家蚕RYBP基因的结构与表达模式分析及转基因干涉系统的建立

多梳蛋白(polycomb group,PcG)是一类对生物有机体生长发育很重要的转录抑制因子,参与有机体的发育调控。Ring和YY1结合蛋白(Ring and YY1 binding protein,RYBP)是在小鼠(Mus musculus)和果蝇(Drosophila melanogaster)中推断的PcG蛋白成员。基于生物信息学分析方法,设计引物克隆了家蚕的RYBP基因(BmRYBP);序列结构分析显示该基因有一个420 bp的完整ORF,由3个外显子和2个内含子组成,编码139个氨基酸,预测其蛋白质分子质量为15.4 kD,等电点为10.36,N端的20～44 aa有一个与蛋白间相互作用有关的锌指结构域(ZnF-RBZ);半定量RT-PCR分析显示,该基因在家蚕5龄3 d幼虫生殖腺中高水平转录;基于GAL4/UAS双元系统,构建了具有BmRYBP序列反向重复结构的转基因干涉表达载体,通过显微注射家蚕早期胚胎,获得了UAS系统的转基因家蚕后代,为研究BmRYBP在家蚕生长发育过程中行使的功能奠定了基础。

RYBP基因沉默对HL-60细胞对化疗药物敏感性的影响

目的:用RNA干扰技术探讨白血病HL-60细胞株RYBP基因沉默后对化疗药物敏感性的影响。方法:构建针对RYBP基因的shRNA干扰质粒并建立稳定沉默RYBP基因的白血病HL-60细胞株,通过实时荧光定量PCR和Western blot检测确认RYBP基因在mRNA和蛋白水平的沉默效果。然后用DNA ladder及Annexin V标记的流式细胞术检测各组HL-60细胞凋亡的情况,用CCK-8法检测各组HL-60细胞对化疗药物阿糖胞苷和柔红霉素的敏感性。结果:成功构建的RYBP shRNA慢病毒载体能够有效沉默HL-60中RYBP基因的表达。在没有加入化疗药物时RYBP shRNA组凋亡率低于空载体对照组(NC组)(P<0.05);用阿糖胞苷处理时RYBP shRNA组凋亡率和抑制率均低于NC组(P<0.05);用柔红霉素处理时RYBP shRNA组凋亡率虽然低于NC组,但是抑制率差异不明显。结论:HL-60细胞RYBP基因沉默能抑制细胞的凋亡,明显降低对阿糖胞苷的敏感性,但是对柔红霉素敏感性的改变不明显。

牛Rybp基因的表达特性分析

【目的】研究牛Rybp基因时空表达图谱,为Rybp基因的功能研究奠定基础。【方法】利用实时定量PCR方法,检测Rybp基因在秦川牛16种组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、睾丸、腹膜脂肪、心包脂肪、背最长肌、里脊、大肠、小肠、瘤胃、网胃、皱胃和瓣胃)、5个不同发育阶段(6,12,18,24和60月龄)肌肉、脂肪组织以及不同分化阶段(第0,2,4,6,8和10天)牛成肌细胞中的表达特性。【结果】Rybp基因在成年秦川牛睾丸组织中的表达量远远高于其他组织,是背最长肌的365倍,而在背最长肌、里脊、心脏等组织中的表达量相对较低。Rybp基因在60月龄肌肉组织中表达量是6月龄的7倍,在6,12,18,24月龄表达量呈微弱上升趋势,但差异不显著;Rybp基因在6,12,18,24月龄脂肪组织中的表达量分别是60月龄的8.5,6.5,5.6和2.1倍,差异达显著水平;Rybp基因在成肌细胞分化第2,4,6,8,10天的表达量分别是第0天的3.6,5.0,9.9,7.0和4.3倍。【结论】随着秦川牛年龄的增加,Rybp基因在肌肉组织中的表达水平逐渐升高,在脂肪组织中的表达水平显著下降;在不同分化阶段成肌细胞中,随着成肌细胞分化进程的推进,Rybp基因表达水平逐渐升高,而当分化减速后,Rybp基因表达水平逐渐降低。牛Rybp基因可能对牛肌细胞分化起抑制作用。

RYBP基因稳定沉默的HL-60细胞系的构建

目的利用慢病毒介导的RNA干扰（RNAi）技术，建立RYBP基因稳定沉默的HL．60细胞系。方法设计针对RYBP基因的5条短发夹状RNA（shRNA）序列，构建RYBPshRNA慢病毒重组载体，分别包装成慢病毒颗粒，直接感染HL-60细胞，同时设空载体和阴性对照shRNA慢病毒对照组。通过观察绿色荧光蛋白表达以监测感染效率，经嘌呤霉素（终质量浓度8μg／ml）筛选出稳定感染细胞。Westernblot实验初步鉴定出蛋白水平最低的RYBPshRNA组，用实时定量聚合酶链反应（PCR）进一步检测该组细胞mRNA表达水平。结果慢病毒感染的HL-60细胞经嘌呤霉素筛选成功，与对照组比较，5条RYBPshRNA组细胞RYBP表达均有不同程度减低（P〈0．01），其中以shRNA2沉默效果最佳，且shRNA2组的RYBP基因mRNA水平降低了95％以上（P〈0．05）。结论慢病毒介导的shRNA2能高效、稳定地沉默RYBP基因的表达，成功构建了RYBP基因稳定沉默的HL-60细胞系。