号为ADZ04482.1)设计合成引物,采用特异性PCR方法在Gn基因前添加了KOZAK序列和tPA信号肽序列;然后通过酶切、连接等方法构建重... 为了构建出表达新布尼亚病毒(SFTSV)Gn基因的重组5型腺病毒,试验根据GenBank上发表的SFTSV Gn基因序列(登录号为ADZ04482.1)设计合成引物,采用特异性PCR方法在Gn基因前添加了KOZAK序列和tPA信号肽序列;然后通过酶切、连接等方法构建重组穿梭质粒PGA-KOZAK-tPA-Gn,与腺病毒骨架质粒pAd5-ΔE1ΔE3-5E4在BJ5183感受态细胞中进行同源重组,得到重组腺病毒质粒rAd5-KOZAK-tPA-Gn,用PacⅠ酶酶切重组腺病毒质粒,并将线性化的质粒转染至HEK 293细胞中进行病毒包装、扩繁和纯化;采用PCR扩增、Western-blot等技术检测病毒基因的表达情况,并测定重组腺病毒效价。结果表明:通过PCR扩增获得了1 546 bp的KOZAK-tPA-Gn基因,并成功构建了重组穿梭质粒;SFTSV Gn基因在重组腺病毒传代过程中稳定存在;重组腺病毒在HEK 293细胞中表达出分子量约为61 ku的SFTSV Gn蛋白;测得重组腺病毒效价为1×10^(-7.63)/0.1 mL TCID_(50)。说明试验成功构建出表达SFTSV Gn基因的重组5型腺病毒。 展开更多
关键词 新布尼亚病毒 Gn基因 重组5型腺病毒 质粒构建 HEK 293细胞
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人IL-18 cDNA的RT-PCR扩增及其重组质粒的构建
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作者 聂晶 赵洪礼 +5 位作者 刘洪涛 马向杉 王洪军 宋承辉 张伟建 董霞 《沈阳部队医药》 2002年第4期267-268,共2页
为构建人白细胞介素18(IL-18)的重组质粒,用 RT-PCR 技术从健康人外周血单核细胞中扩增出编码人 IL-18的 cDNA,并将此基因定向克隆人表达载体 pBV220中,通过对转化子的筛选得到带有 IL-18插入片段的阳性克隆。经酶切分析及核苷酸测序表... 为构建人白细胞介素18(IL-18)的重组质粒,用 RT-PCR 技术从健康人外周血单核细胞中扩增出编码人 IL-18的 cDNA,并将此基因定向克隆人表达载体 pBV220中,通过对转化子的筛选得到带有 IL-18插入片段的阳性克隆。经酶切分析及核苷酸测序表明,克隆到的基因与文献报道完全一致。表达的重组 IL-18占菌体总蛋白质的20%。表达的蛋白分子量约为18.3kD。表达产物主要以包涵体的形式存在。 展开更多
关键词 人白细胞介素18 重组质粒 逆转录-聚合酶链反应
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MuRF2、PPAR γ1和Ub重组质粒的构建及鉴定
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作者 范玉成 徐方晶 +2 位作者 王锐 何军 景丽 《宁夏医科大学学报》 2023年第3期275-281,共7页
目的 构建过氧化物酶体增殖物激活受体γ亚型1(peroxisome proliferator-activated receptor gamma isoform 1,PPAR γ1)、泛素连接酶肌肉环指状蛋白2(ubiquitin ligase muscle ring finger protein 2,MuRF2)和泛素(ubiquitin,Ub)的重... 目的 构建过氧化物酶体增殖物激活受体γ亚型1(peroxisome proliferator-activated receptor gamma isoform 1,PPAR γ1)、泛素连接酶肌肉环指状蛋白2(ubiquitin ligase muscle ring finger protein 2,MuRF2)和泛素(ubiquitin,Ub)的重组质粒并进行鉴定。方法 根据MuRF2、PPAR γ1和Ub的cDNA序列及GV146和GV417载体质粒上的多克隆位点设计目的基因克隆引物。