猪萨佩罗病毒VP1基因重组质粒实时荧光定量PCR标准曲线的建立

为建立用实时SYBRGreenI荧光定量PCR方法检测PSVVP1基因表达量的标准曲线,试验根据目的基因在NCBI上CDS区的序列设计合成引物,用T4连接酶将目的片段与pMD18-T载体连接,构建重组质粒,采用real-time RT-PCR的检测方法,建立了检测猪萨佩罗病毒VP1基因表达量的标准曲线。试验结果显示,线性回归系数为0.9981,且熔解曲线只有一个峰值,表明由VP1目的基因所建立的标准曲线线性关系良好。试验成功建立了用SYBRGreenI荧光定量RT-PCR方法检测猪萨佩罗病毒VP1基因表达量的标准曲线,为后续检测基因表达量的变化奠定了基础。

人IL-18 cDNA的RT-PCR扩增及其重组质粒的构建

为构建人白细胞介素18(IL-18)的重组质粒,用 RT-PCR 技术从健康人外周血单核细胞中扩增出编码人 IL-18的 cDNA,并将此基因定向克隆人表达载体 pBV220中,通过对转化子的筛选得到带有 IL-18插入片段的阳性克隆。经酶切分析及核苷酸测序表明,克隆到的基因与文献报道完全一致。表达的重组 IL-18占菌体总蛋白质的20%。表达的蛋白分子量约为18.3kD。表达产物主要以包涵体的形式存在。

MuRF2、PPAR γ1和Ub重组质粒的构建及鉴定

目的 构建过氧化物酶体增殖物激活受体γ亚型1(peroxisome proliferator-activated receptor gamma isoform 1,PPAR γ1)、泛素连接酶肌肉环指状蛋白2(ubiquitin ligase muscle ring finger protein 2,MuRF2)和泛素(ubiquitin,Ub)的重组质粒并进行鉴定。方法 根据MuRF2、PPAR γ1和Ub的cDNA序列及GV146和GV417载体质粒上的多克隆位点设计目的基因克隆引物。XhoI/EcoRI内切酶分别双酶切PPAR γ1目的DNA与GV146载体;NheI/BamHI内切酶分别双酶切MuRF2和Ub目的 DNA与GV417载体。用连接酶连接双酶切后的目的 DNA和载体,导入大肠杆菌经筛选获得重组质粒。PCR鉴定重组克隆后进行DNA测序。转染HEK 293T细胞后,于荧光显微镜下观察转染效率;免疫共沉淀实验后用Western blot检测蛋白的表达及蛋白质相互作用。结果 以合成的PPAR γ1、Ub、MuRF2的引物分别对PPAR γ1、Ub和MuRF2的菌落进行PCR扩增,产物大小分别为943、451和1 154 bp,与预期结果一致。测序结果与目的基因序列进行比对分析,证实成功构建出PPAR γ1、Ub和MuRF2的重组质粒。在HEK 293T细胞中共转染His-MuRF2、HA-Ub、PPAR γ1重组质粒,荧光显微镜观察结果提示重组质粒成功转染。免疫共沉淀试验后用Western blot检测可见PPAR γ1、MuRF2和Ub蛋白的有效表达,且验证了MuRF2介导PPAR γ1发生泛素化修饰反应。结论成功构建PPAR γ1、MuRF2和Ub的重组质粒,且三种质粒在HEK 293T细胞中有效表达,验证了MuRF2介导PPAR γ1发生泛素化修饰反应。

弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒免疫小鼠后的免疫应答

目的： 用构建的弓形虫ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 真核表达重组质粒， 直接免疫小鼠， 观察其所诱导的细胞及体液免疫反应。方法： 碱裂解法大量制备ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 质粒， 经肌肉注射免疫ＢＡＬＢ／ｃ 小鼠， 每鼠注射１００ μｇ，２ ｗ ｋ 后同量加强免疫１ 次， 以ｐｃＤＮＡ３ 空质粒及生理盐水组为对照。分别于免疫后３０ ｄ、５０ ｄ、７０ ｄ 共３ 次用ＭＴＴ 法测定小鼠脾脏Ｔ 淋巴细胞增殖活性及ＮＫ 细胞活性； 用间接免疫荧光抗体法测定Ｔ淋巴细胞亚群数目；ＥＬＩＳＡ 法测定ＩｇＧ 抗体滴度。结果： 用ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 质粒免疫小鼠３０ ｄ 后， 脾脏明显增大； 免疫组脾淋巴细胞增殖活性明显高于生理盐水及空质粒对照组。ＮＫ 细胞杀伤活性３ 次的测定结果免疫组均高于对照组。Ｔ 细胞亚群， ＣＤ４＋ 细胞数与对照组相比较无明显变化， 而ＣＤ８＋ 细胞数显著增高。血清抗体ＩｇＧ７０ ｄ 内检测结果， 与对照组相比较， 无明显增高； 而免疫后９０ ｄ 检测明显增高， 抗体滴度１∶１００。结论： 用ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 重组质粒ＤＮＡ免疫小鼠， 可诱导产生细胞及体液免疫应答。

改善大分子质粒DNA重组效率的新方法

采用两次连接法对一个质粒载体为 7 65kb ,插入子为 1 4 7kb的片段进行重组连接 ,使连接效率大大提高 .此方法对于大分子的质粒DNA重组是非常有效的 .

重组质粒导入根癌农杆菌冻融法的研究

对重组质粒导入农杆菌冻融法的几个技术环节进行改进与优化。结果表明:该方案可简便、快速、有效地将重组质粒导入农杆菌,转化效率高、重复性好。应用该改进和优化的标准冻融法将重组质粒pBISP1,pBIP1,pBIAP1和pBISgp120分别导入根癌农杆菌EHA105和LBA4404,构建了植物双元表达载体,为用农杆菌介导法进行植物遗传转化提供了良好的载体系统。

产腈水合酶重组大肠杆菌的质粒稳定性研究

成功构建了腈水合酶(nitrile hydratase,NHase)高表达的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pETNHM(Kanr),研究了重组质粒pETNHM在重组菌株中的质粒稳定性。结果表明,pETNHM具有较好的结构稳定性,连续传代60代后质粒的基因序列没有明显缺失,且能够正常表达腈水合酶。pETNHM具有分离不稳定性,在无抗生素选择压力下,连续传代48代后质粒丢失的无质粒细胞开始出现。琼脂糖凝胶电泳定量分析表明,2/3的质粒pETNHM以二聚体形式存在,导致质粒拷贝数的下降。进一步研究表明,重组细胞的连续高速分裂及腈水合酶的高表达也会造成质粒拷贝数的下降,从而降低其分离稳定性。反之,重组菌株相对于宿主菌株的较高比生长速率有利于保持含质粒细胞的生长优势,卡那霉素的选择压力则能够保证质粒的稳定遗传。

新城疫病毒(NDV)HN基因真核表达重组质粒的构建

应用一对自行设计的引物 ,通过反转录 -聚合酶链反应 (RT-PCR)获得新城疫病毒 (NDV) Lasota株的血凝素神经氨酸酶 (HN)基因片段 ,其长度约为 1 .7kb,与已报道的 NDV-HN基因片段大小一致。再将该 HN基因片段定向插入真核表达质粒 pc DNA3中 ,经酶切和测序鉴定 ,表明构建的重组质粒含有 NDV-HN基因片段。

