肝细胞癌中Runx3基因启动子区甲基化研究

目的通过检测肝细胞癌中Runx3基因启动子区域甲基化状态及Runx3基因表达情况,探讨Runx3基因启动子区域异常甲基化状态在肝细胞癌发生和发展过程中的意义。方法采用DNA甲基化特异性PCR(MSP)技术分别对5种肝癌细胞系和52例肝细胞癌患者肿瘤组织及其癌旁组织Runx3基因启动子区域甲基化进行检测,同时采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测3种肝癌细胞系Runx3 mRNA在使用药物5-氮-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)前后的表达情况。结果在肝细胞癌组织中,Runx3基因启动子区域甲基化率占42.3%(22/52),而在相对应的癌旁正常组织中,Runx3基因启动子区域未发现高甲基化现象;Runx3基因启动子区域甲基化状态与患者临床病理参数均无相关关系;在5种肝癌细胞系中,有3种细胞Runx3基因启动子区域存在甲基化异常;用药物5-Aza-CdR处理后的3种肝癌细胞中Runx3 mRNA表达明显增强。结论Runx3基因启动子区域甲基化是导致Runx3基因失活的主要原因之一,与肝细胞癌发生早期密切相关,可作为肝细胞癌早期诊断的分子标记物及分子治疗的靶点。

结直肠癌和管状腺瘤中Runx3基因启动子甲基化状态的分析

目的探讨结直肠癌及管状腺瘤中Runx3基因甲基化状态和Runx3蛋白表达,确定Runx3基因在"腺瘤→腺癌"癌变通路中的作用、临床意义及Runx3基因在不同年龄层段的甲基化程度。方法应用TaqMan探针qPCR(MethyLight)法分别检测40例管状腺瘤组织、50例结直肠癌组织和20例正常组织中Runx3基因CpG岛甲基化状态,并通过测序法验证扩增序列,同时应用免疫组化法分别检测上述标本中Runx3蛋白表达。结果结直肠癌组、管状腺瘤组、正常组中Runx3基因启动子甲基化率分别为84%、45%、10%,差异有统计学意义(P<0.05);结直肠癌组、管状腺瘤组、正常组中Runx3蛋白阳性率分别为18%、45%、80%,差异有统计学意义(P<0.05);Runx3基因甲基化与蛋白表达在正常组、管状腺瘤组及结直肠癌组中均呈负相关(相关系数r值分别为-0.667、-0.616、-0.790,P均<0.05);管状腺瘤组和结直肠癌组中Runx3基因启动子甲基化频率与患者年龄呈正相关(相关系数r值分别为0.376、0.304,P均<0.05)。结论 Runx3基因甲基化可能诱导其蛋白表达下调,在结直肠"腺瘤→腺癌"的癌变通路中起重要作用,同时Runx3基因甲基化可能与患者年龄相关,随年龄增长,甲基化程度增高。

5-Aza-CdR对人结肠癌Lovo细胞增殖凋亡及抑癌基因RUNX3表达的影响

目的:研究抑癌基因RUNX3在人结肠癌细胞中的表达情况,探讨5-氮-2′-脱氧胞苷 (5-Aza-CdR)对人结肠癌Lovo细胞增殖凋亡及 RUNX3表达的影响．方法:用特异性甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR 0．4,4,40μmol/L处理人结肠癌细胞株Lovo 3 d,继续常规培养5d后,采用四唑盐(MTT) 比色观察细胞经药物处理前后的生长活性．以半定量RT-PCR检测细胞处理前后抑癌基因 RUNX3 mRNA的表达,应用流式细胞仪进行细胞凋亡率的检测结果:人结肠癌细胞Lovo经处理后,与对照组比较,5-Aza-CdR 0．4,4,40 μmol/L均能明显抑制肿瘤细胞生长,随5-Aza-CdR浓度增加,细胞生长速率下降;对照组Lovo细胞未见 RUNX3 mRNA表达．经药物处理后的细胞均检出该种mRNA的重新表达,其mRNA的表达相对量分别为0．46±0．06,0．71±0．06,0．84 ±0．07,与药物存在剂量依赖性(F=168．4, P<0．01):对照组细胞凋亡率为2．92％±0．93％, 5-Aza-CdR 0．4,4,40 μmol／L处理后Lovo细胞凋亡率分别为10．95％±2．09％,17．61％± 1．51％,26．60％±1．89％,与对照组相比较均有统计学意义(P<0．01),且凋亡率与5-Aza-CdR 剂量呈正相关(F=145．7,P<0．01)．结论:在人结肠癌细胞株Lovo中,基因 RUNX3可能因过甲基化而导致转录失活, RUNX3基因重新表达能抑制细胞生长,并能诱导部分细胞凋亡．

