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非编码小RNA(RyhB)调控禽致病性大肠杆菌毒力相关基因的分析 被引量:3
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作者 尹磊 祁克宗 +4 位作者 涂健 周秀红 刘红梅 王曼 张艳娜 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第8期1409-1416,共8页
以小RNA(RyhB)为研究对象,探索RyhB对禽致病性大肠杆菌相关毒力基因的调控研究。采用Red同源重组技术构建APEC野生株(AE17)RyhB的缺失株△RyhB以及构建出回复株△RyhB-comp。运用活菌计数法分别观察AE17、△RyhB、△RyhB-comp黏附鸡胚... 以小RNA(RyhB)为研究对象,探索RyhB对禽致病性大肠杆菌相关毒力基因的调控研究。采用Red同源重组技术构建APEC野生株(AE17)RyhB的缺失株△RyhB以及构建出回复株△RyhB-comp。运用活菌计数法分别观察AE17、△RyhB、△RyhB-comp黏附鸡胚成纤维细胞DF-1的能力,并且利用Real-time PCR检测AE17、△RyhB和△RyhB-comp的8个毒力基因转录水平。结果成功构建出了基因缺失株△RyhB和回复株△RyhBcomp,△RyhB黏附细胞能力较AE17均有显著地降低,约为AE17的62.5%,△RyhB-comp较△RyhB黏附能力显著上升,为△RyhB的1.4倍。同时,Real-time PCR结果显示,△RyhB的bcfA、fyuA、tsh、luxS、fimC、ompA毒力基因的转录水平均极显著下降(P<0.01),其mRNA转录水平分别约为AE17的19%、52%、20%、14%、28%、52%;△RyhB的iss、ibeA毒力基因表达水平分别上调约1.14倍和1.2倍。表明RyhB的缺失能够减弱APEC黏附DF-1的能力,并且使毒力基因的转录水平有所降低。根据以上结果,推测RyhB对APEC的毒力具有极其重要的调节作用。 展开更多
关键词 禽致病性大肠杆菌 非编码小RNA RED同源重组 ryhb 毒力基因
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肠炎沙门菌SipA多克隆抗体的制备及非编码小RNA RyhB-1/2对其表达调控的分析 被引量:2
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作者 孟霞 何梦萍 +3 位作者 韦骅栩 张珂 王亨 朱国强 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第11期4162-4169,共8页
本研究旨在通过pET原核表达系统表达沙门菌毒力蛋白SipA,制备抗SipA蛋白的多克隆抗体,以分析肠炎沙门菌SE50336非编码小RNA RyhB-1、RyhB-2对SipA的调控作用。利用pET原核表达系统构建pET28a-sipA重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态... 本研究旨在通过pET原核表达系统表达沙门菌毒力蛋白SipA,制备抗SipA蛋白的多克隆抗体,以分析肠炎沙门菌SE50336非编码小RNA RyhB-1、RyhB-2对SipA的调控作用。利用pET原核表达系统构建pET28a-sipA重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,优化并获得最佳蛋白诱导条件后对蛋白进行诱导表达;通过10%SDS-PAGE分析重组蛋白表达形式;利用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白;将纯化的SipA蛋白与弗式佐剂混合免疫BALB/c小鼠,获得SipA蛋白的特异性多克隆抗体,分析制备血清的特异性;利用Western blotting技术检测野生株SE50336、RyhB单缺失株SE50336ΔryhB-1、SE50336ΔryhB-2,以及RyhB双缺失株SE50336ΔryhB-1ΔryhB-2中SipA蛋白的表达水平,分析RyhB-1和RyhB-2对SipA蛋白的调控作用。结果显示,试验成功构建了重组质粒pET28a-sipA,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后成功表达SipA蛋白;SDS-PAGE结果显示,重组蛋白主要以包涵体形式表达,大小为75 ku;经亲和层析纯化后,SipA蛋白纯度较高;Western blotting结果显示,制备的多克隆抗体可特异性检测肠炎沙门菌SipA重组蛋白;与野生株相比,RyhB单缺失株SE50336ΔryhB-1和SE50336ΔryhB-2中SipA蛋白表达量下降,双缺失株下降则更明显,表明RyhB-1和RyhB-2均可上调SipA蛋白的表达。SipA重组蛋白的纯化及SipA多克隆抗体的制备为进一步研究RyhB-1和RyhB-2对SipA蛋白的调控作用机制奠定基础。 展开更多
关键词 肠炎沙门菌 SipA ryhb 原核表达 多克隆抗体