弓形虫P30基因重组质粒的构建及其免疫效果

目的 通过构建含弓形虫P30不同表达形式 (膜型、分泌型及细胞内型 )的重组质粒 ,并将其用于免疫小鼠 ,测定抗体水平 ,以期初步筛选出一种对弓形虫感染具有良好保护作用的核酸疫苗。 方法 利用PCR技术和亚克隆技术分别构建弓形虫表膜型P30基因重组质粒 (含完整的P30编码序列 ,包括信号肽及疏水尾 )pcDNA3 P30Mb ,分泌型P30基因重组质粒 (含完整的P30编码序列 ,不包括疏水尾 )pcDNA3 P30Se以及细胞内型P30基因重组质粒 (含完整的P30编码序列 ,但不包括信号肽 )pcDNA3 P30In。将以上 3种重组质粒分别与脂质体混合后免疫小鼠 ,ELISA及免疫印迹测定小鼠血清中特异的IgG抗体。 结果 成功构建了弓形虫P30基因 3种表达形式的重组质粒 ,经双酶切鉴定及DNA序列测定 ,3种重组质粒中的插入片段确为P30的编码基因 ,且读码框架正确 ;抗体测定显示 :3个免疫组均能诱导小鼠产生特异的IgG抗体 ,但各组之间IgG出现的时间及强度有一定的差异。 结论 用编码弓形虫P30抗原的重组质粒进行核酸免疫 ,能诱导免疫小鼠产生特异性的IgG抗体 ;膜型及分泌型免疫小鼠的特异IgG抗体出现的时间早于细胞内型免疫鼠 ,但 4wk后 3组间差异无显著性。

旋毛虫ES抗原特异性蛋白两个结构基因的序列分析及重组质粒的构建

目的：获取旋毛虫ＥＳ抗原的结构基因，对其鉴定和克隆，并研制旋毛虫基因重组抗原。方法：先用反转录ＰＣＲ技术获取目的基因，经序列测定和酶切分析后，再用重组ＤＮＡ技术分别将目的基因与融合表达载体ｐＥＸ３１Ｃ、ｐＥＸ３１Ｂ及表达载体ｐＢＶ２２０连接，评价在大肠杆菌中的表达效果和鉴定表达产物的特异性。结果：获得了编码ＥＳ抗原特异性蛋白成分的两个结构基因（０．７ｋｂ和０．９５ｋｂ），其序列与文献报道的稍有差异。共构建３个重组质粒并在大肠杆菌中表达出相应分子量大小的重组蛋白，均能被猪旋毛虫病阳性血清所识别，但非融合蛋白的特异性强于融合蛋白。在相同条件下，融合蛋白的表达量高于非融合蛋白，而表达蛋白的分子量大小与表达水平呈负相关性。结论：在大肠杆菌中表达的３种重组蛋白是研制旋毛虫基因重组抗原的良好候选抗原蛋白。

布氏杆菌BCSP_(31)/pVAX1重组表达质粒的构建及其免疫保护效果的研究

目的构建布氏杆菌BCSP31/pVAX1重组表达质粒,免疫BALB/c小鼠,观察其免疫应答及免疫保护效果。方法克隆BCSP31基因,构建BCSP31/pVAX1重组表达质粒。转染COS7细胞,免疫组化检测其BCSP31蛋白抗原的表达。BCSP31/pVAX1重组表达质粒肌肉注射免疫BALB/c小鼠,观察特异性体液免疫和细胞免疫效果。进一步用1.25×104布氏杆菌A544强毒株腹腔攻毒,观察BCSP31/pVAX1重组表达质粒的免疫保护效果。结果扩增的BCSP31保护性抗原基因片断在牛、羊和猪布氏杆菌株中具有高度保守性,构建的BCSP31/pVAX1重组表达质粒在COS7细胞有目的蛋白抗原的表达。制备的BCSP31/pVAX1重组表达质粒肌肉免疫BALB/c小鼠4次,ELISA检测BCSP31/pVAX1重组表达质粒产生了较高水平的特异性IgG抗体,并随免疫次数增加抗体的滴度也递增,且抗体亚型以IgG2a为主,表明主要引起Th1型的免疫应答。FCM检测BCSP31/pVAX1重组表达质粒的CD4+/CD8+比值明显下降,说明激发了显著的CTL效应。MTT测定BCSP31/pVAX1重组表达质粒的淋巴细胞增殖能力与对照组比较差异显著。布氏杆菌A544强毒株攻毒后,动物存活及脾组织细菌数与对照组比较有显著性差异,说明BCSP31/pVAX1重组表达质粒能够产生有效的保护效果。结论研制的BCSP31/pVAX1重组表达质粒免疫BALB/c小鼠能产生高水平的特异性体液免疫和细胞免疫,以细胞免疫为主,并产生有效的免疫保护效果,为布氏杆菌病新型疫苗的研究奠定了基础。

