长顺绿壳蛋鸡ITPR1基因RYDR-ITPR结构域的多态性对蛋壳品质的影响

为了探究贵州特产长顺绿壳蛋鸡ITPR1基因RYDR-ITPR结构域的多态性对蛋壳品质的影响,采用在线引物设计软件Primer Premier 3.0设计1对引物,扩增ITPR1基因RYDR-ITPR结构域,利用双向直接测序和序列比对法挖掘单核苷酸多态性(SNP)位点,应用SPSS 18.0软件分析SNP位点对长顺绿壳蛋鸡蛋壳品质的影响。结果显示,在ITPR1基因第17~19内含子区共发现3个SNP位点,分别为位于18内含子上的g.18853584 G>T、g.18853600 A>G突变位点和19外显子上的g.18853848 C>T突变位点;3个SNP位点均为中度多态,均未偏离Hardy-Weinberg平衡(P>0.05),共检测到4种单倍型和7种双倍型。关联分析结果显示,位于19外显子上的g.18853848 C>T突变对蛋壳厚度有显著影响,TT、CC基因型显著高于TC基因型(P<0.05);双倍型H3H3的蛋壳厚度和蛋壳强度测定值最高。综上,长顺绿壳蛋鸡ITPR1基因RYDR-ITPR结构域中g.18853848 C>T突变可能是影响蛋壳厚度的标记位点,双倍型H3H3可能是蛋壳厚度和蛋壳强度的有利双倍型。

抑制lncRNA TUG1下调核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白1炎症小体在延缓阿尔茨海默病进展的作用

目的探讨敲低长链非编码RNA(lncRNA)牛磺酸上调基因1(TUG1)抑制核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白1(NLRP1)炎症小体在缓解阿尔茨海默病进展中的作用。方法选取9~10周龄遗传背景为C57/BL6的野生型小鼠(WT组,10只)或淀粉样前体蛋白(APP)/早老素1(PS1)转基因小鼠(30只)。APP/PS1转基因小鼠随机分为模型(model)组,模型+敲低lncRNA TUG1组[model+lncRNA TUG1短发夹RNA(shRNA)组]和model+shRNA非靶标(NT)组,每组10只。分别采集12周龄第1天(3月龄)和32周龄第1天(8月龄)小鼠外周血和脑皮质组织,并分离皮质中的原代小胶质细胞和原代星形胶质细胞,每个时间点每组5只小鼠。Real-time PCR分别测定3月龄和8月龄上述4个分组小鼠脑皮质组织和原代小胶质细胞中lncRNA TUG1和巨噬细胞移动抑制因子(MIF)mRNA的水平,以及原代星形胶质细胞中补体蛋白C1r和C1s mRNA的水平。ELISA法测定其外周血浆中MIF含量。对3月龄和8月龄小鼠脑皮质原代小胶质细胞和原代星形胶质细胞共培养。CCK-8法测定上述2种细胞的增殖能力。Western blotting分别测定3月龄和8月龄上述4个分组小鼠脑皮质组织中MIF、白细胞介素1β前体(pro-IL-1β)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、Caspase-1(p20)、Caspase-1(full)、NLRP1及NLRP3蛋白的表达水平。采用免疫荧光染色法测定8月龄各分组小鼠脑皮质组织中β淀粉样蛋白(Aβ)表达。结果3月龄和8月龄时,与WT组小鼠相比,model组小鼠脑皮质组织和原代小胶质细胞中lncRNA TUG1和MIF相对表达水平显著上调,原代小胶质细胞和原代星形胶质细胞增殖能力增强(P<0.05)。与model组相比,model+lncRNA TUG1 shRNA组小鼠脑皮质组织和原代小胶质细胞中lncRNA TUG1和MIF的相对表达水平显著降低,原代小胶质细胞和原代星形胶质细胞增殖能力降低(P<0.05)。与WT组相比,model组小鼠外周血浆中MIF含量显著升高;小鼠脑皮质组织中pro-IL-1β、ASC、Caspase-1(p20)、Caspase-1(full)、NLRP1以及NLRP3的蛋白表达水平显著升高;Aβ免疫荧光强度明显增强(P<0.05)。与model组相比,model+lncRNA TUG1 shRNA组小鼠外周血浆中MIF含量显著降低;小鼠脑皮质组织中pro-IL-1β、ASC、Caspase-1(p20)、Caspase-1(full)和NLRP1的蛋白表达水平显著降低,Aβ免疫荧光强度明显降低(P<0.05),而NLRP3蛋白质的表达水平无明显变化(P>0.05)。与model组相比,model+shRNA NT组小鼠上述所有检测指标差异均无显著性(P>0.05)。结论APP/PS1转基因小鼠脑皮质组织和原代小胶质细胞中lncRNA TUG1和MIF因子表达上调与脑皮质内NLRP1炎症小体激活成正相关,敲低lncRNA TUG1可缓解阿尔茨海默病的进展。