RUNX3基因启动子甲基化与早期非小细胞肺癌的预后

目的:探讨RUNX3基因启动子甲基化与非小细胞肺癌(NSCLC)预后的关系。方法:酚/氯仿法提取80例术后接受顺铂辅助化疗NSCLC患者的肺癌组织标本DNA,巢氏甲基化特异性PCR(nMSP)检测RUNX3启动子甲基化状态,并回顾性分析甲基化状态与临床病理特征、术后无病生存、总生存的关系。结果:80例NSCLC肿瘤样本中20例检测到RUNX3基因启动子甲基化(25.0%)。RUNX3启动子基因甲基化与病理类型相关(P=0.020),且腺癌(36%)高于鳞癌(11%)。N分期(OR:4.898,P<0.001)、RUNX3基因启动子甲基化(OR:20.293,P=0.011)是影响术后无病生存的独立危险因素。单因素K-M生存分析、Cox多因素分析表明RUNX3基因甲基化(RR:2.345,95%CI:1.130～4.865,P=0.022)是影响总生存的独立危险因素。结论:RUNX3基因甲基化是影响术后NSCLC无病生存和总生存的独立影响因素。

宫颈鳞癌RUNX3基因启动子区甲基化及其临床意义

目的研究宫颈鳞状细胞癌(鳞癌)组织中RUNX3基因启动子甲基化状态及临床意义。方法采用甲基化特异性聚合酶链式反应(MSP)测定50例宫颈鳞癌(CSCC组)、50例宫颈上皮内瘤变(CIN组)手术标本及10例正常宫颈组织(对照组)中RUNX3基因的甲基化状态,分析RUNX3基因甲基化与宫颈鳞癌临床病理学特征的关系。结果 CSCC组和CIN组中分别有27例(54%)和17例(34%)存在RUNX3基因启动子甲基化,而对照组未检出;三组间RUNX3基因启动子甲基化的发生率比较差异有统计学意义(χ2=11.500,P<0.005),CIN不同级别组(CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ级)的RUNX3基因启动子甲基化发生率比较差异有统计学意义(χ2=9.655,P<0.05)。RUNX3基因启动子甲基化与宫颈鳞癌的分化程度及是否发生淋巴结转移有关(r=-0.367,P=0.017;r=0.288,P=0.042)。结论 RUNX3作为抑癌基因参与宫颈鳞癌的发生和发展,可作为对宫颈鳞癌患者进行预后评估的生物学指标。

runx3启动子区域甲基化在急性白血病中意义的初步研究

为了探讨runx3基因启动子区域甲基化在急性白血病发病机制中的作用及其临床意义,采用甲基化特异性PCR(MS-PCR)检测CHRF、U937、K562细胞系及40例急性白血病患者和10例正常人骨髓或外周血runx3基因启动子区域的甲基化情况,并用RT-PCR方法检测各系runx3基因的表达情况。结果发现,健康人及细胞系中均未检测到甲基化,而检测到该基因的表达;40例急性白血病患者甲基化检测阳性率35%(14/40),明显高于正常人0%,差异有统计学意义(p<0.05),其中AML30.43%(7/23),ALL41.18%(7/17),p>0.25,两者无明显差异。甲基化检测阳性患者均未检测到runx3基因的表达。存在runx3启动子区域甲基化患者化疗前骨髓原始细胞数均高于runx3启动子区域未甲基化患者(p<0.01),而且首次化疗后完全缓解率低于未甲基化者(p<0.05),差异有显著性。结论:runx3基因启动子区域甲基化在急性白血病的发病机制中起一定的作用,其检测对估计白血病预后具有临床意义。