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基于非标记定量蛋白质组学技术研究RyhB调控禽致病性大肠杆菌酸性耐受力 被引量:1
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作者 涂健 张煜 +3 位作者 李春晓 薛媚 王琦 祁克宗 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第8期616-620,共5页
为从蛋白水平上探究ryhb对大肠杆菌酸性耐受力相关基因的影响,本研究采用非标记定量(Label-free)蛋白质组学技术对禽致病性大肠杆菌(APEC)野生株和△ryhb基因突变株进行蛋白质组学的差异性比较,并利用荧光定量PCR技术进行验证。本实验... 为从蛋白水平上探究ryhb对大肠杆菌酸性耐受力相关基因的影响,本研究采用非标记定量(Label-free)蛋白质组学技术对禽致病性大肠杆菌(APEC)野生株和△ryhb基因突变株进行蛋白质组学的差异性比较,并利用荧光定量PCR技术进行验证。本实验共检测到121个差异表达蛋白,其中44个蛋白的表达水平上调,19个蛋白的表达水平下调。为研究ryhb对表达蛋白的影响情况,并鉴定受其调控的相关基因,从上述差异蛋白中筛选出了hdea、hdeb、gada、gadb等与酸性耐受力相关的蛋白,并在基因水平进行验证。本研究表明,ryhb基因的缺失可能与上述4个耐酸基因转录水平上调相关,进而增强APEC耐酸性。本实验为初步探究ryhb调控通路,对APEC致病性影响提供了一定的实验依据。 展开更多
关键词 非标记定量蛋白质组学 禽致病性大肠杆菌 ryhb 耐酸基因
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Fur/RyhB调控禽致病性大肠杆菌运动性机制的研究 被引量:1
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作者 涂健 蔡伟真 +3 位作者 阮苑 宋祥军 邵颖 祁克宗 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第2期346-355,共10页
大肠杆菌的运动性主要由鞭毛提供动力,鞭毛是致病性大肠杆菌重要毒力因子之一,本文通过探究Fur及其负调控的非编码RNA--RyhB对禽致病性大肠杆菌(APEC)运动性的影响,为探索防控禽大肠杆菌病的潜在靶点提供科学依据。通过Red同源重组方法... 大肠杆菌的运动性主要由鞭毛提供动力,鞭毛是致病性大肠杆菌重要毒力因子之一,本文通过探究Fur及其负调控的非编码RNA--RyhB对禽致病性大肠杆菌(APEC)运动性的影响,为探索防控禽大肠杆菌病的潜在靶点提供科学依据。通过Red同源重组方法构建AE17△Fur和AE17△Fur/RyhB,比较缺失株与原始株运动性特征,结合转录组学数据探究Fur和RyhB对APEC鞭毛以及生物被膜形成的影响。结果显示成功构建了AE17△Fur和AE17△Fur/RyhB,转录组学结果显示Fur的缺失基本上使所有鞭毛相关的基因下调。Fur的缺失使APEC的运动性显著减弱,RyhB对APEC的运动性没有显著影响,△Fur/RyhB较△Fur运动能力有所增加。△Fur和△Fur/RyhB生物被膜形成能力显著增强,△RyhB生物被膜形成减弱,与运动性趋势基本一致。Fur对禽致病性大肠杆菌的鞭毛组装有非常重要的作用,其负调控的RyhB一定程度上可以抑制这种作用机制的影响,并进一步影响了生物被膜的形成,为寻找相关药物靶点提供可能。 展开更多
关键词 禽致病性大肠杆菌 FUR ryhb 运动性 铁稳态
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RyhB-cysE基因对禽致病性大肠杆菌生物表型的影响 被引量:1
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作者 涂健 阮苑 +3 位作者 蔡伟真 宋祥军 邵颖 祁克宗 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2020年第5期1247-1254,共8页
在禽致病性大肠杆菌(APEC)AE17及AE17△RyhB的基础上利用Red同源重组技术构建基因缺失株AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE,对野生株和基因缺失株的生长、生物被膜形成和运动特性进行分析,并采用qRT-PCR技术比较野生株和缺失株中与运动性、... 在禽致病性大肠杆菌(APEC)AE17及AE17△RyhB的基础上利用Red同源重组技术构建基因缺失株AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE,对野生株和基因缺失株的生长、生物被膜形成和运动特性进行分析,并采用qRT-PCR技术比较野生株和缺失株中与运动性、生物被膜形成相关基因的转录水平。