利心冲剂对心力衰竭大鼠铁代谢SLC7A11/GXP4信号通路的调控作用

目的 基于心肌铁代谢探讨利心冲剂对心力衰竭大鼠的心肌保护作用。方法 取32只SD大鼠,随机选择8只SD大鼠作为正常组,其余大鼠采用腹主动脉缩窄法制备心力衰竭模型。将造模成功后大鼠随机分为模型组、利心冲剂高剂量组及利心冲剂低剂量组,每组8只。利心冲剂高、低剂量组分别予以利心冲剂20.79 g/(kg·d)和5.20 g/(kg·d)灌胃,正常组和模型组给予等量蒸馏水灌胃,均1次/d。连续灌胃8周后,比色法检测血清铁水平,ELISA法测定血清铁蛋白水平,HE染色观察心肌组织病理形态,ELISA法测定心肌组织中活性氧(ROS)水平和超氧化物歧化酶(SOD)活性,Western blot法和RT-PCR法分别检测心肌组织中转铁蛋白受体(TfR1)、膜铁转运蛋白(FPN1)、胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)蛋白及mRNA表达情况。结果 与正常组比较,模型组大鼠血清铁和铁蛋白水平、心肌组织中SOD活性和FPN1、SLC7A11、GPX4蛋白及mRNA相对表达量均明显降低(P均<0.05),心肌组织中ROS水平和TfR1蛋白及mRNA相对表达量均明显升高(P均<0.05),心肌细胞肥大,组织间可见部分炎性细胞浸润;与模型组比较,利心冲剂高剂量组血清铁和铁蛋白水平及利心冲剂高、低剂量组心肌组织中SOD活性和FPN1、SLC7A11、GPX4蛋白及mRNA相对表达量均明显升高(P均<0.05),心肌组织中ROS水平和TfR1蛋白及mRNA相对表达量均明显降低(P均<0.05),心肌损伤明显减轻。结论 利心冲剂可通过调节铁代谢SALC7A11/GXP4信号通路抑制铁死亡,减轻心肌氧化应激,缓解心力衰竭大鼠心肌损伤。

金盏花苷E通过自噬途径下调GPX4和SLC7A11抑制肝癌细胞的增殖和迁移

目的探讨金盏花苷E抑制肝癌细胞增殖和迁移的分子机制。方法金盏花苷E处理肝癌细胞,CCK-8检测细胞活力;Western blotting检测GPX4、SLC7A11、LC3、P62的表达以及Akt/mTOR的磷酸化。自噬抑制剂LY294002和激活剂Rapamycin与金盏花苷E联合处理肝癌细胞,EdU和Transwell实验分别检测肝癌细胞的增殖和迁移能力。TCGA数据库分析GPX4和SLC7A11在肝癌及正常肝组织中的表达水平,以及与肝癌患者存活之间的关系。Western blotting和qPCR分别检测GPX4和SLC7A11在肝癌细胞和正常肝细胞中的表达水平。结果金盏花苷E能够显著抑制肝癌细胞的存活(P<0.05);GPX4和SLC7A11在肝癌组织和肝癌细胞中均显著高表达;GPX4和SLC7A11的表达与肝癌患者存活呈显著负相关(P<0.001);金盏花苷E显著抑制GPX4和SLC7A11蛋白的表达,激活Akt-mTOR通路,增强LC3Ⅱ的表达(P<0.01);自噬激活剂Rapamycin显著增强金盏花苷E对GPX4和SLC7A11的抑制作用,而自噬抑制剂LY294002则明显逆转了金盏花苷E对GPX4和SLC7A11的抑制作用(P<0.05);抑制自噬途径能够逆转金盏花苷E对肝癌细胞增殖和迁移的抑制作用,增强自噬途径则发生相反的变化(P<0.01)。结论金盏花苷E经自噬途径下调GPX4和SLC7A11抑制肝癌细胞的增殖和迁移。

