创伤弧菌PMA RTi-PCR检测技术的建立

目的将叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与实时定量聚合酶链式反应(RTi-PCR)技术相结合,建立以一种快速准确的创伤弧菌检测方法。方法以vvh基因作为检测创伤弧菌的靶基因,用PMA对样品基因组提取进行前处理,抑制该DNA分子的RTi-PCR扩增。结果终浓度为3.0mg/L的PMA可有效抑制死细胞(1×108 CFU/mL)DNA的扩增;当PMA浓度小于或等于5.0mg/L时,对创伤弧菌DNA的扩增没有显著的影响;含有不同比例死活细菌的创伤弧菌混合液RTi-PCR结果表明,PMA RTi-PCR能选择性定量创伤弧菌中的活菌。纯培养创伤弧菌活细胞的检测灵敏度检测极限为2.5×101 CFU/mL,并且Ct值与细胞数的对数呈良好的线性关系,相关系数R2值为0.9982。结论 PMA RTi-PCR是一种快速灵敏且能有效鉴别并定量检测病原活细胞的新方法。

食品中3种致病菌的Taqman多重荧光定量PCR检测

利用实时荧光定量PCR(RTi-PCR)技术探索病原微生物的快速高通量检测方法已是食品微生物学的研究热点之一。首先,通过调整混合培养基的配比摸索食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的快速共增菌条件,并选择稳定高效的细菌基因组DNA提取方法,然后根据3种目标致病菌的保守基因分别设计RTi-PCR引物和双标记Taqman探针,分别使用FAM、TAMRA及CY5作为报告基团,对致病菌进行多重RTi-PCR检测,并设计、构建了阳性内参用于检测反应体系。结果表明,方法针对42种已知目标菌株和21种已知菌株组合特异性良好,检测限可达101 cfu/PCR反应,且反应体系各组分间未见交叉干扰。阳性内参Ct值保持稳定,有效地保证了检测的可靠性。对人工污染的食品盲样检测验证了方法的实用性。总之,建立了一种食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌同时快速检测的多重RTi-PCR方法,为食源性致病菌的检测提供了新的方法学依据。

柑桔溃疡病菌实时荧光定量PCR检测与应用

根据地毯草黄单孢Xac306菌株（Xanthomonas axonopodis pv.citri，Xac 306）已知全基因组中独有蛋白基因序列设计的特异性引物对和探针，建立并优化SYBR Green I（SGI）荧光染料和TaqMan探针实时荧光定量PCR检测体系，用于柑桔溃疡病早期诊断鉴定。结果表明，建立的两种定量PCR体系均能特异地检出Xac的细胞和其基因组DNA，而对其它测试的植物病原菌和柑桔表面的腐生黄单孢菌都不能检出。SGI法和TaqMan探针法对Xac细菌悬浮液的检测灵敏度均可达到1～5个细菌／反应，对Xac靶标片段DNA的检测灵敏度可达1fg／μL。两种定量PCR检测方法比常规PCR灵敏度高2～3个数量级。对田间采集的328个柑桔显症、疑似症状和无症带菌材料富集培养样品进行了实际检测，结果表明，实时荧光PCR适合柑桔无症带菌样品的早期检测。