结果显示,各菌株生长曲线无显著差异;AE17△RyhB、AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE生物被膜形成能力较AE17显著下降;AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE运动能力与AE17相比下降;AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE与AE17相比flhB、flgD、fliF和cheY转录水平均降低,而AE17△RyhB△cysE与AE17△cysE相比基因转录水平均有所增强;AE17△RyhB、AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE与AE17相比,flhD、flgC、sidA转录水平均显著降低。表明cysE基因缺失降低了APEC生物被膜形成能力及运动能力,且RyhB基因缺失对cysE基因的运动能力调控作用有代偿作用,RyhB、cysE基因均通过调节与生物被膜形成相关的基因(flhD、flgC、sidA)转录水平调控APEC生物被膜形成能力,本研究结果为研究RyhB-cysE基因对APEC的调控作用奠定了基础。 展开更多
关键词 禽致病性大肠杆菌 ryhb基因 cysE基因 生物被膜 运动性
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细菌非编码小RNA分子RyhB的结构与功能 被引量:5
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作者 程汝滨 苗翠翠 +2 位作者 宫倩红 满帅 于文功 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第7期590-596,共7页
RyhB是一种大小为90个核苷酸的细菌非编码小RNA分子(small noncoding RNA,sRNA).当铁缺乏时,RyhB通过下调一系列与铁的储存和利用相关蛋白的表达水平以维持体内的铁平衡,而其本身的表达则受到负调控因子Fur(ferric uptake regulator)的... RyhB是一种大小为90个核苷酸的细菌非编码小RNA分子(small noncoding RNA,sRNA).当铁缺乏时,RyhB通过下调一系列与铁的储存和利用相关蛋白的表达水平以维持体内的铁平衡,而其本身的表达则受到负调控因子Fur(ferric uptake regulator)的调节.在体内,RyhB与Hfq蛋白和核糖核酸酶E(ribonuclease E,RNase E)形成核蛋白复合物sRNP来发挥活性.sRNP通过RyhB与靶基因的互补配对序列作用于靶基因的核糖体结合位点,阻断靶mRNA的翻译,并迅速引起靶mRNA的降解.此外,RyhB还可以通过影响致病菌的生物膜形成、趋化性、耐酸性等方面的能力对细菌的致病力进行调节.本文综述了RyhB的结构、功能及作用机制方面的研究进展,并对其存在的生理意义进行了探讨. 展开更多
关键词 非编码小RNA ryhb 铁代谢 致病力调节 小核蛋白复合物
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沙门菌非编码小RNA RyhB研究进展 被引量:3
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作者 陈斌杰 王亨 +4 位作者 陈艳飞 潘夏雨 袁天梅 朱国强 孟霞 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期21-27,共7页
非编码小RNA(small non-coding RNA,sRNA)是一类基因组中被转录但不翻译成蛋白质的RNA分子,可在转录后水平调控基因表达。与蛋白质介导的调控系统不同,当细菌遇到不利的生长环境时,sRNA介导的调控可对环境变化做出快速应答。沙门菌RyhB-... 非编码小RNA(small non-coding RNA,sRNA)是一类基因组中被转录但不翻译成蛋白质的RNA分子,可在转录后水平调控基因表达。与蛋白质介导的调控系统不同,当细菌遇到不利的生长环境时,sRNA介导的调控可对环境变化做出快速应答。沙门菌RyhB-1和RyhB-2是两种相似性较高的sRNA,通过碱基互补配对方式,在调控因子作用下共同或单独调控靶基因表达。铁匮乏时,RyhB-1和RyhB-2可促进沙门菌摄取铁元素、限制胞内非必需含铁蛋白生成以及加快铁硫蛋白的储存,是沙门菌在转录后水平调控铁稳态的主要元件。此外,当沙门菌遭遇氧化应激、缺氧或酸性环境等不利环境胁迫时,RyhB可分别控制活性氧自由基的生成、平衡硝酸盐等无机物稳态、调节细菌运动性以及沙门菌毒力等应对环境变化。本文就沙门菌RyhB生理特征及其调控机制和功能进行阐述,以期为后续沙门菌RyhB的研究提供指导信息。 展开更多
关键词 非编码小RNA 沙门菌 ryhb
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不同耐药表型肺炎克雷伯菌生物膜形成能力与RyhB基因的关联性 被引量:2
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作者 熊流新 陆丽苗 +5 位作者 梁启兰 黄志伟 李淑英 盘国雄 钟建辉 陈亚宽 《国际检验医学杂志》 CAS 2021年第7期844-847,851,共5页
