动物RNA病毒检测关键试剂—反转录酶(M-MLV RTase)的制备

反转录酶是动物RNA病毒分子诊断用到的关键试剂之一。为获得纯度高、活性高、制备简单经济的M-MLV RTase,本试验将M-MLV RTase的基因序列进行密码子优化,合成并构建表达载体。将表达载体转化到大肠杆菌E.coli Rosetta宿主菌种,经IPTG诱导后实现M-MLV RTase的可溶性表达。利用Ni2+柱亲和层析纯化载有6x His标记的重组MMLV RTase,对重组酶进行Western Blotting试验,鉴定为M-MLV RTase。通过对动物流感病毒RNA的普通RT-PCR和荧光RT-PCR检测来评价重组酶的活性并估测其活性单位。将活性单位相当的重组酶和商品酶进行比较,结果显示,制备的重组酶活性高,对不同浓度病毒RNA的检测结果与商品酶相当。研制的M-MLV RTase可以用于动物RNA病毒的分子诊断。

马传贫病毒白细胞弱毒疫苗毒株反转录酶基因克隆及序列分析比较

本实验从商品化马传贫弱毒疫苗培养物提纯马传贫疫苗毒病毒粒子并抽提病毒RNA后 ,采用RT_PCR方法扩增并首次克隆了马传贫驴强毒反转录酶 (RTase)基因。经核苷酸序列测定得出反转录酶基因全长 1 6 6 8bp ,编码 5 5 6个氨基酸。通过与已发表其它马传贫病毒反转录酶基因序列比较 ,发现在氨基酸和核苷酸水平差异率分别为 1 4 .0 %和 1 6 .6 %。变异氨基酸随机分布于整个基因上 ,无明显规律。在反转录病毒高度保守的酶基因上发现这样大的差异 ,展示出马传贫驴强毒作为马传贫弱毒疫苗亲本毒株的独特分子特性。

PERT-ELISA法用于细胞逆转录病毒检测的再研究

目的进一步分析PERT-ELISA法在细胞逆转录病毒检测应用中的意义。方法分析不同细胞培养液及其添加成分对PERT-ELISA法检测结果的影响及检测方法的精密性和检测用试剂的稳定性,将该方法用于不同来源细胞的逆转录酶活性的检测,并通过共培养法对我国金黄地鼠肾细胞中逆转录酶活性是否具有感染性进行初步分析。结果不同细胞培养液及其添加成分逆转录酶活性检测均为阴性,不会影响样本的检测结果。PERT-ELISA法具有良好的试验间精密性及重现性,检测用试剂在保存条件下,至少在1年内可保持稳定。近250株细胞的检测结果显示,含有逆转录病毒颗粒的细胞,无论是否具有感染性,均为逆转录酶活性阳性;除部分人淋巴瘤来源的细胞外,大部分人源细胞为逆转录酶活性阴性;8种91株猴肾来源的细胞包括74株Vero细胞均为逆转录酶活性阴性;而鼠源细胞则大部分为阳性,其中20株CHO来源的细胞均为阳性;3株猪源细胞及1株猫源细胞为阳性,而2株水貂细胞、2株牛源细胞及1株犬源细胞均为阴性。被检测的15株组织工程产品用人源细胞逆转录酶活性均为阴性,而我国不同地区来源的金黄地鼠肾细胞上清中,逆转录酶活性均为阳性。金黄地鼠肾细胞与人2BS细胞共培养后连续传代7次,细胞上清中逆转录酶活性仍为阳性,但随着传代次数的增加呈下降趋势。结论PERT-ELISA法可用于细胞逆转录病毒的检测,但对于阳性细胞,还需要进一步分析其与逆转录病毒或逆转录病毒样颗粒的相关性及是否具有感染性。