BLOC-3介导Rab32线粒体定位改变对肝癌细胞生长的作用研究

目的观察溶酶体相关细胞器生物发生复合体-3(biogenesis of lysosome-related organelles complex-3,BLOC-3)亚基Hps1和Hps4对肝癌细胞中Rab32线粒体定位的影响及在肝癌细胞生长中的作用。方法通过公共数据库GenDoma,String和InBio Discover分析Hps1和Hps4与Rab32的相互作用情况。体外培养人肝癌细胞系SNU-739和Hep-3B,利用脂质体转染方法分别转染Hps1和Hps4相关的siRNAs和质粒,采用免疫荧光和Western blot观察Hps1和Hps4对Rab32线粒体定位的影响,细胞划痕、克隆形成、EdU、MTS及Transwell侵袭实验检测Hps1和Hps4调控Rab32线粒体定位后肝癌细胞迁移、增殖和侵袭的变化情况。通过公共数据库UALCAN中的数据集CPTAC分析Rab32蛋白在肝癌和正常肝脏组织中的表达差异。结果数据库分析结果显示,Hps1和Hps4均可以与Rab32相互作用;与正常肝脏组织相比,Rab32蛋白在肝癌组织中的表达显著降低(P<0.001)。在肝癌细胞系SNU-739中干涉Hps1或Hps4或同时干涉Hps1和Hps4后,Rab32线粒体定位均减少(均P<0.01),细胞线粒体Rab32蛋白表达均降低(均P<0.001),细胞增殖、迁移和侵袭能力增强(均P<0.05);在肝癌细胞系Hep-3B中过表达Hps1和Hps4后,Rab32线粒体定位增多(P<0.01),细胞线粒体Rab32蛋白表达增加(P<0.001),细胞增殖、迁移和侵袭能力均受抑制(均P<0.01),而单独过表达Hps1或Hps4时无显著抑制作用(均P>0.05)。结论BLOC-3亚基Hps1和Hps4均可与Rab32相互作用并增加Rab32线粒体定位,进而抑制肝癌细胞生长。

RAB32对慢性粒细胞白血病K562细胞增殖和迁移作用的研究

目的:探讨RAB32对慢性粒细胞白血病(CML)K562细胞增殖和迁移作用的影响。方法:使用Western blot和qRT-PCR分别检测RAB32在CML患者、健康对照以及CML K562细胞株中的表达情况。进一步转染RAB32-shRNA到K562细胞株中敲除RAB32基因后,流式细胞仪分析K562细胞周期变化,Western blot和qRT-PCR分别检测K562细胞中细胞增殖相关蛋白C-myc、Cyclin D1和细胞迁移相关蛋白MMP-3、MMP-9的蛋白和mRNA表达水平变化。结果:Western blot和qRT-PCR检测结果显示,RAB32在CML患者和K562细胞株中高表达(P<0.01)。在K562细胞株中转染RAB32-shRNA抑制RAB32表达后,细胞周期分析结果显示,较NC-shRNA组相比,RAB32-shRNA组K562细胞的S期和G2/M期细胞比例均有不同程度降低,且S期细胞比例降低更为显著(P<0.01)。Western blot检测结果显示,与NC-shRNA组相比,RAB32-shRNA组K562细胞的细胞增殖相关蛋白C-myc、Cyclin D1和细胞迁移相关蛋白MMP-3、MMP-9蛋白表达水平明显降低(P<0.01),qRT-PCR检测结果显示,这四种因子的mRNA水平也相应降低(P<0.01)。结论:抑制RAB32的表达能够抑制CML K562细胞的增殖和迁移能力。

