基于人胚胎干细胞的实时细胞系统评价心脏毒性方法的建立

目的采用人胚胎干细胞诱导分化的心肌细胞(human embryonic stem cells derived cardiomyocytes,h ESC-CM)联合实时细胞分析系统(real-time cell analysis Cardio,RTCA Cardio),建立一种体外药物心脏毒性早期筛选方法。方法将h ESC-CM接种到RTCA Cardio E-Plate 96孔板,分析心肌细胞的搏动频率、幅度和搏动节律不规则性指数确定细胞最佳接种密度及检测时间,建立体外药物心脏毒性早期筛选方法。在此基础上,分别采用0.1%DMSO作为溶剂对照及具有抗心律失常作用的药物奎尼丁(0.2、0.78、3.13、12.5、50和100μmol·L-1)作为阳性对照进行了验证。结果0.1%DMSO对h ESC-CM的生长指数(cell index,CI值)、搏动特征图谱及搏动频率和幅度均无影响。而与溶剂对照组相比,奎尼丁浓度≥3.13μmol·L-1时影响细胞CI值和特征性搏动图谱,抑制细胞搏动频率和幅度,且具有浓度依赖性,浓度越高细胞搏动信号恢复所需时间越长,对搏动频率和幅度的抑制作用越明显。结论采用h ESC-CM联合RTCA Cardio系统建立的体外药物心脏毒性早期筛选方法可以检测出奎尼丁对心肌细胞搏动状况的影响,该方法可作为一种高通量筛选工具用于临床前药物心脏毒性早期筛选。

基于实时细胞分析技术的乌头碱致心律失常体外评价技术研究

目的以乌头碱为工具药,建立基于实时细胞分析(real-time cell analysis,RTCA Cardio)系统的体外心律失常检测技术,为抗心律失常药物的研发提供可靠方法。方法利用八导生理记录仪从整体动物水平检测乌头碱对实验大鼠心律的影响;体外培养心肌细胞,首先利用RTCA方法考察心肌细胞的接种密度,利用RTCA Cardio系统监测乌头碱对心肌细胞搏动的影响,分析细胞的CI值、细胞搏动频率、振幅、不规则性节律等。结果八导生理记录仪检测50 mg·g^-1乌头碱对整体动物的影响结果发现乌头碱可诱发室速、室颤、RR间期缩短以及心率增加等心律失常的表现;RTCA Cardio系统显示2~8μmol·L^-1乌头碱可呈剂量依赖性的导致心肌细胞搏动频率增加、搏动幅度降低、搏动状态异常等心律失常现象。结论RTCA Cardio系统可以快速、敏感、准确检测乌头碱诱导的心肌细胞心律失常现象,为抗心律失常药物的研发提供了方法学参考。

基于实时细胞分析系统的速效救心丸抗心律失常作用研究

目的利用实时细胞分析(RTCA)Cardio系统,通过体外细胞实验及整体动物实验评价速效救心丸抗心律失常作用。方法培养原代大鼠乳鼠心肌细胞,接种于E-Plate Cardio 96,分析3600/孔、20000/孔以及90000/孔接种浓度心肌细胞的细胞指数(CI)和搏动图形;MTT法检测速效救心丸(10、20、40、80、160μg/m L)对原代心肌细胞活力的影响;考察速效救心丸(160μg/m L)对乌头碱(8μmol/L)诱发心律失常的心肌细胞搏动频率、搏动幅度的影响;舌下iv乌头碱50μg/kg制备大鼠心律失常模型,利用八导生理记录仪观察速效救心丸(54、270 mg/kg)对Ⅱ导联心电图的影响。结果20000/孔为最佳接种浓度,CI值在观察时间内成对数生长,细胞形成同步搏动,波形正常且持续时间长;在10~160μg/m L浓度范围内,速效救心丸对心肌细胞活力均没有明显影响。RTCA Cardio系统检测结果显示,与模型组比较,速效救心丸能显著降低心肌细胞搏动速率(P<0.01)、显著增加心肌细胞的搏动幅度(P<0.01)。动物实验发现,速效救心丸能有效对抗乌头碱诱导的心律失常、改善乌头碱对实验动物RR间期的抑制作用和对心率的促进作用、降低乌头碱诱导的室颤发生率(P<0.01、0.001)。结论RTCA Cardio系统能实现对心肌细胞的实时监测,可以检测心肌细胞的搏动情况;速效救心丸能有效对抗乌头碱诱导的心律失常。

脂多糖刺激多能干细胞诱导人源心肌细胞与大鼠心肌细胞的体外模型比较

目的比较脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)对多能干细胞诱导的人源心肌细胞(human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes,hiPS-CMs)及原代新生大鼠心肌细胞(cardiomyocytes,CMs)的影响。方法不同浓度LPS处理hiPS-CMs和原代新生大鼠CMs 24~48 h,通过实时无标记细胞分析技术(xCELLigence Real-Time Cell Analyser Cardio system RTCA)观察hiPS-CMs和原代新生大鼠CMs的电生理变化;qRT-PCR方法检测NPPB mRNA表达水平和qPCR阵列法检测炎性基因表达水平。结果不同浓度LPS刺激后,原代新生大鼠CMs的电生理变化为搏动频率增加和搏动幅度减少(P<0.01),NPPB mRNA表达水平增加(P<0.01)。在hiPS-CMs中,相对应的LPS浓度刺激未能引起搏动幅度和搏动频率显著变化(P>0.05),NPPB mRNA表达水平未显著增加(P>0.05)。进一步增加浓度(2.5μg/mL~40μg/mL),hiPS-CMs的搏动幅度和搏动频率仍未发生明显变化(P>0.05),NPPB mRNA在高浓度LPS(5μg/mL~40μg/mL)发生差异性改变(P<0.01)。最后,在炎症相关基因表达方面,原代新生大鼠CMs表现为C3、Gpnmb、Atf3、Il6r和Ly96基因水平上调至1.5倍,hiPS-CMs表现为AK4、TOLLIP、SPP1、FABP1、IL6R、LY96和C3基因水平上调至1.5倍。结论与原代新生大鼠CMs相比,hiPS-CMs受到LPS的损伤明显减轻,表现出不同的炎症基因表达模式。