恶性疟原虫重组质粒DNA接种诱导BALB/c小鼠的免疫应答

目的：观察重组质粒ＤＮＡ直接免疫接种诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠的免疫应答水平，为恶性疟原虫ＤＮＡ疫苗在动物和人体的应用提供依据。方法：构建编码多价保护性抗原的重组质粒ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆ８，ＰＣＲ法检测免疫鼠的肌肉、肝脏、肾脏、心脏、脾脏和肺组织中ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆ８，ＥＬＩＳＡ、Ｔ淋巴细胞转化试验、体外抑制试验观察其诱导的体液免疫及细胞免疫水平。结果：用ＰＣＲ法从上述组织中均检测到ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆ８，ＥＬＩＳＡ法测得免疫鼠血清的特异性抗体滴度达１２５６０，淋巴细胞转化试验显示恶性疟原虫可溶性抗原能特异性地剌激免疫鼠脾细胞增殖，免疫血清在体外还能抑制恶性疟红内期疟原虫的生长、发育。结论：编码恶性疟原虫多价保护性抗原的重组质粒ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆ８直接免疫接种，能特异性地剌激ＢＡＬＢ／ｃ小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答，其免疫血清在体外对疟原虫生长发育具有明显抑制作用。

基因工程菌中重组质粒的稳定性研究进展

基因工程菌(细胞)是现代生物工程中的微型生物反应器,是基因工程的研究主体之一。获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞是基因工程的核心步骤与最终目的。基因工程菌重组质粒稳定性问题是基因工程菌工业化生产与实验研究中的最主要问题,就其在基因工程中的重要性、影响因素及提高稳定性策略方面作简要介绍并展开综述。

鸡IL-2基因克隆及其重组质粒的构建与表达

利用一对自行设计的引物,通过反转录-聚合酶链反应(RT PCR),从ConA诱导的5周龄SPF鸡脾细胞中扩增出鸡白细胞介素2(IL 2)基因片段,其长度为439bp,经酶切鉴定,初步确定为鸡IL 2基因。再将该IL 2基因片段定向插入真核表达质粒pcDNA3中,经DNA序列鉴定,表明构建的重组质粒含有IL 2基因,该基因的cDNA序列与Sundick报道的结果基本一致。然后,将IL 2基因片段插入原核表达载体pGEX 4T 1,并导入菌株BL21,经诱导培养、蛋白提取和SDS PAGE,获得分子量约为42000的蛋白条带,表明所克隆的鸡IL 2基因在原核细胞中得到表达。

重组质粒对大肠杆菌HB101生长影响的微量热研究

用微量热方法研究了嗜麦芽假单胞菌AT18,受体菌大肠杆菌HB101,mel基因工程菌——大肠杆菌HB101/pWSY8和携带克隆载体pUC18质粒的大肠杆菌HB101等的生长代谢过程.实验结果从热化学和热动力学上阐明了细菌的生长速率常数与其所含质粒的大小呈负相关.探讨了低温处理对含不同质粒大肠杆菌生长的影响,发现低温处理对工程菌生长影响最大.

弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究Ⅰ.pcDNA3-ROP1真核表达重组质粒的构建

目的构建弓形虫ＺＳ２株ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１真核表达重组质粒，为进一步表达及ＤＮＡ免疫做准备。方法用ＰＣＲ技术从弓形虫ＺＳ２分离株的基因组ＤＮＡ中扩增编码棒状体蛋白１（ＲＯＰ１）的基因片段，重组入ｐＵＣ１８克隆载体。将ｐＵＣ１８－ＲＯＰ１中的ＲＯＰ１外源基因片段经酶切、连接等反应，亚克隆入ｐｃＤＮＡ３真核表达载体，再经含氨苄ＬＢ培养基筛选，酶切、ＰＣＲ鉴定。结果从ＺＳ２株基因组ＤＮＡ中扩增出特异的ＲＯＰ１基因片段，克隆成功ｐＵＣ１８－ＲＯＰ１；经亚克隆，筛选鉴定获得了ｐｃＤＮＡ－ＲＯＰ１重组质粒。结论构建成功弓形虫ｐＵＣ１８－ＲＯＰ１重组质粒，亚克隆成功ｐｃＤＮＡ－ＲＯＰ１重组质粒。