外周血受体相互作用蛋白激酶3、混合系列蛋白激酶样结构域水平与新生儿坏死性小肠结肠炎病情严重程度的关系

目的分析新生儿坏死性小肠结肠炎(NEC)患儿外周血受体相互作用蛋白激酶3(RIPK3)、混合系列蛋白激酶样结构域(MLKL)的表达情况及其与病情严重程度的关系。方法选取92例NEC患儿纳入NEC组,并根据病情严重程度进一步分为轻度NEC组(Ⅰ级)60例和重度NEC组(Ⅱ~Ⅲ级)32例,另选取同期诊治的60例腹股沟斜疝患儿纳入对照组。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测外周血RIPK3 mRNA、MLKL mRNA表达;采用Pearson相关分析法明确NEC组外周血RIPK3 mRNA与MLKL mRNA表达的相关性;采用免疫印迹法检测NEC回肠组织和正常回肠组织中RIPK3、MLKL蛋白表达;采用多因素Logistic回归分析明确重度NEC发生的独立危险因素。绘制受试者工作特征曲线,分析外周血RIPK3 mRNA、MLKL mRNA单独及联合预测重度NEC的价值。结果NEC组外周血RIPK3 mRNA、MLKL mRNA相对表达量分别为(2.41±0.52)、(3.03±0.64),高于对照组的(1.02±0.21)、(0.93±0.20),差异有统计学意义(P<0.001)。NEC回肠组织中RIPK3、MLKL蛋白相对灰度值分别为(1.20±0.21)、(1.13±0.24),高于正常回肠组织的(0.34±0.12)、(0.32±0.11),差异有统计学意义(P<0.05)。NEC组患儿外周血RIPK3 mRNA与MLKL mRNA相对表达量呈正相关(r=0.623,P<0.001)。重度NEC组合并气腹征、多器官功能障碍综合征、败血症者占比和RIPK3 mRNA、MLKL mRNA相对表达量均高于轻度NEC组,差异有统计学意义(P<0.05);RIPK3 mRNA、MLKL mRNA相对表达量升高是重度NEC发生的独立危险因素(P<0.05)。外周血RIPK3 mRNA、MLKL mRNA联合预测重度NEC的曲线下面积大于RIPK3 mRNA、MLKL mRNA单独预测(Z=4.127、4.261,P<0.05)。结论RIPK3 mRNA、MLKL mRNA在NEC患儿外周血中表达升高,两者均与NEC病情严重程度有关,且两者联合检测对重度NEC具有较高的预测价值。

Stat3蛋白氨基端转录激活结构域的鉴定

Stat3是一个在调控胚胎发育、细胞增殖、凋亡、炎症反应和血管生成等多种生理过程发挥关键作用的重要转录因子。Stat3蛋白有Stat3α和缺少羧基端转录激活结构域的Stat3β两个剪接异构体。Stat3基因纯合缺失突变的小鼠在早期胚胎死亡。表达Stat3β可逆转Stat3纯合缺失突变小鼠的胚胎致死表型,并可诱导其下游基因的短期表达,然而其潜在的转录激活结构域一直没有被测定和证实。为进一步解析Stat3蛋白的结构和功能,本研究构建并在酵母中表达了一系列Stat3蛋白的截短体,利用酵母双杂交和双荧光素酶报告基因实验,在酵母和哺乳动物细胞中证实了Stat3蛋白的第2~11位短肽(aa2-11)具有转录激活的作用。这一发现为表达Stat3β逆转Stat3基因缺失引起小鼠胚胎致死表型提供了一种可能的解释,也进一步加深了对Stat3蛋白结构和功能的了解和认识。

同源异型盒基因A5、三结构域蛋白14与结直肠癌的关系

目的探讨结直肠癌组织同源异型盒基因A5(HOXA5)、三结构域蛋白14(TRIM14)蛋白表达水平与临床病理特征及患者预后的关系。方法回顾性收集整理2016年5月至2018年5月期间于河南中医药大学郑州人民医院确诊的120例结直肠癌患者癌组织及癌旁组织标本及相关临床资料,采用免疫组化法检测组织HOXA5、TRIM14蛋白表达水平;分析HOXA5、TRIM14水平与结直肠癌患者临床病理特征及预后的关系;采用Kaplan-Meier法分析组织中HOXA5、TRIM14表达与结直肠癌5年生存率的关系;采用Cox比例风险回归模型分析结直肠癌5年预后影响因素。结果结直肠癌组织中TRIM14蛋白阳性率为73.33%,明显高于癌旁组织的10.00%,HOXA5蛋白阳性率为27.50%,明显低于癌旁组织的81.67%,差异均有统计学意义(P<0.05)。TRIM1蛋白阳性表达患者肿瘤低分化比例为42.05%,浸润深度T_(3)~T_(4)比例为72.73%,有淋巴结转移比例为47.73%,有远处转移比例为29.55%,明显高于TRIM1蛋白阴性表达的12.50%、37.50%、12.50%、6.25%,差异均有统计学意义(P<0.05);HOXA5蛋白阴性表达患者肿瘤低分化比例为41.38%,浸润深度T3~T4比例为77.01%,有淋巴结转移比例为48.28%,有远处转移比例为29.89%,明显高于HOXA5蛋白阳性表达的15.15%、27.27%、12.12%、6.06%,差异均有统计学意义(P<0.05)。结直肠癌组织中HOXA5阴性表达和TRIM14阳性表达患者的5年生存率分别为57.47%、59.09%,明显低于HOXA5阳性表达患者的90.91%和TRIM14阴性表达患者的87.50%,差异均有统计学意义(P<0.05)。死亡组患者有淋巴结转移比例为85.00%,有远处转移比例为55.00%,明显高于生存组的15.00%、7.50%,差异均有统计学意义(P<0.05)。经Cox比例风险回归模型分析结果显示,TRIM14是结直肠癌患者5年内死亡的独立危险因素,HOXA5是结直肠癌患者5年内死亡的保护因素(P<0.05)。结论结直肠癌组织中TRIM14呈高表达状态,HOXA5呈低表达状态,两者均与TNM分期、肿瘤分化程度、浸润深度等临床病理特征及预后相关,有作为预后标志物及治疗靶点的潜力。