XhoI/EcoRI内切酶分别双酶切PPAR γ1目的DNA与GV146载体;NheI/BamHI内切酶分别双酶切MuRF2和Ub目的 DNA与GV417载体。用连接酶连接双酶切后的目的 DNA和载体,导入大肠杆菌经筛选获得重组质粒。PCR鉴定重组克隆后进行DNA测序。转染HEK 293T细胞后,于荧光显微镜下观察转染效率;免疫共沉淀实验后用Western blot检测蛋白的表达及蛋白质相互作用。结果 以合成的PPAR γ1、Ub、MuRF2的引物分别对PPAR γ1、Ub和MuRF2的菌落进行PCR扩增,产物大小分别为943、451和1 154 bp,与预期结果一致。测序结果与目的基因序列进行比对分析,证实成功构建出PPAR γ1、Ub和MuRF2的重组质粒。在HEK 293T细胞中共转染His-MuRF2、HA-Ub、PPAR γ1重组质粒,荧光显微镜观察结果提示重组质粒成功转染。免疫共沉淀试验后用Western blot检测可见PPAR γ1、MuRF2和Ub蛋白的有效表达,且验证了MuRF2介导PPAR γ1发生泛素化修饰反应。结论成功构建PPAR γ1、MuRF2和Ub的重组质粒,且三种质粒在HEK 293T细胞中有效表达,验证了MuRF2介导PPAR γ1发生泛素化修饰反应。 展开更多
关键词 过氧化物酶体增殖物激活受体γ亚型1 泛素连接酶肌肉环指状蛋白2 泛素 重组质粒 泛素化修饰
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弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒免疫小鼠后的免疫应答 被引量:17
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作者 郭虹 陈观今 +2 位作者 郑焕钦 周永安 吕芳丽 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 1999年第6期334-337,共4页
目的: 用构建的弓形虫pcDNA3-ROP1 真核表达重组质粒, 直接免疫小鼠, 观察其所诱导的细胞及体液免疫反应。方法: 碱裂解法大量制备pcDNA3-ROP1 质粒, 经肌肉注射免疫BALB/c 小鼠, 每鼠注射100 μ... 目的: 用构建的弓形虫pcDNA3-ROP1 真核表达重组质粒, 直接免疫小鼠, 观察其所诱导的细胞及体液免疫反应。方法: 碱裂解法大量制备pcDNA3-ROP1 质粒, 经肌肉注射免疫BALB/c 小鼠, 每鼠注射100 μg,2 w k 后同量加强免疫1 次, 以pcDNA3 空质粒及生理盐水组为对照。分别于免疫后30 d、50 d、70 d 共3 次用MTT 法测定小鼠脾脏T 淋巴细胞增殖活性及NK 细胞活性; 用间接免疫荧光抗体法测定T淋巴细胞亚群数目;ELISA 法测定IgG 抗体滴度。结果: 用pcDNA3-ROP1 质粒免疫小鼠30 d 后, 脾脏明显增大; 免疫组脾淋巴细胞增殖活性明显高于生理盐水及空质粒对照组。NK 细胞杀伤活性3 次的测定结果免疫组均高于对照组。T 细胞亚群, CD4+ 细胞数与对照组相比较无明显变化, 而CD8+ 细胞数显著增高。血清抗体IgG70 d 内检测结果, 与对照组相比较, 无明显增高; 而免疫后90 d 检测明显增高, 抗体滴度1∶100。结论: 用pcDNA3-ROP1 重组质粒DNA免疫小鼠, 可诱导产生细胞及体液免疫应答。 展开更多
关键词 弓形虫 棒状体蛋白1 重组质粒 DNA 免疫应答
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改善大分子质粒DNA重组效率的新方法 被引量:14
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作者 谭德勇 邓双胜 +1 位作者 孟玲 昝瑞光 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 1997年第3期281-283,共3页
采用两次连接法对一个质粒载体为 7 65kb ,插入子为 1 4 7kb的片段进行重组连接 ,使连接效率大大提高 .此方法对于大分子的质粒DNA重组是非常有效的 .