Rab11-FIP4通过IGF1R调控结直肠癌细胞迁移和侵袭

目的:探讨Rab11家族相互作用蛋白4(Rab11-FIP4)在结直肠癌发生发展中的作用、临床意义及相关机制。方法:通过免疫组化、Western blot及RT-qPCR比较结直肠癌组织与相应的癌旁组织中、正常环境及缺氧条件下直肠癌细胞中Rab11-FIP4的表达水平;应用免疫组化染色评分将临床病例分为Rab11-FIP4高表达组(n=61)和Rab11-FIP4低表达组(n=39),通过Kaplan-Meier生存分析比较两组的总生存时间与复发时间;构建Rab11-FIP4过表达慢病毒,感染结直肠癌细胞株HCT116和LoVo,采用CCK-8法、集落形成实验和Transwell实验检测Rab11-FIP4过表达对结直肠癌细胞生物学特性的影响。免疫共沉淀实验检测Rab11-FIP4与胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)的相关性;人类磷酸激酶抗体阵列测定探讨Rab11-FIP4高表达的结直肠癌细胞中受IGF1R影响的信号通路;组织微阵列及双萤光素酶报告基因分析Rab11-FIP4与缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的关系。结果:Rab11-FIP4在结直肠癌组织中高表达(P<0.01),且Rab11-FIP4过表达与结直肠癌患者的预后不良有关(P<0.05)。Rab11-FIP4的过表达促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力(P<0.05)。Rab11-FIP4的过表达通过IGF1R调节ERK1/2和AKT信号通路(P<0.05)。缺氧促使Rab11-FIP4启动子上的HIF-1α活化,从而上调Rab11-FIP4的表达(P<0.05)。结论:Rab11-FIP4可能作为促癌基因通过IGF1R调控结直肠癌细胞的迁移和侵袭。

SLC4A11通过JAK信号通路对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的:探讨溶质转运家族4成员11蛋白(SLC4A11)在卵巢癌增殖、迁移和侵袭中的生物学作用机制。方法:RT-qPCR检测卵巢癌细胞中SLC4A11表达。将SKOV3细胞分为对照组(转染siRNA-NC序列)、SLC4A11-siRNA组(干扰SLC4A11表达)和SLC4A11-siRNA+JAK组(干扰SLC4A11表达+激活JAK信号通路)。采用CCK-8、伤口愈合实验和Transwell实验检测细胞的增殖、迁移和侵袭能力。RT-qPCR和Western blot检测Janus激酶2(JAK2)和信号传导及转录激活因子3(STAT3)、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)表达。结果:SLC4A11在卵巢癌组织中高表达(P<0.05)。SLC4A11-siRNA组SKOV3细胞中p-JAK2/JAK2(0.286±0.048)、p-STAT3/STAT3(0.571±0.042)、Bcl-2(0.335±0.040)均低于对照组(1.001±0.093、1.004±0.089、1.005±0.142),也低于SLC4A11-siRNA+JAK组[p-JAK2/JAK2(1.001±0.095)、p-STAT3/STAT3(1.003±0.092)和Bcl-2(1.006±0.145)];SKOV3细胞活力SLC4A11-siRNA组(1.112±0.113)、SLC4A11-siRNA+JAK组(1.612±0.113)、对照组(1.778±0.167)依次升高,SKOV3细胞划痕愈合率SLC4A11-siRNA组(21.927±3.279)、SLC4A11-siRNA+JAK组(54.763±6.794)、对照组(56.787±10.985)依次升高,侵袭细胞数量SLC4A11-siRNA组(68.000±5.568)、SLC4A11-siRNA+JAK组(172.667±4.041)、对照组(184.667±14.640)依次升高(均P<0.01)。结论:SLC4A11可能通过调控抑制JAK/STAT3信号通路参与卵巢癌进展,提示SLC4A11可能成为卵巢癌潜在治疗靶点。

淫羊藿苷调节Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路对高糖诱导的小胶质细胞铁死亡的影响

目的:探讨淫羊藿苷调节核转录E2相关因子2(Nrf2)/溶质载体蛋白7家族成员11(SLC7A11)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)通路对高糖诱导的小胶质细胞铁死亡的影响。方法:将小胶质细胞(BV2)分为对照组(5.5 mmol·L^(-1)葡萄糖)、高糖组(35 mmol·L^(-1)葡萄糖)、淫羊藿苷低(35 mmol·L^(-1)葡萄糖+0.37μmol·L^(-1)淫羊藿苷)、高(35 mmol·L^(-1)葡萄糖+1.48μmol·L^(-1)淫羊藿苷)剂量组、抑制剂组(35 mmol·L^(-1)葡萄糖+1.48μmol·L^(-1)淫羊藿苷+1μmol·L^(-1)的Nrf2抑制剂ML385)。采用CCK-8法检测细胞增殖,进行细胞形态学观察,用超氧化物阴离子荧光探针(DHE)、氟硼二吡咯(BODIPYTM)检测细胞内活性氧(ROS)、脂质过氧化(LPO)水平,特异性荧光探针检测细胞内活性铁含量,Western Blot检测细胞Nrf2、SLC7A11、GPX4、血红素加氧酶1(HO-1)、环氧合酶2(COX2)、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)蛋白的表达。结果:与对照组比较,高糖组的BV2细胞形态不规则,出现细胞碎片,细胞光密度(OD450)值、Nrf2、SLC7A11、GPX4、HO-1表达明显降低(P<0.05),ROS和LPO水平、活性铁含量、COX2、ACSL4表达显著升高(P<0.05);与高糖组比较,低、高剂量淫羊藿苷组的BV2细胞损伤减少,细胞OD450值、Nrf2、SLC7A11、GPX4、HO-1表达升高(P<0.05),ROS和LPO水平、活性铁含量、COX2、ACSL4表达降低(P<0.05);与高剂量淫羊藿苷组比较,抑制剂组减弱了淫羊藿苷对高糖诱导的小胶质细胞铁死亡的抑制作用。结论:淫羊藿苷通过激活Nrf2/SLC7A11/GPX4通路从而抑制高糖诱导的小胶质细胞铁死亡。