三结构域TRIM34蛋白的相关功能研究进展

三结构域蛋白(tripartite-motif proteins,TRIM)是由三段结构域组成并以其独特结构命名的基本蛋白,参与调节细胞信号传导、凋亡、免疫应答、炎症和肿瘤调控等多种生理病理过程。目前在人类中已知的TRIM蛋白有80多种,TRIM34蛋白是其蛋白家族的重要成员,既往对于TRIM34蛋白的研究相对局限。最近的研究表明,TRIM34在抗肿瘤治疗、预测肿瘤预后、抗HIV病毒和微生物感染、以及调控免疫应答等过程中发挥了重要作用。本文在简要总结TRIM34蛋白的分子结构和功能结构域特点的基础上,详细介绍了TRIM34蛋白的共性特征,聚焦荟萃了TRIM34蛋白的促进细胞凋亡、阻断炎症肿瘤通路、预测免疫治疗疗效、预防逆转录病毒感染和刺激多核细胞形成等功能,为全面认识该蛋白提供一定的理论参考。

婆罗双树样基因4、嗅素结构域家族蛋白4及激活素A表达水平与类风湿性关节炎患者临床特征的相关性及其对合并关节畸形的预测价值

目的探讨血清婆罗双树样基因4(SALL4)mRNA、嗅素结构域家族蛋白4(OLFM4)mRNA和激活素A(Activin-A)表达水平与类风湿性关节炎(RA)患者临床特征的相关性及其对合并关节畸形的预测价值。方法选择2021年1月至2023年4月河南中医药大学第三附属医院收治的130例RA患者为RA组,另选择同期于门诊体检的102例健康志愿者为对照组。RA组患者于入院第2天、对照组受试者于体检当日,采用酶联免疫吸附试验检测血清Activin-A水平,反转录-聚合酶链反应检测2组受试者血清SALL4、OLFM4 mRNA相对表达量。比较RA组与对照组受试者及不同临床特征RA患者血清SALL4 mRNA、OLFM4 mRNA、Activin-A水平,采用单因素和多因素logistic回归分析RA合并关节畸形的影响因素,采用受试者操作特征曲线分析SALL4 mRNA、OLFM4 mRNA、Activin-A预测RA合并关节畸形的价值。结果RA组患者血清SALL4 mRNA、OLFM4 mRNA相对表达量及Activin-A水平显著高于对照组(P<0.05)。疾病活动度重度患者血清SALL4 mRNA、OLFM4 mRNA相对表达量及Activin-A水平显著高于中度和轻度患者,疾病活动度中度患者血清SALL4 mRNA、OLFM4 mRNA相对表达量及Activin-A水平显著高于轻度患者(P<0.05)。受累关节数目≥10个、滑膜炎持续时间≥6周、关节畸形患者血清SALL4 mRNA、OLFM4 mRNA相对表达量及Activin-A水平分别高于受累关节数目<10个、滑膜炎持续时间<6周、无关节畸形患者(P<0.05)。不同年龄、性别患者血清SALL4 mRNA、OLFM4 mRNA相对表达量及Activin-A水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。多因素logistic回归分析结果显示,疾病活动重度及SALL4 mRNA、OLFM4 mRNA、Activin-A水平升高是RA合并关节畸形的危险因素(P<0.05)。Activin-A、SALL4 mRNA、OLFM4 mRNA预测RA合并关节畸形的截断值分别为15.06 pg·L^(-1)、3.412、3.802,曲线下面积分别为0.699、0.693、0.756,SALL4 mRNA、OLFM4 mRNA、Activin-A联合预测RA合并关节畸形的曲线下面积为0.892,联合预测的曲线下面积显著高于单独预测(Z=4.171、2.785、3.626,P<0.05)。结论RA患者血清SALL4 mRNA、OLFM4 mRNA及Activin-A水平增高与RA疾病活动度、受累关节数目、滑膜炎持续时间、关节畸形有关。血清SALL4 mRNA、OLFM4 mRNA、Activin-A联合预测RA合并关节畸形的效能高于三者单独预测。