PET32a-CDK2重组质粒的构建与表达

目的构建含有细胞周期依赖性激酶2(CDK2)的PET32a-CDK2重组质粒,利用原核表达体系表达CDK2蛋白。方法从人白细胞中提取总RNA,采用聚合酶链反应从总RNA中扩增出CDK2基因,并将其插入PET32a质粒,构建重组质粒,化学法转化大肠杆菌DH5α进行克隆。将克隆得到的PET32a-CDK2重组质粒转化入表达菌株BL21,通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导其蛋白表达,SDS-PAGE和Western-Blot鉴定蛋白表达情况。结果菌落PCR及DNA测序证实CDK2基因已正确克隆到载体中;重组质粒成功转入表达菌株BL21(DE3),SDS-PAGE和Western-Blot结果显示表达菌经IPTG诱导后表达出52 kD左右的蛋白。结论成功构建重组质粒,并且CDK2全长蛋白在原核表达菌BL21中成功表达。

转化生长因子β_1启动子质粒重组体的构建及活性研究

目的探讨调控TGF-β1基因高水平转录的启动片段。方法:以人基因组DNA为模板,PCR扩增获得TGF-β1基因转 录起始位点上游5′端-1328～+812bp的片段中不同长度的片段,以此作为启动子与含氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因 的质粒pCAT3-enhancer重组成5个重组体,并将其转染至大鼠肝星状细胞株中,测定细胞的CAT的表达水平并比较各重组体 的启动子活性。结果:-308～+812bp序列具有较强的启动活性,-611～+812bp次之,其他几个重组体的启动活性从高到 低的排序依次为-1328～+812bp、-867～+812bp、+227～+812bp。结论:TGF-β1基因启动子片段中,-308～+812bp、 -611～+812bp、-1328～+812bp重组体具有较强的启动活性,是进一步研究人TGF-β1基因转录调控的重要靶序列。

猪Ghrelin基因真核表达重组质粒的构建及免疫小鼠试验

从猪胃组织中提取总RNA，采用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术，经扩增得到450bp Ghrelin基因。将其克隆到pMD18-T中。经双酶切初步鉴定后，将酶切下的目的基因进一步克隆到真核表达载体PCI中，经PCR、酶切及序列鉴定，证实插入载体PCI中的片段为含有目的基因的核苷酸序列。真核表达重组质粒PCI-Ghrelin-28aa构建成功；以构建的PCI-Chrelin-28aa质粒肌肉注射（1mg／kg）昆明小鼠（体重18-20g），观察其体重变化。结果表明：注射该基因质粒5d后，实验组小鼠平均日增重高于对照组，且差异显著（P〈0．05）。尤其是注射10-15d增重最为明显。本试验构建的PCI Chrelin-28aa基因质粒对小鼠具有明显的促生长作用．并将成为新的促猪生长的基因药物。

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型基因重组质粒实时荧光定量PCR标准曲线的构建

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7和猪圆环病毒2型(PCV2)ORF1的核苷酸序列设计特异性引物,经RT-PCR/PCR扩增,分别扩增出大小为308 bp和417 bp的部分基因片段。用T4连接酶将目的片段与pGEM-Teasy载体系统连接,并转化到大肠杆菌DH-5α株感受态细胞。提取的质粒经PCR、酶切和测序鉴定,证实为PRRSV和PCV2的阳性重组质粒。将重组标准质粒10倍系列稀释后作为模板,通过实时荧光定量PCR方法(Real-time PCR),建立了PRRSV、PCV2的标准曲线及其直线回归方程,并确定其最佳读板温度。该方法具有线性关系好、特异性强、敏感性高、重复性好等特点,为分析PRRSV和PCV2共感染猪体内病毒的绝对含量提供了必要的技术平台。