右美托咪定通过抑制铁死亡发挥对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

目的:脑卒中是危害人类生命健康的重大疾病之一,其中缺血性脑卒中的发病率占脑卒中的70%以上。缺血性脑卒中引起的脑缺血再灌注(ischemia reperfusion,IR)损伤的发生机制极为复杂。右美托咪定作为临床上常用的麻醉辅助用药,其在对抗脑IR损伤中的作用近年来被广泛研究,但具体作用机制尚未阐明。因此,本研究基于铁死亡探讨右美托咪定对抗小鼠脑IR损伤的作用及机制。方法:采用改良线栓法制备小鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。将雄性ICR小鼠随机分成:假手术(sham)组、IR组、IR+D1组(给予IR和25μg/kg的右美托咪定)、IR+D2组(给予IR和50μg/kg的右美托咪定)、IR+D3组(给予IR和100μg/kg的右美托咪定)、IR+D2+ML385组(给予IR、50μg/kg的右美托咪定和30 mg/kg的ML385)。采用Longa五分法进行小鼠神经行为学评分;2,3,5-三苯基四唑氮(triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色法检测小鼠脑梗死体积;蛋白质印迹法检测小鼠脑组织中核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)、转铁蛋白受体1(transferrin receptor 1,TFR1)、谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)及胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)蛋白质的表达水平。使用透射电镜观察线粒体形态。检测小鼠脑组织中MDA、GSH和Fe^(2+)的含量。结果:与sham组相比,IR组小鼠神经行为学评分、脑梗死体积、MDA和Fe^(2+)含量明显增加,TFR1蛋白质表达水平明显升高,GSH含量、SLC7A11和GPX4蛋白质表达水平显著降低(均P<0.05),脑组织神经细胞中的线粒体皱缩,嵴减少,膜密度增加;使用右美托咪定预处理后,相较于IR组,小鼠神经学行为评分、MDA和Fe^(2+)含量、TFR1蛋白质表达水平显著降低,脑梗死体积明显缩小,GSH含量、SLC7A11和GPX4蛋白质表达水平显著升高(均P<0.05),线粒体受损情况显著改善;而在用右美托咪定预处理的基础上使用ML385后,与IR+D2组相比,小鼠的神经行为学评分、脑梗死体积、MDA和Fe^(2+)含量明显增加,TFR1蛋白质表达水平明显升高,GSH含量、SLC7A11和GPX4蛋白质表达水平显著降低(均P<0.05),线粒体再次出现明显受损。结论:右美托咪定对脑IR损伤小鼠的保护作用与抑制铁死亡有关,其对铁死亡的抑制作用可能是通过调控Nrf2的表达实现的。