基于语言模型的蛋白质结构域边界预测方法

蛋白质结构域对于蛋白质结构和功能研究具有重要意义。针对目前从头预测蛋白质结构域的方法普遍存在精度不高、耗费资源多等问题,提出了一种基于语言模型的蛋白质结构域边界预测方法DomTransformer,该方法基于蛋白质结构分类数据库(CATH)、蛋白质结构预测关键评估(CASP)竞赛数据,以及在AFDB(AlphaFold protein structure database)基础上建立的域数据库等共同构建数据集,搭建了基于Transformer网络架构和稀疏多头自注意力机制的网络模型,引入了新的特征、接触数和域级MSA(Domain multiple sequence alignment),通过直接预测结构域边界来解决数据不平衡等问题。在独立测试集上的测试结果表明了DomTransformer的有效性。

艾司氯胺酮通过糖原合成酶激酶-3β/NOD样受体热蛋白结构域蛋白3通路改善新生鼠缺氧缺血性心肌损伤的研究

目的基于糖原合成酶激酶-3β/NOD样受体热蛋白结构域蛋白3(GSK-3β/NLRP3)通路探讨艾司氯胺酮对新生鼠缺氧缺血性心肌损伤的作用。方法将30只新生大鼠随机分为假手术组、模型组及艾司氯胺酮组,每组10只。假手术组新生鼠行颈部正中切口,暴露双侧颈总动脉;模型组和艾司氯胺酮组新生鼠采用结扎颈总动脉联合低氧环境建立缺血缺氧模型;艾司氯胺酮组新生鼠给予艾司氯胺酮干预(50 mg/kg)。检测各组新生鼠左心室射血分数(LVEF)、左心室短轴缩短率(LVFS)、左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD)、血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白I(cTnI)、乳酸脱氢酶(LDH)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6、IL-1β水平,心肌损伤、心肌细胞凋亡及凋亡蛋白半胱氨酸蛋白酶1/3/9(caspase 1/3/9)水平,心肌组织中性粒细胞浸润情况,以及心肌组织中GSK-3β、NLRP3蛋白水平变化。结果相比于假手术组,模型组新生鼠LVEF、LVFS降低,LVEDD、LVESD增高,且艾司氯胺酮组新生鼠LVEF、LVFS高于模型组,LVEDD、LVESD低于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。模型组血清CK-MB、cTnI、LDH、TNF-α、IL-6、IL-1β水平,心肌损伤及凋亡,心肌组织切割的caspase 1/3/9蛋白水平、中性粒细胞数量、GSK-3β、NLRP3蛋白水平增加,且艾司氯胺酮组上述指标低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论艾司氯胺酮通过抑制炎症反应改善新生鼠缺氧缺血性心肌损伤,其作用机制与GSK-3β/NLRP3通路有关。

E3泛素连接酶三结构域蛋白59对非小细胞肺癌细胞增殖和侵袭的影响

目的探讨三结构域蛋白59(TRIM59)对非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及作用机制。方法将非小细胞肺癌细胞系A549分为siControl组、siTRIM59组、Flag-Vector组和Flag-TRIM59组,用CCK-8实验检测细胞增殖活力;用TUNEL染色实验检测细胞凋亡率;用划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力;用蛋白质免疫印记实验检测AKT表达水平和磷酸化水平。结果与siControl组相比,siTRIM59组细胞增殖活力下降(P<0.05),凋亡比例升高(P<0.05),细胞迁移率降低(P<0.05),侵袭到Transwell下层小室的细胞数减少(P<0.05),AKT磷酸化水平下降。与Flag-Vector组相比,Flag-TRIM59组细胞增殖活力增强(P<0.05),凋亡比例降低(P<0.05),细胞迁移率升高(P<0.05),侵袭到Transwell下层小室的细胞数增加(P<0.05),AKT磷酸化水平上升。结论TRIM59促进非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,以及AKT的磷酸化。

海洋链霉菌酮合成酶结构域基因的克隆及分析

海洋链霉菌通过聚酮合酶(PKS)合成许多结构和功能多样且具有药用价值的聚酮化合物(PKs),酮合成酶结构域(KS)作为PKS的核心结构域,可催化底物与伸长的聚酮之间的脱羧缩合,在聚酮化合物生物合成中起着重要作用。本文通过对从海洋链霉菌Streptomyces sp.X66基因组DNA克隆获得的ks基因的生物信息学分析表明,该ks基因序列长945 bp,BLAST序列比对显示其具有典型的酮合酶结构域的功能区域。理化分析显示其拟编码309个氨基酸,理论等电点为6.60,原子组成为C1401H2239N425O419S8,不稳定指数为42.11,平均亲水系数为0.112,编码产物为酸性疏水不稳定蛋白,且不含信号肽和跨膜结构,二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主,SDS-PAGE显示其分子量约为55 kDa。通过对ks基因的研究,为进一步解析聚酮化合物合成代谢中的调控机制及组合生物学和体外酶系合成聚酮化合物提供参考。