关键词 DNA 质粒DNA 重组效率 二次连接法
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重组质粒导入根癌农杆菌冻融法的研究 被引量:30
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作者 余云舟 杜娟 +1 位作者 王罡 季静 《吉林农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第3期257-259,262,共4页
对重组质粒导入农杆菌冻融法的几个技术环节进行改进与优化。结果表明:该方案可简便、快速、有效地将重组质粒导入农杆菌,转化效率高、重复性好。应用该改进和优化的标准冻融法将重组质粒pBISP1,pBIP1,pBIAP1和pBISgp120分别导入根癌农... 对重组质粒导入农杆菌冻融法的几个技术环节进行改进与优化。结果表明:该方案可简便、快速、有效地将重组质粒导入农杆菌,转化效率高、重复性好。应用该改进和优化的标准冻融法将重组质粒pBISP1,pBIP1,pBIAP1和pBISgp120分别导入根癌农杆菌EHA105和LBA4404,构建了植物双元表达载体,为用农杆菌介导法进行植物遗传转化提供了良好的载体系统。 展开更多
关键词 植物基因转化 重组质粒 根癌农杆菌 冻融法 转化效率
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产腈水合酶重组大肠杆菌的质粒稳定性研究 被引量:12
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作者 史悦 于慧敏 +1 位作者 田卓玲 沈忠耀 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第8期70-75,共6页
成功构建了腈水合酶(nitrile hydratase,NHase)高表达的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pETNHM(Kanr),研究了重组质粒pETNHM在重组菌株中的质粒稳定性。结果表明,pETNHM具有较好的结构稳定性,连续传代60代后质粒的基因序列没有明显缺失,... 成功构建了腈水合酶(nitrile hydratase,NHase)高表达的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pETNHM(Kanr),研究了重组质粒pETNHM在重组菌株中的质粒稳定性。结果表明,pETNHM具有较好的结构稳定性,连续传代60代后质粒的基因序列没有明显缺失,且能够正常表达腈水合酶。pETNHM具有分离不稳定性,在无抗生素选择压力下,连续传代48代后质粒丢失的无质粒细胞开始出现。琼脂糖凝胶电泳定量分析表明,2/3的质粒pETNHM以二聚体形式存在,导致质粒拷贝数的下降。进一步研究表明,重组细胞的连续高速分裂及腈水合酶的高表达也会造成质粒拷贝数的下降,从而降低其分离稳定性。反之,重组菌株相对于宿主菌株的较高比生长速率有利于保持含质粒细胞的生长优势,卡那霉素的选择压力则能够保证质粒的稳定遗传。 展开更多
关键词 腈水合酶 重组大肠杆茵 质粒稳定性 分离不稳定性 质粒拷贝数 重组大肠杆菌 稳定性研究 大肠杆菌E.coli 琼脂糖凝胶电泳 重组菌株
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新城疫病毒(NDV)HN基因真核表达重组质粒的构建 被引量:9
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作者 仲大莲 余为一 +2 位作者 刘兢 李向明 郭霄峰 《安徽农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第1期34-37,共4页
应用一对自行设计的引物 ,通过反转录 -聚合酶链反应 (RT-PCR)获得新城疫病毒 (NDV) Lasota株的血凝素神经氨酸酶 (HN)基因片段 ,其长度约为 1 .7kb,与已报道的 NDV-HN基因片段大小一致。再将该 HN基因片段定向插入真核表达质粒 pc DNA3... 应用一对自行设计的引物 ,通过反转录 -聚合酶链反应 (RT-PCR)获得新城疫病毒 (NDV) Lasota株的血凝素神经氨酸酶 (HN)基因片段 ,其长度约为 1 .7kb,与已报道的 NDV-HN基因片段大小一致。再将该 HN基因片段定向插入真核表达质粒 pc DNA3中 ,经酶切和测序鉴定 ,表明构建的重组质粒含有 NDV-HN基因片段。 展开更多
关键词 新城疫病毒 HN基因 免疫 真核表达重组质粒 构建 NDV 禽病
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弓形虫P30基因重组质粒的构建及其免疫效果 被引量:14
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作者 龚娅 陈晓光 冯明钊 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第5期282-286,共5页