人源性Rab32荧光融合蛋白表达载体的构建及鉴定

目的构建人源性Rab32荧光融合蛋白表达载体p EGFP-Rab32,并观察Rab32在人黑素细胞瘤细胞系A375中细胞定位情况。方法收集并提取A375细胞中的总RNA,反转录成c DNA,以特异性引物扩增Rab32片段,经Xho I和Kpn I双酶切聚合酶链反应(PCR)产物和p EGFP-C3表达载体,酶切产物经胶回收、连接后转化至感受态大肠杆菌DH5a中,挑取单克隆菌落进行菌液PCR鉴定、酶切鉴定和测序分析,以确定表达载体构建正确。将构建的重组质粒转染A375细胞,Western blot检测细胞中Rab32表达水平,激光共聚焦显微镜观察其细胞定位。结果p EGFP-Rab32重组质粒经菌落PCR、双酶切和测序鉴定构建正确,转染A375细胞后,Western blot可检测出细胞中p EGFP-Rab32融合蛋白的表达,激光共聚焦显微镜观察到Rab32定位于细胞质中,且大量聚集于细胞核周围。结论p EGFP-Rab32融合蛋白表达载体成功构建,并观察了Rab32在细胞中的定位,为进一步研究Rab32在黑素代谢中的作用奠定了良好的基础。

Rab32对小鼠肝细胞系AML12细胞内脂质代谢的影响

目的探讨调控Rab32蛋白表达对小鼠AML12细胞内脂质代谢的影响。方法常规培养AML12细胞,通过转染FCD-EYFP-Rab32慢病毒表达载体构建Rab32过表达细胞系(过表达组),利用CRISPR/Cas9基因敲除技术构建Rab32敲除细胞系(敲除组),正常细胞设为对照组。Western blot检测各组细胞中Rab32蛋白表达水平;尼罗红染色后,激光共聚焦显微镜观测各组细胞内的脂滴数量和面积;定量试剂盒检测各组细胞内甘油三酯及总胆固醇水平,流式细胞术检测细胞凋亡水平。结果与对照组比较,过表达组AML12细胞中Rab32蛋白表达水平显著上调,而Rab32敲除组细胞中Rab32蛋白表达水平显著下调(P<0.01);过表达组AML12细胞内脂滴数量[过表达组vs对照组:(21.91±14.32)vs(33.89±17.31),P<0.01]及面积[过表达组vs对照组:(16.82±14.37)μm^2vs(22.27±14.10)μm^2,P<0.01]显著减少,每毫克蛋白甘油三酯[过表达组vs对照组:(104.03±12.28)nmol vs(130.94±4.21)nmol,P<0.01]及胆固醇水平[过表达组vs对照组:(46.92±1.26)μg vs(81.11±0.65)μg,P<0.01]显著降低;而Rab32敲除组细胞内脂滴数量[(58.23±42.28)]及面积[(53.31±36.33)μm^2]较对照组显著增加(P<0.01),其每毫克蛋白甘油三酯[(159.03±8.85)nmol]及胆固醇水平[(93.38±3.33)μg]显著增高(P<0.01)。3组细胞凋亡水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论Rab32促进小鼠肝细胞AML12胞内脂质代谢。

Rab32促进树突状细胞内BCG增殖的实验研究

目的探讨Rab32(Ras-related proteins in brain 32)在树突状细胞(dendritic cells,DCs)内卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)感染中的作用。方法通过小鼠DC2.4细胞建立BCG感染模型,通过RNA-Seq技术检测BCG感染后DCs内Rab基因的表达变化;通过生信分析筛选BCG感染后差异表达的Rab蛋白;western blot法检测BCG感染后DC2.4细胞内Rab32蛋白的表达情况;采用慢病毒转染技术制备EYFP-Rab32过表达DC2.4细胞(EYFP-Rab32 DC2.4细胞),采用western blot法和流式细胞术进行转染效率验证;通过细胞载菌量实验检测EYFP-Rab32 DC2.4细胞内BCG的增殖;采用western blot法检测磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶(protein kinase B,AKT)通路蛋白的变化。结果DC2.4细胞中存在55种Rab蛋白,BCG感染后10种Rab蛋白的表达水平发生明显变化;Rab32蛋白随着感染时间的增加而增加,感染0 h和48 h时Rab32表达显著增加(P<0.05)。BCG感染EYFP-Rab32 DC2.4细胞48 h时BCG载菌量为(60.16±4.69)×10^(4)CFU/孔,较DC2.4细胞明显增多[(21.09±1.56)×10^(4)CFU/孔](P<0.01);这可能与Rab32过表达导致BCG感染DC2.4细胞后p-PI3K/PI3K,p-AKT/AKT增多(P<0.05),即Rab32激活PI3K/AKT通路相关。结论Rab32可能通过调控PI3K/AKT通路促进DCs内BCG增殖。