衔接蛋白失能同源物2通过抑制NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3对结核性胸膜炎大鼠炎症和氧化应激的影响

目的:探讨衔接蛋白失能同源物2(DAB2)抑制NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)对结核性胸膜炎大鼠炎症和氧化应激的影响。方法:按照随机数字法将60只SPF级雄性SD大鼠分为四组,每组40只。除正常对照组外,结核性胸膜炎组、DAB2组和pcDNA-NLRP3组进行建模处理,以第2天是否抽出胸腔积液为模型建立成功。正常对照组不注射结核分枝杆菌H37RV悬液,DAB2组建模后第2天静脉注射AAV9-DAB2质粒,每天1次,连续注射7 d,DAB2+pcDNA-NLRP3组在注射AAV9-DAB2质粒500μg/L的同时注射pcDNA-NLRP380μl,正常对照组和结核性胸膜炎组的大鼠尾静脉注射0.9%氯化钠溶液。进行各组呼吸功能指标测定,收集胸腔积液,记录积液量,观察3、5、7 d的胸腔积液粘连性情况,HE染色观察胸膜组织病理学情况,Western blot检测胸膜组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-8(IL-8)、基质金属蛋白酶1(MMP-1)和MMP-9蛋白表达,荧光探针DCFH-DA分析检测活性氧(ROS)的水平。结果:与正常组相比,结核性胸膜炎组的大鼠的胸腔积液和胸膜厚度明显增加,用力肺活量(FVC)、最大呼气流量(PEF)、用力呼气容积(FEV)0.3和FEV0.3/FVC显著降低,TNF-α、IL-8、MMP-1和MMP-9蛋白表达显著升高,基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP-1)蛋白表达显著降低,丙二醛(MDA)水平升高,超氧化物歧化酶(SOD)水平降低,ROS累积量明显升高(均P<0.001);与结核性胸膜炎组相比,DAB2组大鼠胸腔积液和胸膜厚度显著降低,FVC、PEF、FEV0.3和FEV0.3/FVC明显升高,DAB2组大鼠胸膜组织中的TNF-α、IL-8、MMP-1和MMP-9蛋白表达明显降低,TIMP-1水平明显升高,MDA水平降低,SOD水平升高,ROS累积量明显降低(均P<0.001);与DAB2组相比,DAB2+pcDNA-NLRP3组大鼠胸腔积液和胸膜厚度明显升高,FVC、PEF、FEV0.3和FEV0.3/FVC明显降低,DAB2+pcDNA-NLRP3组的TNF-α、IL-8、MMP-1和MMP-9蛋白表达明显升高,TIMP-1蛋白表达显著降低,MDA水平明显升高,SOD水平显著降低,ROS累积量显著升高(均P<0.001),各组大鼠在3、5、7 d的胸腔积液粘连性评分比较采用重复测量设计的方差分析,结果显示,不同时间点的胸腔积液粘连性评分比较差异具有统计学意义(均P<0.001);各组胸腔积液粘连性评分比较差异具有统计学意义(均P<0.001);各组胸腔积液粘连性评分变化趋势比较差异有统计学意义(均P<0.001);与模型组相比,DAB2组大鼠的胸膜内和肺间质内血管充血症状减轻,有少量的纤维组织增生,上皮样细胞团以及凝固型坏死也明显减少,淋巴细胞和中性粒细胞浸润也明显减少;与DAB2组相比,DAB2+pcDNA-NLRP3组大鼠的胸膜内和肺间质内血管充血症状加重,出现的纤维组织增生,上皮样细胞团以及凝固型坏死也明显增多,淋巴细胞和中性粒细胞浸润也明显增加。结论:DAB2通过抑制NLRP3的活性促进胸腔积液的吸收,降低胸膜厚度和粘连发生率,降低炎症反应和氧化应激水平,缓解结核性胸膜炎的进展。