人外周血CD8^+T细胞Runx3的基因克隆及其原核表达

目的:克隆人Runx3基因全长编码区的cDNA,进行鉴定和测序分析,并利用载体pQE30在大肠埃希菌(M15)原核表达人Runx3基因全长序列,为从转录水平探讨Runx3基因与免疫相关性疾病以及肿瘤发生发展的关系奠定基础。方法:MACS分离外周CD8+T细胞;采用RT-PCR方法从人外周血CD8+T细胞获得Runx3基因的cDNA,并连接pMD19-T载体导入大肠埃希菌DH5α,选择阳性克隆,应用M13F/R通用引物进行双向反应测序,以作序列鉴定。利用PCR技术从克隆载体pMD19-T/Runx3获得人Runx3的全长编码序列,亚克隆至原核表达载体pQE30,形成重组表达质粒pQE30/Runx3;酶切鉴定挑选阳性重组质粒转化大肠埃希菌M15,测序鉴定后经IPTG30℃诱导4h,SDS-PAGE电泳判断以包涵体形式存在的带有His标签的融合蛋白并进行Western blot鉴定。结果:扩增获得的Runx3基因CDS区全长1248bp,编码415个氨基酸残基,与GenBank中发表的序列完全一致。成功构建了原核表达载体pQE30/Runx3,并在工程菌M15中获得大量表达.结论:获得了人Runx3基因的克隆,并成功原核表达和制备出人Runx3融合蛋白。

RUNX3基因启动子甲基化与乳腺癌临床病理特征及预后因素的关系

目的探讨乳腺癌中抑癌基因RUNX3启动子甲基化状态与散发性乳腺浸润性导管癌临床病理特征及预后因素的关系。方法运用甲基化特异性PCR(MSP)检测40例乳腺浸润性导管癌和15例乳腺增生病标本中RUNX3基因启动子甲基化状态,同时采用免疫组化SP法检测40例乳腺浸润性导管癌标本中ER、PR、C-erbB-2的表达水平。结果乳腺浸润性导管癌组织中RUNX3基因启动子甲基化频率为47.5%,乳腺增生病组织中均未发生甲基化;RUNX3基因启动子甲基化与患者的年龄、淋巴结转移、PR、C-erbB-2阳性表达无相关性,与患者的病理组织学分级、临床分期、ER的阳性表达有相关性,差异有统计学意义。结论RUNX3基因甲基化在散发性乳腺浸润性导管癌恶性进展中有一定作用,有可能成为乳腺癌预后不良的分子检测指标。

肝细胞癌中Runx3基因表达状态分析及预后评估价值的研究

目的:探讨肝细胞癌组织中Runx3基因的表达及其与肝细胞癌临床病理学特征和预后的关系。方法:采用免疫组化SP法检测RUNX3蛋白在52例肝细胞癌患者肿瘤组织及其癌旁组织中的表达。结果:在肝细胞癌组织中,RUNX3蛋白的阳性表达率仅为34.6%,明显低于癌旁正常组织(92.3%)中的表达率,差异具有统计学意义(P<0.05);RUNX3蛋白表达与肝细胞癌有无侵润、临床分期、淋巴结转移等相关,而与病人的年龄、肿瘤类型等无关;术后随访显示,RUNX3蛋白表达阳性者的生存率高于表达阴性者(P<0.05)。结论:从肝细胞癌中RUNX3蛋白表达明显降低,且RUNX3蛋白表达与肝细胞癌有无侵润、临床分期、淋巴结转移等相关等实验结果分析,说明Runx3基因的功能失活与肝细胞癌的发生、发展密切相关;RUNX3蛋白在肝细胞癌中的表达状态对评价该病患者的预后具有一定的价值。