目的 通过构建含弓形虫P30不同表达形式 (膜型、分泌型及细胞内型 )的重组质粒 ,并将其用于免疫小鼠 ,测定抗体水平 ,以期初步筛选出一种对弓形虫感染具有良好保护作用的核酸疫苗。 方法 利用PCR技术和亚克隆技术分别构建弓形虫表膜... 目的 通过构建含弓形虫P30不同表达形式 (膜型、分泌型及细胞内型 )的重组质粒 ,并将其用于免疫小鼠 ,测定抗体水平 ,以期初步筛选出一种对弓形虫感染具有良好保护作用的核酸疫苗。 方法 利用PCR技术和亚克隆技术分别构建弓形虫表膜型P30基因重组质粒 (含完整的P30编码序列 ,包括信号肽及疏水尾 )pcDNA3 P30Mb ,分泌型P30基因重组质粒 (含完整的P30编码序列 ,不包括疏水尾 )pcDNA3 P30Se以及细胞内型P30基因重组质粒 (含完整的P30编码序列 ,但不包括信号肽 )pcDNA3 P30In。将以上 3种重组质粒分别与脂质体混合后免疫小鼠 ,ELISA及免疫印迹测定小鼠血清中特异的IgG抗体。 结果 成功构建了弓形虫P30基因 3种表达形式的重组质粒 ,经双酶切鉴定及DNA序列测定 ,3种重组质粒中的插入片段确为P30的编码基因 ,且读码框架正确 ;抗体测定显示 :3个免疫组均能诱导小鼠产生特异的IgG抗体 ,但各组之间IgG出现的时间及强度有一定的差异。 结论 用编码弓形虫P30抗原的重组质粒进行核酸免疫 ,能诱导免疫小鼠产生特异性的IgG抗体 ;膜型及分泌型免疫小鼠的特异IgG抗体出现的时间早于细胞内型免疫鼠 ,但 4wk后 3组间差异无显著性。 展开更多
关键词 弓形虫 P30 核酸免疫 重组质粒 免疫效果
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旋毛虫ES抗原特异性蛋白两个结构基因的序列分析及重组质粒的构建 被引量:11
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作者 阎玉河 许威光 +5 位作者 陈辉 马增全 李春华 张洪权 朱元晓 卢景良 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CSCD 北大核心 1996年第1期15-19,共5页
目的:获取旋毛虫ES抗原的结构基因,对其鉴定和克隆,并研制旋毛虫基因重组抗原。方法:先用反转录PCR技术获取目的基因,经序列测定和酶切分析后,再用重组DNA技术分别将目的基因与融合表达载体pEX31C、pEX31B及... 目的:获取旋毛虫ES抗原的结构基因,对其鉴定和克隆,并研制旋毛虫基因重组抗原。方法:先用反转录PCR技术获取目的基因,经序列测定和酶切分析后,再用重组DNA技术分别将目的基因与融合表达载体pEX31C、pEX31B及表达载体pBV220连接,评价在大肠杆菌中的表达效果和鉴定表达产物的特异性。结果:获得了编码ES抗原特异性蛋白成分的两个结构基因(0.7kb和0.95kb),其序列与文献报道的稍有差异。共构建3个重组质粒并在大肠杆菌中表达出相应分子量大小的重组蛋白,均能被猪旋毛虫病阳性血清所识别,但非融合蛋白的特异性强于融合蛋白。在相同条件下,融合蛋白的表达量高于非融合蛋白,而表达蛋白的分子量大小与表达水平呈负相关性。结论:在大肠杆菌中表达的3种重组蛋白是研制旋毛虫基因重组抗原的良好候选抗原蛋白。 展开更多
关键词 旋毛虫 基因 序列分析 重组质粒
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布氏杆菌BCSP_(31)/pVAX1重组表达质粒的构建及其免疫保护效果的研究 被引量:7
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作者 李鹏 罗德炎 +3 位作者 高永辉 张松乐 宋艳 王希良 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期493-497,共5页
目的构建布氏杆菌BCSP31/pVAX1重组表达质粒,免疫BALB/c小鼠,观察其免疫应答及免疫保护效果。方法克隆BCSP31基因,构建BCSP31/pVAX1重组表达质粒。转染COS7细胞,免疫组化检测其BCSP31蛋白抗原的表达。BCSP31/pVAX1重组表达质粒肌肉注射... 目的构建布氏杆菌BCSP31/pVAX1重组表达质粒,免疫BALB/c小鼠,观察其免疫应答及免疫保护效果。方法克隆BCSP31基因,构建BCSP31/pVAX1重组表达质粒。转染COS7细胞,免疫组化检测其BCSP31蛋白抗原的表达。BCSP31/pVAX1重组表达质粒肌肉注射免疫BALB/c小鼠,观察特异性体液免疫和细胞免疫效果。进一步用1.25×104布氏杆菌A544强毒株腹腔攻毒,观察BCSP31/pVAX1重组表达质粒的免疫保护效果。结果扩增的BCSP31保护性抗原基因片断在牛、羊和猪布氏杆菌株中具有高度保守性,构建的BCSP31/pVAX1重组表达质粒在COS7细胞有目的蛋白抗原的表达。制备的BCSP31/pVAX1重组表达质粒肌肉免疫BALB/c小鼠4次,ELISA检测BCSP31/pVAX1重组表达质粒产生了较高水平的特异性IgG抗体,并随免疫次数增加抗体的滴度也递增,且抗体亚型以IgG2a为主,表明主要引起Th1型的免疫应答。FCM检测BCSP31/pVAX1重组表达质粒的CD4+/CD8+比值明显下降,说明激发了显著的CTL效应。MTT测定BCSP31/pVAX1重组表达质粒的淋巴细胞增殖能力与对照组比较差异显著。布氏杆菌A544强毒株攻毒后,动物存活及脾组织细菌数与对照组比较有显著性差异,说明BCSP31/pVAX1重组表达质粒能够产生有效的保护效果。结论研制的BCSP31/pVAX1重组表达质粒免疫BALB/c小鼠能产生高水平的特异性体液免疫和细胞免疫,以细胞免疫为主,并产生有效的免疫保护效果,为布氏杆菌病新型疫苗的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 布氏杆菌BCSP31 重组表达质粒 免疫应答 免疫保护