薏苡附子败酱散通过抗三结构域蛋白21-Toll样受体4-t-核因子-κB信号通路对类风湿关节炎MH7A细胞的影响

目的观察不同浓度薏苡附子败酱散对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的类风湿关节炎成纤维细胞(MH7A)增殖、凋亡及炎症反应的影响,探究其作用机制。方法2022年2―8月,大鼠用不同浓度薏苡附子败酱散及蒸馏水灌胃制备含药血清;20μg/L的TNF-α处理的MH7A细胞记为TNF-α组,TNF-α+含药血清处理的MH7A细胞记为薏苡附子败酱散低浓度组、薏苡附子败酱散中浓度组、薏苡附子败酱散高浓度组,正常培养的MH7A细胞标记为对照组。细胞计数试剂盒(CCK8)、流式细胞术、酶联免疫吸附测定(ELISA)检测细胞的存活、凋亡及白细胞介素(IL)-1β、干扰素(IFN)-γ;蛋白质印迹法(WB)检测基质金属蛋白酶(MMP)-3、MMP-9、抗三结构域蛋白21(TRIM21)、Toll样受体4(TLR4)、t-核因子(NF)-κB p65、磷酸化(p)-NF-κB p65、p-NF-κB抑制因子(IκB)-α和t-IκB-α蛋白表达。pcDNA 3.1组(转染空载体)、pcDNA+TRIM21组(转染pcDNA 3.1+TRIM21)、薏苡附子败酱散中浓度+si-con组(转染si-con+4.70 g/kg含药血清)、薏苡附子败酱散中浓度+si-TRIM21组(转染si-TRIM21+4.70 g/kg含药血清)。结果与对照组相比,TNF-α组细胞存活率(105.07±1.90比185.67±3.06)、TRIM21(0.56±0.02比0.68±0.04)、MMP-3(0.18±0.00比0.63±0.02)、MMP-9(0.39±0.01比0.82±0.01)、TLR4(0.25±0.02比0.68±0.07)、p-NF-κB p65(0.24±0.01比0.68±0.06)、p-IκB-α(0.22±0.01比0.55±0.04)蛋白表达和IL-1β(31.65±0.66比101.93±0.60)、IFN-γ(8.53±0.16比63.76±1.35)含量均显著升高,凋亡率(6.54±0.06比1.17±0.08)均显著降低;与TNF-α组相比,薏苡附子败酱散低浓度组(185.67±3.06比153.77±3.09;0.68±0.04比0.37±0.02;0.63±0.02比0.47±0.02;0.82±0.01比0.73±0.01;103.2±0.7比92.93±0.85;66.3±1.45比54.47±1.46;0.68±0.07比0.53±0.05;0.68±0.06比0.53±0.06;0.55±0.04比0.47±0.01;1.84±0.07比6.67±0.28)、薏苡附子败酱散中浓度组(185.67±3.06比136.23±1.57;0.68±0.04比0.57±0.02;0.63±0.02比0.37±0.02;0.82±0.01比0.57±0.00;103.2±0.7比86.4±0.75;66.3±1.45比38.1±0.92;0.68±0.07比0.43±0.07;0.68±0.06比0.59±0.01;0.55±0.04比0.40±0.03;1.84±0.07比9.59±0.29)、薏苡附子败酱散高浓度组(185.67±3.06比143.47±1.50;0.68±0.04比0.47±0.02;0.63±0.02比0.41±0.05;0.82±0.01比0.62±0.00;103.2±0.7比89.63±0.42;66.3±1.45比40.17±0.90;0.68±0.07比0.51±0.06;0.68±0.06比0.69±0.07;0.55±0.04比0.41±0.02;1.84±0.07比8.89±0.08)细胞存活率、TRIM21、MMP-3、MMP-9蛋白和IL-1β、IFN-γ含量及TLR4、p-NF-κB p65、p-IκB-α蛋白表达均显著降低,凋亡率均显著升高(P<0.05);与pcDNA组相比,pcDNA+TRIM21组细胞TRIM21蛋白表达(0.24±0.03比0.51±0.04)、细胞凋亡率(1.61±0.11比12.43±0.61)均显著升高,MMP-3(0.64±0.02比0.41±0.04)、MMP-9(0.82±0.03比0.45±0.02)、IL-1β(110.63±0.55比90.93±0.60)、IFN-γ(64.5±0.82比48.1±1.25)及细胞存活率(179.03±0.74比120.07±0.60)均显著降低;敲减TRIM21显著抑制薏苡附子败酱散中浓度对损伤细胞的治疗作用且显著升高TLR4(0.45±0.06比0.61±0.02)、p-NF-κB p65(0.49±0.02比0.56±0.02)、p-IκB-α(0.38±0.01比0.62±0.01)的蛋白表达。结论薏苡附子败酱散增强TNF-α诱导的MH7A细胞的生存能力,其作用机制与上调TRIM21抑制TLR4-NF-κB信号通路活性有关。

YTH结构域家族蛋白2和叉头蛋白转录因子3在肺腺癌中的表达关系研究

目的 分析YTH结构域家族蛋白2(YTHDF2)及叉头蛋白转录因子3(FOXO3)在肺腺癌病人中的表达及与预后的关系。方法 收集2020年1月至2021年5月在郑州大学第一附属医院行手术治疗的肺腺癌病人癌组织及对应的癌旁组织(距离癌组织5 cm以上)80对,收集病人临床病理资料;利用癌症基因组图谱(TCGA)数据库查询YTHDF2、FOXO3基因在肺腺癌中的表达水平;采用免疫组织化学法检测YTHDF2、FOXO3蛋白在肺腺癌组织中的表达情况;分析YTHDF2、FOXO3蛋白水平与肺腺癌病人临床病理资料的关系;分析肺腺癌中YTHDF2与FOXO3基因表达水平的相关性;对病人进行为期3年的随访,分析病人3年累积生存率。结果 YTHDF2、FOXO3蛋白在肺腺癌组织中的高表达率分别为34.00%、26.00%,明显低于癌旁正常组织中79.48%、61.54%(P<0.05)。YTHDF2蛋白表达情况与肺腺癌病人年龄、淋巴结转移和分化程度相关(P<0.05);与TNM分期、性别无关(P>0.05);FOXO3蛋白表达情况与肺腺癌病人性别和分化程度相关(P<0.05);肺腺癌组织中YTHDF2蛋白高表达组和低表达组病人3年累积生存率分别为53.30%、14.00%,经log-rank比较,差异有统计学意义(P<0.05);FOXO3蛋白高表达组和低表达组病人3年累积生存率分别为64.50%、12.20%,经Log-Rank比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 YTHDF2、FOXO3在肺腺癌组织中均低表达,与病人肿瘤分化程度及3年累积生存率有关,有望成为评估肺腺癌病人预后的生物标志物。