肝癌患者血清p16、Runx3基因甲基化及其与临床病理参数的相关性

目的:探讨血清p16和Runx3基因启动子区CpG岛异常甲基化与原发性肝癌(hepatocellular carcino-ma,HCC)关系。方法:采用甲基化特异性PCR(MSP)法对56例HCC患者、40名健康体检者、40例乙肝患者和40例肝硬化患者血清p16和Runx3基因甲基化状况进行检测。结果:HCC患者血清p16和Runx3基因甲基化检出率分别为69.6%(39/56)和66.1%(37/56),而肝硬化患者、乙肝患者和健康体检者均未检出基因甲基化,与HCC组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。Logistic回归分析结果均未发现以α=0.05为显著性水准进入回归模型的变量。结论:HCC患者血清中可检测到p16和Runx3基因的甲基化,有助于肝癌的诊断、治疗和预后评估。

结直肠癌中Runx3和C-myc基因的表达

目的探讨Runx3和C-myc基因在结直肠癌组织中的表达及其与临床病理参数的关系。方法采用实时荧光定量PCR技术检测38例结直肠癌病人的癌组织及相应癌旁正常组织(距癌缘>5 cm)中Runx3 mRNA和C-myc mRNA的表达水平;Western-blot免疫印迹法检测63例结直肠癌病人的癌组织及相应癌旁正常组织中Runx3蛋白和C-myc蛋白的表达水平。将实验数据按照临床病理特点进行分层分析,采用统计软件SPSS 13.0进行统计,了解Runx3、C-myc的表达与结直肠癌患者主要临床病理参数之间的关联性。结果 mRNA水平与蛋白水平提示:Runx3在结直肠癌组织中的表达下调,C-myc在结直肠癌组织中的表达上调,二者的蛋白表达呈负相关(Protein levels,r=-0.398,P=0.001)。且其各自的表达在不同Dukes分期、肿瘤浸润深度、淋巴结转移状态及病理分化类型差异均具有统计学意义(P<0.05),临床分期越晚、病理分化越低,Runx3表达下调、C-myc表达上调越明显。结论 Runx3和C-myc基因表达异常,参与了结直肠癌的发生、发展,并与病员临床病理参数密切相关。

5-Aza-CdR对人卵巢癌3AO、SKOV3细胞增殖凋亡及抑癌基因RUNX3表达的影响

目的探讨5-氮-2'脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对人卵巢癌3AO及SKOV3细胞增殖凋亡及抑癌基因RUNX3表达的影响。方法以浓度为0.5、5、50μmol/L的5-Aza-CdR处理人卵巢癌细胞株3AO及SKOV3 3d,常规培养5 d后采用四唑盐(MTT)比色法观察细胞的生长活性,以半定量RT-PCR法检测抑癌基因RUNX3mRNA的表达,并用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果5-Aza-CdR能明显抑制肿瘤细胞生长,随5-Aza-CdR浓度增加,细胞生长速率下降;药物处理后RUNX3 mRNA的表达明显高于处理前(P<0.05),且存在明显剂量依赖性。5-Aza-CdR处理后3AO及SKOV3细胞凋亡率均高于处理前(P均<0.05),细胞凋亡率与5-Aza-CdR剂量均呈正相关。结论5-Aza-CdR能使RUNX3基因去甲基化,增强其抑癌功能。

RUNX3基因表达对判断人乳腺癌预后的价值

目的探讨乳腺癌组织中RUNX3基因的表达及其与乳腺癌生物学特征和预后的关系。方法采用免疫组化SP法检测RUNX3蛋白在88例乳腺癌、40例乳腺纤维腺瘤和40例乳腺增生病组织中的表达。结果(1)RUNX3在乳腺癌中的阳性表达率为35.23%,明显低于在乳腺纤维腺瘤(85%)及乳腺增生病(87.5%)组织中的表达率,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)RUNX3蛋白表达与乳腺癌有无浸润、临床分期、淋巴结转移、ER、PR表达相关,而与病人的年龄、肿瘤类型、病理分级无关。(3)RUNX3表达阳性者的生存率高于表达阴性者的生存率(P<0.05)。RUNX3阳性表达者,术后生存时间长。结论(1)乳腺癌组织中RUNX3蛋白表达降低,证明RUNX3基因可能作为一个抑癌基因参与乳腺癌的发生。(2)随着乳腺癌的临床进展,RUNX3表达下降。(3)RUNX3在乳腺癌中的表达对评价患者的预后有一定价值。