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恶性疟原虫重组质粒DNA接种诱导BALB/c小鼠的免疫应答 被引量:5
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作者 李学荣 余新炳 +2 位作者 罗树红 徐劲 陈观今 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 1998年第4期241-245,共5页
目的:观察重组质粒DNA直接免疫接种诱导BALB/c小鼠的免疫应答水平,为恶性疟原虫DNA疫苗在动物和人体的应用提供依据。方法:构建编码多价保护性抗原的重组质粒pcDNA3-Pf8,PCR法检测免疫鼠的肌肉、肝脏、肾... 目的:观察重组质粒DNA直接免疫接种诱导BALB/c小鼠的免疫应答水平,为恶性疟原虫DNA疫苗在动物和人体的应用提供依据。方法:构建编码多价保护性抗原的重组质粒pcDNA3-Pf8,PCR法检测免疫鼠的肌肉、肝脏、肾脏、心脏、脾脏和肺组织中pcDNA3-Pf8,ELISA、T淋巴细胞转化试验、体外抑制试验观察其诱导的体液免疫及细胞免疫水平。结果:用PCR法从上述组织中均检测到pcDNA3-Pf8,ELISA法测得免疫鼠血清的特异性抗体滴度达12560,淋巴细胞转化试验显示恶性疟原虫可溶性抗原能特异性地剌激免疫鼠脾细胞增殖,免疫血清在体外还能抑制恶性疟红内期疟原虫的生长、发育。结论:编码恶性疟原虫多价保护性抗原的重组质粒pcDNA3-Pf8直接免疫接种,能特异性地剌激BALB/c小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答,其免疫血清在体外对疟原虫生长发育具有明显抑制作用。 展开更多
关键词 疟原虫 免疫应答 DNA疫苗 重组质粒 DNA
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基因工程菌中重组质粒的稳定性研究进展 被引量:21
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作者 肖硕 洪华珠 彭建新 《生物技术通报》 CAS CSCD 2008年第4期9-12,共4页
基因工程菌(细胞)是现代生物工程中的微型生物反应器,是基因工程的研究主体之一。获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞是基因工程的核心步骤与最终目的。基因工程菌重组质粒稳定性问题是基因工程菌工业化生产与实验研究中的... 基因工程菌(细胞)是现代生物工程中的微型生物反应器,是基因工程的研究主体之一。获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞是基因工程的核心步骤与最终目的。基因工程菌重组质粒稳定性问题是基因工程菌工业化生产与实验研究中的最主要问题,就其在基因工程中的重要性、影响因素及提高稳定性策略方面作简要介绍并展开综述。 展开更多
关键词 基因工程 重组质粒 稳定性 策略
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鸡IL-2基因克隆及其重组质粒的构建与表达 被引量:2
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作者 许发芝 仲大莲 +3 位作者 刘玉华 余为一 李槿年 曾明华 《安徽农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期87-91,共5页
利用一对自行设计的引物,通过反转录-聚合酶链反应(RT PCR),从ConA诱导的5周龄SPF鸡脾细胞中扩增出鸡白细胞介素2(IL 2)基因片段,其长度为439bp,经酶切鉴定,初步确定为鸡IL 2基因。再将该IL 2基因片段定向插入真核表达质粒pcDNA3中,经DN... 利用一对自行设计的引物,通过反转录-聚合酶链反应(RT PCR),从ConA诱导的5周龄SPF鸡脾细胞中扩增出鸡白细胞介素2(IL 2)基因片段,其长度为439bp,经酶切鉴定,初步确定为鸡IL 2基因。再将该IL 2基因片段定向插入真核表达质粒pcDNA3中,经DNA序列鉴定,表明构建的重组质粒含有IL 2基因,该基因的cDNA序列与Sundick报道的结果基本一致。然后,将IL 2基因片段插入原核表达载体pGEX 4T 1,并导入菌株BL21,经诱导培养、蛋白提取和SDS PAGE,获得分子量约为42000的蛋白条带,表明所克隆的鸡IL 2基因在原核细胞中得到表达。 展开更多