补中益气汤通过miR-155/Ndfip1/Pten轴调控Th17细胞改善自身免疫性甲状腺炎的作用机制

目的:探讨补中益气汤通过微小RNA-155(miR-155)/Nedd4家族相互作用蛋白1(Ndfip1)/磷酸酯酶与张力蛋白同源物(Pten)轴调控辅助性T细胞17(Th17)改善自身免疫性甲状腺炎(AIT)的作用机制。方法:将100只SPF级8周龄NOD.H-2h4小鼠饲以高碘水(0.05%碘化钠)喂养,8周后制成AIT模型,按随机数字表法分为模型组、补中益气汤低、中、高剂量组(4.78、9.56、19.12 g·kg^(-1))、西药组(硒酵母片3.033×10^(-5) g·kg^(-1)),每组20只,另设20只空白组小鼠,空白组及模型组灌胃等体积蒸馏水。连续给药8周后,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测小鼠甲状腺组织miR-155-5p、Ndfip1、Pten、蛋白质酪氨酸激酶1(Jak1)、信号传导和转录激活因子3(Stat3)、维甲酸相关孤儿受体γt(RORγt)、白细胞介素-17(IL-17)mRNA的表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测小鼠甲状腺组织Ndfip1、Pten、Jak1、Stat3、RORγt、IL-17蛋白的表达;免疫组化法检测小鼠甲状腺组织中Ndfip1、Pten蛋白表达;流式细胞术检测小鼠脾脏Th17细胞比例。结果:与空白组比较,模型组小鼠脾脏Th17细胞比例显著升高(P<0.01),miR-155-5p、Jak1、Stat3、RORγt、IL-17的表达显著升高(P<0.01),Ndfip1、Pten的表达显著降低(P<0.01);与模型组比较,各给药组小鼠脾脏Th17细胞比例降低(P<0.05,P<0.01),miR-155-5p、Jak1、Stat3、RORγt、IL-17的表达明显减少(P<0.05,P<0.01),Ndfip1、Pten的表达升高(P<0.05,P<0.01)。结论:补中益气汤可改善AIT小鼠自身免疫失常,其机制可能与通过miR-155调控Ndfip1/Pten轴进而调控Th17细胞分化有关。

Ndfip1在帕金森病模型小鼠黑质中的表达变化

目的观察携带人突变型α-突触核蛋白(A53T)的帕金森病(PD)转基因小鼠及1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的PD模型小鼠黑质区Nedd4家族相互作用蛋白1(Ndfip1)的表达变化。方法选取12月龄A53T转基因小鼠和同窝野生型(WT)对照小鼠,采用免疫印迹技术检测小鼠黑质区Ndfip1蛋白的表达变化;选取8周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为2组,MPTP组小鼠连续5 d给予MPTP腹腔注射(30 mg·kg^(-1)·d^(-1)),对照组给予等体积的生理盐水,采用免疫印迹技术检测小鼠黑质区Ndfip1及酪氨酸羟化酶(TH)的蛋白表达变化。结果与WT小鼠相比,A53T转基因小鼠黑质区Ndfip1蛋白的表达降低,差异有统计学意义(t=2.294,P<0.05);与对照组相比,MPTP组小鼠黑质区Ndfip1及TH的蛋白表达均明显降低,差异有统计学意义(t=2.149、9.935,P<0.05)。结论携带人突变型α-突触核蛋白(A53T)的PD转基因小鼠及MPTP诱导的PD模型小鼠黑质区Ndfip1蛋白的表达均下降。

细辛通过上调p53介导铁死亡致大鼠肝损伤的作用机制研究

目的 探讨细辛通过上调p53表达介导铁死亡致大鼠肝损伤的作用机制。方法 32只大鼠随机分为对照组和细辛低、中、高剂量(0.27、0.81、1.35 g/kg)组,每组8只,每日ig给药1次,连续28 d。末次给药2 h后采集血清样本和肝脏样本,全自动生化仪检测丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)和碱性磷酸酯酶(alkaline phosphatase,ALP)水平;酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)水平;比色法检测超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)活性和还原型谷胱甘肽(reducedglutathione,GSH)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)及Fe2+含量;化学荧光法检测活性氧物质(reactive oxide species,ROS)含量;苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin,HE)染色观察肝脏病理变化;定量反转录-聚合酶链锁反应(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测p53、溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 members 11,SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)、铁蛋白重链1(ferritin heavy chain 1,FTH1)、转铁蛋白受体1(transferrin receptor1,TFR1)m RNA含量;Western blotting检测p53、SLC7A11、GPX4、FTH1、TFR1蛋白表达。结果 与对照组比较,细辛组肝功能指标(ALT、AST、ALP)和血清致炎因子(TNF-α、IL-1β)水平显著升高(P<0.05);肝脏出现明显炎性改变;肝组织中SOD活性和GSH水平显著降低(P<0.05),氧化应激水平(ROS、MDA)和Fe2+含量显著升高(P<0.05);p53和TFR1的蛋白及m RNA表达均显著上调(P<0.05),GPX4、SLC7A11和FTH1的蛋白及m RNA表达均显著下调(P<0.05)。结论 细辛对大鼠肝脏有一定的损伤,其机制可能与上调p53、TFR1表达水平,下调FTH1表达水平,提高细胞内Fe2+含量;同时下调SLC7A11表达,使GPX4表达水平降低进而诱发肝细胞铁死亡有关。