目的探讨呼吸道感染分离的不同耐药表型肺炎克雷伯菌(KP)生物膜形成能力与RyhB基因的相关性及其临床意义。方法收集2018年10月2019年10月该院呼吸道感染分离的46株KP,检测菌株的耐药性,构建KP体外感染模型并通过结晶紫染色法定量检测KP... 目的探讨呼吸道感染分离的不同耐药表型肺炎克雷伯菌(KP)生物膜形成能力与RyhB基因的相关性及其临床意义。方法收集2018年10月2019年10月该院呼吸道感染分离的46株KP,检测菌株的耐药性,构建KP体外感染模型并通过结晶紫染色法定量检测KP生物膜形成能力;采用PCR法扩增RyhB基因。结果46株KP根据耐药谱分为4个耐药表型,耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)6株(占13.0%),产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌(ESBLsKP)18株(占39.1%),多重耐药肺炎克雷伯菌(MDRKP)13株(占28.3%),高毒力肺炎克雷伯菌(HvKP)9株(占19.6%)。科室来源排名前3为重症监护室11株(占23.9%),呼吸科8株(占17.4%),神经外科7株(占15.2%)。CRKP生物膜形成能力低于产ESBLsKP、MDRKP(P<0.05);HvKP生物膜形成能力低于产ESBLsKP、MDRKP(P<0.05);CRKP与HvKP生物膜形成能力比较差异无统计学意义(P=0.802);产ESBLsKP与MDRKP生物膜形成能力比较差异无统计学意义(P=0.466)。产ESBLsKP和MDRKP存在特异性条带,CRKP和HvKP不存在特异性条带。不同耐药表型与RyhB基因表达的交互作用与生物膜形成能力有关,且RyhB基因阴性表达时,会导致生物膜形成能力下降。结论该院的产ESBLsKP和MDRKP有较强的生物膜形成能力并容易携带RyhB基因,RyhB基因正调控KP生物膜的合成。 展开更多
关键词 肺炎克雷伯菌 生物膜 耐药表型 ryhb基因
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肠炎沙门菌非编码小RNA RyhB调控SopE蛋白的表达研究
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作者 何梦萍 孟霞 +3 位作者 张珂 韦骅栩 王亨 朱国强 《中国家禽》 北大核心 2022年第1期24-29,共6页
为研究肠炎沙门菌(SE)50336非编码小RNA(RyhB-1、RyhB-2)对毒力蛋白SopE的调控作用,利用pET原核表达系统表达SE50336 SopE蛋白,免疫BALB/c小鼠获得SopE蛋白的特异性多克隆抗体(多抗)并分析制备血清的特异性。通过Western-blot检测野生株... 为研究肠炎沙门菌(SE)50336非编码小RNA(RyhB-1、RyhB-2)对毒力蛋白SopE的调控作用,利用pET原核表达系统表达SE50336 SopE蛋白,免疫BALB/c小鼠获得SopE蛋白的特异性多克隆抗体(多抗)并分析制备血清的特异性。通过Western-blot检测野生株SE50336、RyhB单缺失株(SE50336 ΔryhB-1、SE50336 ΔryhB-2),以及RyhB双缺失株(SE50336 ΔryhB-1ΔryhB-2)中SopE蛋白的表达水平,分析RyhB对SopE的调控作用。结果显示:成功构建重组质粒pET28a-sopE,转化BL21(DE3)感受态细胞后,在IPTG 0.3 mmol/L、温度37℃、转速220 r/min、诱导时间4 h的条件下,SopE蛋白在包涵体中表达;Western-blot结果显示制备的多抗可特异性检测肠炎沙门菌SopE蛋白;与野生株相比,RyhB单缺失株SopE蛋白表达量下降,双缺失株下降更明显,表明RyhB-1和RyhB-2均可上调SopE蛋白的表达。以上结果为进一步研究RyhB-1和RyhB-2对SopE的调控作用机制奠定基础。 展开更多
关键词 肠炎沙门菌 SopE ryhb 原核表达 多克隆抗体 调控
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Reciprocal Regulation between Fur and Two RyhB Homologs in Yersinia pestis,and Roles of RyhBs in Biofilm Formation
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作者 NI Bin WU Hai Sheng +2 位作者 XIN You Quan ZHANG Qing Wen ZHANG Yi Quan 《Biomedical and Environmental Sciences》 SCIE CAS CSCD 2021年第4期299-308,共10页