抑癌基因RUNX3基因在结直肠癌中的表达及临床意义

目的探讨RUNX3基因在结直肠癌中表达的生物学意义。方法应用免疫组化方法检测120例结直肠癌组织RUNX3基因蛋白表达情况。结果 RUNX3基因与肿瘤分布无关,结肠和直肠表达无相关性。RUNX3基因在分化良好的肿瘤中比中等或低分化的表达高,并与Dukes分期相关,有转移组明显低于无转移组(P<0.05)。结论 RUNX3基因表达缺失与结直肠癌的侵袭、转移能力密切相关,可反映结直肠癌的预后,可作为判断结直肠癌生物学行为的一个指标。

锯齿状病变组织中Runx3基因的甲基化及蛋白表达

目的探讨Runx3基因启动子区CpG岛甲基化状态和蛋白表达在锯齿状病变发生与癌变通路中的作用及意义。方法用TaqMan探针为基础的实时定量PCR(Methylight)法检测77例锯齿状病变(29例HP、29例SSA/P和19例TSA)、16例正常结直肠组织和14例结直肠癌中Runx3基因CpG岛甲基化状态,同时用免疫组化法检测相应组织中Runx3蛋白的表达;并分析两者之间的关系。结果 Runx3启动子CpG岛甲基化率在正常和HP、SSA/P、TSA、CRC分别为12.5%(2/16)和17.2%(5/29)、51.7%(15/29)、63.2%(12/19)和78.6%(11/14)。Runx3蛋白阳性表达率在正常和HP、SSA/P、TSA、CRC分别为81.3%(13/16)和72.2%(21/29)、48.3%(14/29)、31.6%(6/19)、21.4%(3/14)。SSA/P、TSA和CRC 3组中Runx3甲基化与Runx3蛋白表达结果具有相关性(P<0.05),且为负相关。结论 Runx3基因启动子区域甲基化是诱导Runx3蛋白表达下调或缺失的主要原因,在锯齿状病变尤其是锯齿状腺瘤的发生及癌变通路中起重要作用。

胃癌中RUNX3、cyclinE和P21蛋白表达与患者生存的关系

目的:探讨胃癌RUNX3蛋白表达对细胞周期蛋白的影响及其与胃癌患者生存和生物学特性的关系。方法:应用免疫组化,分析RUNX3蛋白的表达;应用流式细胞术,分析cyclinE和P21蛋白表达;采用Kaplan-Meier限乘法计算生存率。结果:在56例胃癌中RUNX3蛋白、cyclinE和P21蛋白的阳性表达率分别为44.6%、64.3%和32.1%。胃癌细胞RUNX3蛋白表达与淋巴转移和远处转移有关(P<0.05)。胃癌细胞cyclinE的表达与浸润深度、淋巴转移和远处转移有关(P<0.05)。而胃癌细胞P21的表达与远处转移有关(P<0.05)。胃癌细胞中RUNX3和P21的表达之间呈明显正相关(r=0.57,P<0.05),而与cyclinE的表达之间无相关性(r=0.25,P>0.05)。用Kaplan-Meier生存曲线经Log-rank检验发现,RUNX3和cyclinE的阳性表达与生存相关(P<0.05),P21的阳性表达与生存无关(P>0.05)。结论:RUNX3蛋白可能通过影响P21蛋白的表达影响胃癌的发生发展;检测RUNX3和cyclinE的表达可作为反映胃癌临床病理学特点和预后的指标。