菱形结构域蛋白1、肝癌缺失基因1、β-连环蛋白在结直肠癌组织中的表达及临床意义

目的 探讨菱形结构域蛋白1(RHBDD1)、肝癌缺失基因(1DLC1)、β-连环蛋白在结直肠癌(CRC)与癌旁组织中表达水平的差异,分析三者在CRC组织中表达的相关性及与临床病理特征的关系。方法 以2021—2022年内蒙古包钢医院经外科手术切除且病理类型为腺癌的结直肠癌患者30例为研究对象,采用定量反转录聚合酶链式反应及蛋白质印迹法测定RHBDD1、DLC1和β-连环蛋白在CRC和癌旁组织中的表达情况,并分析三者在CRC中表达的相关性及与临床病理特征的关系。结果 RHBDD1、β-连环蛋白在癌组织中的表达高于癌旁组织,DLC1在癌组织中的表达低于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。在CRC中,RHBDD1和β-连环蛋白的表达呈正相关。RHBDD1、β-连环蛋白均与DLC1的表达呈负相关,差异有统计学意义(P<0.05);RHBDD1、β-连环蛋白的表达量与组织分化程度呈负相关,与TNM分期、淋巴结转移呈正相关;DLC1与组织分化程度呈正相关,与TNM分期、淋巴结转移呈负相关,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 RHBDD1和β-连环蛋白在CRC中高表达,DLC1在CRC中低表达;RHBDD1、β-连环蛋白、DLC1与组织分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关,且三者之间具有相关性,提示三者联合检测可能为CRC的诊断提供理论依据。

免疫检查点T细胞激活抑制物免疫球蛋白可变区结构域、人内源性逆转录病毒-H长端重复相关蛋白2在子宫内膜癌中的表达及临床意义

目的分析免疫检查点T细胞激活抑制物免疫球蛋白可变区结构域(VISTA)、人内源性逆转录病毒-H长端重复相关蛋白2(HHLA2)在子宫内膜癌(EC)中的表达及临床意义。方法选取2017年9月至2019年10月唐山市妇幼保健院收治的120例的EC患者作为研究对象,收集其的EC组织和癌旁正常组织。检测EC组织和癌旁正常组织VISTA、HHLA2的表达;采用Spearman分析免疫检查点VISTA、HHLA2的相关性;Kaplan-Meier分析VISTA、HHLA2与预后的关系;Cox回归分析影响EC患者预后的危险因素。结果EC组织中VISTA、HHLA2阳性表达率显著高于正常癌旁组织(P<0.05)。Spearman相关性结果显示EC组织中VISTA与HHLA2表达呈正相关性(r=0.587,P<0.05)。EC组织中VISTA、HHLA2表达与临床病理特征有关(P<0.05)。Kaplan-Meier曲线结果显示VISTA阳性表达患者3年生存率低于阴性表达患者(χ^(2)=11.864,P<0.05),HHLA2阳性表达患者3年生存率低于阴性表达患者(χ^(2)=4.975,P<0.05)。Cox回归分析结果显示VISTA和HHLA2是影响EC患者预后的危险因素(P<0.05)。结论免疫检查点VISTA、HHLA2在EC中高表达,其是影响EC预后的危险因素,二者可能是有价值的预后标志物。

环糊精葡萄糖基转移酶my20结构域删除突变体的表达和酶学性能

本实验以海洋来源的环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glycosyltransferase,CGTase)my20为研究对象,构建了D、E以及DE结构域截短突变体,通过pET-24a载体和宿主菌E.coli BL21(DE3)进行异源表达,并利用镍亲和层析柱纯化得到纯酶。以my20环化比活力为100%计,my20ΔD、my20ΔE、my20ΔDE相对环化活力分别约为197%、22%、17%,表明E结构域是CGTase催化环化反应的重要结构域,D结构域的存在可能降低了底物分子进入催化结构域的能力。my20为耐热酶,3种截短突变酶相较之下耐热性均有不同程度的降低,说明D、E结构域在CGTase耐热性方面具有重要的作用。my20在缺失了DE结构域后,催化产物中α-环糊精占比相较其他截短酶提升约8%,表明缺失DE结构域影响其产物的特异性。本实验结果可为CGTase通过结构域改造在工业生产方面发挥作用提供一定的理论基础。