Objective To investigate reciprocal regulation between Fur and two RyhB homologs in Yersinia pestis(Y.pestis),as well as the roles of RyhBs in biofilm formation.Methods Regulatory relationships were assessed by a comb... Objective To investigate reciprocal regulation between Fur and two RyhB homologs in Yersinia pestis(Y.pestis),as well as the roles of RyhBs in biofilm formation.Methods Regulatory relationships were assessed by a combination of colony morphology assay,primer extension,electrophoretic mobility shift assay and DNase I footprinting.Results Fur bound to the promoter-proximal DNA regions of ryhB1 and ryhB2 to repress their transcription,while both RyhB1 and RyhB2 repressed the expression of Fur at the post-transcriptional level.In addition,both RyhB1 and RyhB2 positively regulated Y.pestis biofilm exopolysaccharide(EPS)production and the expression of hmsHFRS and hmsT.Conclusion Fur and the two RyhB homologs exert negative reciprocal regulation,and RyhB homologs have a positive regulatory effect on biofilm formation in Y.pestis. 展开更多
关键词 Yersinia pestis ryhb FUR BIOFILM
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溶藻弧菌RyhB的克隆与功能
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作者 刘欢 周欣 +1 位作者 王意 贺小贤 《陕西科技大学学报》 CAS 2019年第1期59-65,共7页
溶藻弧菌是我国海水产养殖鱼类的重要病原菌,已给海水养殖业带来巨大的经济损失.利用生物信息学手段,筛选获得来自溶藻弧菌的一个sRNA分子,RyhB,并对其进行了克隆和无标记框内突变株的构建,分析了其功能.结果表明:溶藻弧菌RyhB编码基因... 溶藻弧菌是我国海水产养殖鱼类的重要病原菌,已给海水养殖业带来巨大的经济损失.利用生物信息学手段,筛选获得来自溶藻弧菌的一个sRNA分子,RyhB,并对其进行了克隆和无标记框内突变株的构建,分析了其功能.结果表明:溶藻弧菌RyhB编码基因大小为233bp,具有典型的sRNA茎环结构,同时在其-10至-35区具有Fur蛋白结合序列.RyhB在溶藻弧菌体内具有多个潜在的靶标mRNA分子,可能参与其多种生理进程.同时,ΔryhB缺失株的运动性几乎完全丧失,铁载体合成能力降低.进一步的研究丰富了人们对溶藻弧菌sRNA分子及其毒力调控机制的认识. 展开更多
关键词 ryhb 溶藻弧菌 克隆 功能
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肠炎沙门菌非编码小RNA RyhB-1和IsrE对清远麻鸡的致病性 被引量:2
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作者 倪杰 孟宪臣 +6 位作者 李芙蓉 谢静 陆广富 朱春红 陈凯 孟霞 朱国强 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第9期1687-1692,共6页
RyhB是一种大小为90bp左右的细菌非编码小RNA,已有研究表明存在于鼠伤寒沙门菌和霍乱弧菌中的2种RyhB同源物RyhB-1和IsrE可调控细菌生物膜形成、趋化性和耐酸性。为研究RyhB在肠炎沙门菌致病性上的作用,以及2种同源物能否对毒力调控发... RyhB是一种大小为90bp左右的细菌非编码小RNA,已有研究表明存在于鼠伤寒沙门菌和霍乱弧菌中的2种RyhB同源物RyhB-1和IsrE可调控细菌生物膜形成、趋化性和耐酸性。为研究RyhB在肠炎沙门菌致病性上的作用,以及2种同源物能否对毒力调控发挥协同作用,本试验利用λ-Red同源重组系统构建了ryhB-1和isrE单、双缺失株,利用表达载体pBR322和pACYC184分别构建了回补质粒并导入缺失株50336△ryhB-1,50336△isrE,50336△ryhB-1/△isrE中,获得各突变株相应的回补菌株,检测了野生株和各突变株对1日龄雏鸡半数致死量(LD50)、致死率、体内分布等致病性差异。结果发现,ryhB-1和isrE基因缺失后导致肠炎沙门菌毒力减弱,双基因缺失株毒力下降更为明显,表明2种小RNA均对肠炎沙门菌致病性具有增强作用,且二者对毒力的调控具有协同作用。 展开更多
关键词 肠炎沙门菌 ryhb-1 ISRE 半数致死量 致病性
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