5-氮-2'脱氧胞苷对Reh细胞增殖及RUNX3基因启动子区甲基化状态的影响

目的:探讨5-氮-2'脱氧胞苷对Reh细胞增殖及其抑癌基因RUNX3启动子区甲基化状态的影响。方法:应用MTT法观察5-氮-2'脱氧胞苷对Reh细胞增殖的抑制能力;采用甲基化特异性PCR(MSP)检测5-氮-2'脱氧胞苷干预前后RUNX3基因启动子区的甲基化状况;应用RT-PCR检测干预前后RUNX3基因的mRNA表达水平的变化。结果:经5-氮-2'脱氧胞苷处理后,RUNX3基因启动子高甲基化的区域发生部分去甲基化,5-氮-2'脱氧胞苷处理前启动子高甲基化的RUNX3 mRNA未见表达,而在其处理后该基因可见重新表达,经5-氮-2'脱氧胞苷处理后,Reh细胞生长缓慢。结论:5-氮-2'脱氧胞苷能使Reh细胞RUNX3基因启动子区发生部分去甲基化,从而调控RUNX3基因表达并能抑制其细胞生长。启动子区异常甲基化是白血病Reh细胞RUNX3基因失活的主要原因之一。

5-氮杂-2’-脱氧胞苷对HepG2细胞RUNX3基因表达及细胞增殖的影响

目的探讨人肝癌细胞系HepG2经5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2-’deoxycytid ine,5-Aza-CdR)处理后诱导高甲基化失活的RUNX3基因重新表达的可能性及对细胞生长的影响,寻找抗癌治疗的新靶点。方法RT-PCR检测抑癌基因RUNX3 mRNA的表达;MTT、集落形成实验观察细胞的生长活性;流式细胞术和透射电镜分析细胞周期及细胞凋亡的变化。结果肝癌细胞经不同浓度之5-Aza-CdR处理后,原无RUNX3 mRNA表达的细胞均检出基因重新表达,细胞生长速度出现不同程度减慢及细胞克隆形成率显著降低(P<0.01)。用药后肝癌细胞发生明显的S期阻滞,电镜显示肝癌细胞形态学改变。结论去甲基化制剂5-Aza-CdR能有效地激活肝癌细胞系HepG2因高甲基化所致RUNX3基因沉默的再转录,诱导该基因的表达,从而抑制肿瘤细胞生长。

人乳腺癌细胞系RUNX3基因启动子甲基化状态研究

目的:探讨人乳腺癌细胞系中抑癌基因RUNX3启动子甲基化状态,并分析其与RUNX3基因表达的相关性。方法:运用甲基化特异性PCR(MSP)检测5种乳腺癌细胞系和一种人类正常乳腺细胞系中RUNX3启动子甲基化状态,运用RT-PCR和Western印迹检测这些细胞系中RUNX3基因mRNA和蛋白的表达。结果:在6种细胞系中,有两种(T47D、MCF7)呈高甲基化状态,并且这两种细胞系的RUNX3 mRNA和蛋白表达阴性。SKBR3中没有检测出RUNX3启动子区的甲基化,但RUNX3 mRNA和蛋白表达阴性。结论:乳腺癌细胞系中RUNX3基因由于启动子区甲基化而失活,但尚有其它失活机制存在,需进一步研究探讨。

RUNX3基因364位点C→T突变与胃癌关系的研究

目的:研究RUNX3基因C364T突变在我国胃癌高、低发区普通人群和胃癌患者中的分布,H．pylori 感染者胃粘膜的RUNX3基因C364T突变率,探讨此突变与我国胃癌发生的关系。方法:采用PCR-限制性片段长度 多态性(RFLP)分析法检测胃癌高发区169名普通人、86例胃癌患者和胃癌低发区。192名普通人和92例胃癌患者的 RUNX3基因多态性。同时比较胃癌低发区普通人胃粘膜H．pylori阳性和阴性者的RUNX3突变率。结果:在胃癌 高、低发区,胃癌患者RUNX3基因C364T突变频率与普通人群无显著差异(X2=0．57和0．16,P>0．05)。与肿瘤类 型也无明显关系。低发区H．pylori阳性者粘膜中,RUNX3基因突变率也无显著增高。结论:RUNX3基因C364T突变 可能不是我国胃癌高、低发区胃癌的遗传易感因素。而且H．pylori感染导致胃癌形成可能不由RUNX3基因C364T 突变参与。