人Rab12基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

Rab蛋白参与细胞的囊泡运输过程。自噬体-溶酶体的融合需要活化的Rab12蛋白参与。本研究从HEK293细胞获取总RNA,采用RT-PCR方法扩增出Rab12基因的ORF全序列,将其克隆到含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的真核表达载体pEGFP-N1上,成功构建重组质粒pEGFP-Rab12,然后采用lipofectamine 2000将重组质粒转染至HEK293细胞中并获得高表达。

人乳头瘤病毒早期癌蛋白E6/E7稳定表达细胞系的构建及其对Rab12表达的影响

目的探究人乳头瘤病毒(HPV)编码的早期癌蛋白E6/E7对小GTP酶蛋白Rab12表达的影响。方法利用逆转录病毒包装系统获得含p Babe-Vector质粒和p Babe-16E7质粒的高滴度病毒颗粒,感染细胞,并用嘌呤霉素筛选获得稳定表达HPV16E7的UMSCC 10A-16E7细胞系,Western blotting检测E7相关蛋白p53和E2F1的表达变化,比较UMSCC 10A-Vector细胞系和UMSCC 10A-16E7细胞系的Rab12蛋白表达水平。用同样方法在Ha CaT、RPE1细胞系中进一步验证。用siRNA干扰SiHa、Caski细胞(HPV-16阳性的宫颈癌细胞)中16E6/E7及He La细胞(HPV-18阳性的宫颈癌细胞)中18E6/E7的表达,通过Western blotting比较siRNA干扰前后E6和E7相关蛋白(E2F1、p53和Rab12)的表达差异。结果利用逆转录病毒包装系统成功构建稳定表达的细胞系,过表达E6/E7的细胞系中Rab12表达升高,干扰E6/E7的细胞系中Rab12的表达降低。结论 HPV编码的早期癌蛋白E6/E7可调控Rab12的表达。