A型流感病毒PB2蛋白帽子结合结构域的原核表达与鉴定

A型流感病毒是一种重要的人畜共患病病原,严重威胁全球公共卫生安全。PB2蛋白的帽子结合结构域(CBD)在流感病毒的转录过程中发挥重要功能,是抗流感病毒药物的重要靶点之一。为获得高纯度原核表达的A型流感病毒的CBD蛋白,本研究利用同源重组策略将8×His标签与一株H5N1亚型高致病性禽流感病毒的CBD区基因序列克隆至原核表达载体pET28a中,构建重组质粒pET28a-8×His-CBD,经PCR及测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经不同浓度IPTG诱导不同时间后,经SDS-PAGE检测蛋白表达后使用镍柱纯化。结果显示,菌体裂解上清中在21 ku处可见目的条带,与8×His-CBD蛋白预期大小符合,且以0.5 mmol/L IPTG于37℃诱导6 h时蛋白表达量最高,镍柱纯化后可获得纯度大于95%的8×His-CBD蛋白。为确定该蛋白是否具有生物学活性,本研究以帽子结构类似物m7GTP对其进行等温滴定量热试验,结果显示8×His-CBD蛋白和m~7GTP结合时存在明显热峰,表明8×His-CBD蛋白具有生物学活性;经计算,其Kd值为1.71×10^(-5)(±2.92×10^(-6))mol/L。本研究结果对流感病毒的基础研究和抗流感病毒药物的研发具有借鉴意义。

一种新型溴结构域和超末端结构域小分子抑制剂干预小鼠心力衰竭的作用

目的探讨一种新型溴结构域和超末端结构域(BET)小分子抑制剂ABBV-744在干预心力衰竭小鼠心脏纤维化中的作用。方法将24只8~10周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为假手术组、模型组、JQ1干预组和ABBV-744干预组,每组6只。假手术组不建立心力衰竭模型,其余3组小鼠行主动脉缩窄术(TAC)构建心力衰竭模型,通过检测主动脉弓流速确定造模成功。在TAC术后18 d开始2个干预组小鼠分别进行JQ1腹腔注射和ABBV-744灌胃,1次/d,连续给药30 d。给药结束后,采用超声心动图检测小鼠心功能情况;心脏相关指数分析小鼠心脏肥大情况;苏木精-伊红(HE)染色分析小鼠心脏以及肾脏组织炎症细胞浸润情况;天狼星红染色评估小鼠心脏组织纤维化程度;蛋白质印迹法和荧光定量聚合酶链反应验证小鼠心脏组织α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、α1-Ⅰ型胶原(COL1A1)、α1-Ⅲ型胶原(COL3A1)表达情况;取血浆检测天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素、血肌酐、血尿素氮指标评估药物对肝肾功能的影响。结果超声心动图显示与模型组比较,ABBV-744干预组小鼠的左心室射血分数和左心室短轴缩短率均显著升高[(55±4)%比(45±4)%、(28.0±2.6)%比(22.4±2.4)%],左心室收缩末期内径和左心室舒张末期内径均显著降低(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,ABBV-744干预组小鼠心脏重量与体重比值、心脏重量与胫骨长度比值均明显减小(P<0.05或P<0.001)。HE染色表明ABBV-744减轻了心脏微血管的炎症细胞浸润;天狼星红染色表明ABBV-744能够减轻TAC后心力衰竭的胶原沉积,减轻心脏纤维化。与模型组比较,ABBV-744干预组α-SMA蛋白和COL1A1、COL3A1 mRNA表达均明显下调(P<0.05或P<0.01)。小鼠肾脏HE染色和血浆生化检测提示与JQ1相比,ABBV-744对小鼠肝肾损伤更轻。结论ABBV-744能有效改善TAC小鼠心力衰竭并减轻心脏纤维化,可能与抑制成纤维细胞激活蛋白相关,与JQ1相比对肝肾功能影响更小。

黑曲霉耐热型葡聚糖酶纤维素结合结构域的替换与融合体酶性质

该文旨在通过更换纤维素结合结构域(cellulose binding domain, CBD)的方式探索获得具有纤维素水解能力的耐热型葡聚糖酶的方法。黑曲霉(Aspergillus niger)来源的葡聚糖酶AnEglA6具有优越的耐热性能,在禽类饲料生产中具有应用前景。通过更换不同家族来源的碳水化合物结合结构域(carbohydrate binding module, CBM)编码区,构建了融合体葡聚糖酶基因,分别在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中进行异源表达。AnEglA6催化结构域与分别来源于嗜热菌(Caldicellulosiruptor kristjanssonii)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的木聚糖酶的底物结合结构域CBM9、CBM10结合获得的融合体酶AnEg-CBM9和AnEg-CBM10均具有较高的纤维素水解能力,并且底物范围进一步扩大,对微晶纤维素也具有一定的水解能力。AnEg-CBM10热稳定性有显著的提高,在85℃下酶活力半衰期达到40 min左右,能短时耐受90℃高温。融合体酶AnEg-CBM10是一种热稳定性提高、具有纤维素水解能力的新型葡聚糖酶。