关键词 IL-2基因 基因克隆 重组质粒 基因表达 rt-pcr 白细胞介素2 细胞因子
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重组质粒对大肠杆菌HB101生长影响的微量热研究 被引量:10
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作者 刘义 王戈林 +2 位作者 赵儒铭 沈萍 屈松生 《化学学报》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2005年第4期327-331,共5页
用微量热方法研究了嗜麦芽假单胞菌AT18,受体菌大肠杆菌HB101,mel基因工程菌——大肠杆菌HB101/pWSY8和携带克隆载体pUC18质粒的大肠杆菌HB101等的生长代谢过程.实验结果从热化学和热动力学上阐明了细菌的生长速率常数与其所含质粒的大... 用微量热方法研究了嗜麦芽假单胞菌AT18,受体菌大肠杆菌HB101,mel基因工程菌——大肠杆菌HB101/pWSY8和携带克隆载体pUC18质粒的大肠杆菌HB101等的生长代谢过程.实验结果从热化学和热动力学上阐明了细菌的生长速率常数与其所含质粒的大小呈负相关.探讨了低温处理对含不同质粒大肠杆菌生长的影响,发现低温处理对工程菌生长影响最大. 展开更多
关键词 HB 大肠杆菌 重组质粒 携带 UC 克隆载体 生长影响 mel基因 工程菌 微量热
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弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究Ⅰ.pcDNA3-ROP1真核表达重组质粒的构建 被引量:14
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作者 郭虹 陈观今 +2 位作者 周永安 郑焕钦 刘彦文 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 1999年第1期3-5,共3页
目的构建弓形虫ZS2株pcDNA3-ROP1真核表达重组质粒,为进一步表达及DNA免疫做准备。方法用PCR技术从弓形虫ZS2分离株的基因组DNA中扩增编码棒状体蛋白1(ROP1)的基因片段,重组入pUC18克隆载体。... 目的构建弓形虫ZS2株pcDNA3-ROP1真核表达重组质粒,为进一步表达及DNA免疫做准备。方法用PCR技术从弓形虫ZS2分离株的基因组DNA中扩增编码棒状体蛋白1(ROP1)的基因片段,重组入pUC18克隆载体。将pUC18-ROP1中的ROP1外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入pcDNA3真核表达载体,再经含氨苄LB培养基筛选,酶切、PCR鉴定。结果从ZS2株基因组DNA中扩增出特异的ROP1基因片段,克隆成功pUC18-ROP1;经亚克隆,筛选鉴定获得了pcDNA-ROP1重组质粒。结论构建成功弓形虫pUC18-ROP1重组质粒,亚克隆成功pcDNA-ROP1重组质粒。 展开更多
关键词 克隆 重组质粒 弓形体病 ROP1基因 DNA免疫
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PET32a-CDK2重组质粒的构建与表达 被引量:5
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作者 黄宪章 张战锋 +2 位作者 陈炜烨 何敏 庄俊华 《广东医学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期681-684,共4页
目的构建含有细胞周期依赖性激酶2(CDK2)的PET32a-CDK2重组质粒,利用原核表达体系表达CDK2蛋白。方法从人白细胞中提取总RNA,采用聚合酶链反应从总RNA中扩增出CDK2基因,并将其插入PET32a质粒,构建重组质粒,化学法转化大肠杆菌DH5α进行... 目的构建含有细胞周期依赖性激酶2(CDK2)的PET32a-CDK2重组质粒,利用原核表达体系表达CDK2蛋白。方法从人白细胞中提取总RNA,采用聚合酶链反应从总RNA中扩增出CDK2基因,并将其插入PET32a质粒,构建重组质粒,化学法转化大肠杆菌DH5α进行克隆。将克隆得到的PET32a-CDK2重组质粒转化入表达菌株BL21,通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导其蛋白表达,SDS-PAGE和Western-Blot鉴定蛋白表达情况。结果菌落PCR及DNA测序证实CDK2基因已正确克隆到载体中;重组质粒成功转入表达菌株BL21(DE3),SDS-PAGE和Western-Blot结果显示表达菌经IPTG诱导后表达出52 kD左右的蛋白。结论成功构建重组质粒,并且CDK2全长蛋白在原核表达菌BL21中成功表达。 展开更多
关键词 CDK2 重组质粒 原核表达
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