青蒿琥酯联合硼替佐米对急性髓系白血病细胞体外凋亡、自噬的影响及其作用机制

目的探讨青蒿琥酯联合硼替佐米对急性髓系白血病(AML)细胞株MV4-11细胞增殖、凋亡及自噬的影响及其作用机制。方法 MTT法检测青蒿琥酯、硼替佐米单用及两药联合对MV4-11细胞的增殖抑制作用,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blot法检测细胞内Bcl-2家族蛋白(Bcl-2、Mcl-1、Bim、Bax)、cleaved-Caspase-3及自噬相关蛋白LC3B的表达。结果青蒿琥酯呈浓度和时间依赖性抑制MV4-11细胞增殖,作用48 h的IC50为1.44 μg/ml。硼替佐米呈浓度依赖性抑制MV4-11细胞增殖,作用48 h的IC50为8.97 nmol/L。青蒿琥酯(0.75、1.0 μg/ml)与硼替佐米(6、8 nmol/L)联合作用48 h,对MV4-11细胞的增殖抑制率均高于单药组(P值均<0.05),两药相互作用的协同指数(CI)均<1。1.5 μg/ml青蒿琥酯作用MV4-11细胞48 h的凋亡率为(15.27±2.18)%,8 nmol/L硼替佐米作用MV4-11细胞48 h的凋亡率为(19.85±3.23)%,两药联合作用后凋亡率增高至(81.67±5.96)%,显著高于单药组(P值均<0.05)。两药联合作用MV4-11细胞24 h后细胞内cleaved-Caspase-3、促凋亡蛋白Bim及自噬相关蛋白LC3B表达上调,抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调。结论青蒿琥酯联合硼替佐米具有协同抑制MV4-11细胞增殖和诱导凋亡及促进自噬的效应,作用机制可能与Bcl-2家族蛋白表达的改变有关。

铁死亡相关基因在瘢痕疙瘩中的表达及意义

目的:探究铁死亡相关基因在人瘢痕疙瘩组织中的表达及意义。方法:收集新疆医科大学第一附属医院整形科2022年1月至2022年6月诊治的35例瘢痕疙瘩及因其他手术切除的20例正常皮肤组织标本,应用免疫组织化学染色法检测瘢痕疙瘩和正常皮肤组织中铁死亡标志物谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的表达情况,实时定量聚合酶链反应技术(RT-qPCR)检测各组GPX4、溶质载体家族7成员11(SLC7A11,又称xCT)、转铁蛋白受体(TFRC)及核转录因子红系2相关因子2(Nrf2)mRNA的表达水平,蛋白质印迹法检测各组GPX4、xCT、TFRC及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白表达水平,比色法检测各组组织铁含量。计量资料符合正态分布时,组间比较采用t检验,若不符合正态分布,组间比较采用Mann-Whitney-U检验。结果:免疫组织化学染色结果显示,瘢痕疙瘩组铁死亡标志物GPX4的蛋白表达水平低于正常皮肤组(0.77±0.08比0.92±0.09,t=-3.54,P<0.01)。RT-qPCR结果显示,瘢痕疙瘩组GPX4、xCT及Nrf2 mRNA的表达水平低于正常皮肤组[GPX4:0.74±0.29比1.14±0.49,t=-3.22,P<0.01;xCT:0.81(0.71,1.25)比1.52(0.86,4.64),Z=-2.679,P<0.01;Nrf2:0.49(0.38,1.04)比1.25(0.49,1.73),Z=-2.234,P<0.05],TFRC mRNA的表达水平高于正常皮肤组[1.68(1.13,2.36)比0.87(0.48,1.35),Z=-3.886,P<0.01]。蛋白质印迹法结果显示,瘢痕疙瘩组GPX4、xCT的蛋白表达水平低于正常皮肤组[GPX4:0.75(0.42,0.91)比1.04(0.92,1.96),Z=-3.731;xCT:0.71(0.55,0.86)比0.98(0.95,1.14),Z=-4.941,P均<0.001],TFRC及α-SMA的蛋白表达水平高于正常皮肤组(TFRC:1.13±0.22比0.62±0.16,t=6.342;α-SMA:1.33±0.12比0.51±0.21,t=9.669,P均<0.001)。瘢痕疙瘩组铁含量高于正常皮肤组[(7.59±1.60)μg/g比(3.05±1.28)μg/g,t=9.086,P<0.01]。结论:瘢痕疙瘩中存在铁死亡现象。