RAB7/mTOR/TFEB信号通路在心肌细胞线粒体自噬中的作用及机制研究

目的:分析RAB7/mTOR/TFEB信号通路在心肌细胞线粒体自噬中的作用及其机制。方法:建立并培养稳定转染的RAB7过表达和阴性对照腺病毒,分别命名为对照组和过表达RAB7组。流式细胞术检测细胞ROS水平和细胞凋亡率,溶酶体和线粒体的相互作用通过共定位的荧光成像显示,应用蛋白印迹测定RAB7、mTOR、TFEB、LC3B-II、CaMKIIδ和P62表达水平。结果:与对照组相比,过表达RAB7组mTOR表达升高,TFEB表达降低,ROS水平升高,细胞凋亡率增加,溶酶体和线粒体之间的相互作用显著增加。线粒体自噬相关的LC3B-II、CaMKII δ和P62蛋白表达升高(P<0.01)。结论:过表达RAB7可以通过mTOR/TFEB信号通路,增加ROS释放、细胞凋亡和线粒体自噬蛋白表达而促进心肌细胞线粒体自噬激活。

Rab7对禽偏肺病毒C型体外复制影响的研究

为探究禽偏肺病毒C型(aMPV/C)感染A549细胞后,Ras脑内类似物7(Rab7)对病毒复制的影响,试验将融合表达绿色荧光蛋白(GFP)的Rab7重组质粒(pGFP-Rab7)和融合表达GFP的显性负向突变Rab7重组质粒(pGFP-Rab7-DN)分别转染A549细胞并接种aMPV/C后,进行激光共聚焦成像,并用Image J软件对荧光图像进行荧光强度分析;随后将pCMV-FlagRab7和pCMV-Flag转染A549细胞并接种aMPV/C,分别采用实时定量PCR(qPCR)、蛋白免疫印记(Western blot)、组织半数感染量(TCID50)检测aMPV/C N基因转录水平、aMPV/C N蛋白表达水平以及病毒效价;将融合表达mcherry的Rab7重组质粒(pCMV-mcherry-Rab7)与表达融合GFP的aMPV/C各结构蛋白分别转染A549细胞,采用激光共聚焦显微镜观察定位情况;最后,将pCMV-Flag-Rab7分别与表达融合GFP的aMPV/C结构蛋白共转染HEK293T细胞进行免疫共沉淀试验,分析两者的互作情况。结果显示:与Rab7-DN相比,Rab7与aMPV/C核蛋白(N)在细胞质中存在多个明显的共定位荧光点;与转染pCMV-Flag组相比,pCMV-Flag-Rab7转染组中aMPV/C N基因的转录水平、N蛋白的表达水平以及病毒效价均显著升高(P<0.05)。相反,与转染无意siRNA(siNC)相比,转染Rab7特异性siRNA(siRab7)后aMPV/C N基因的转录水平、N蛋白的表达水平以及病毒效价均显著降低(P<0.05);Rab7蛋白与多个aMPV/C结构蛋白(N、F、M、G、SH、P、M2-1、M2-2、L1、L2、L3)在细胞质中存在共定位,而Rab7与L4蛋白无此现象;免疫沉淀的样品中只在G和L2蛋白的位置出现了特异性条带。综上所述,Rab7通过与多个蛋白(G和L2)互作从而影响aMPV/C的复制。

高表达RAB7A通过促进肿瘤侵袭影响胃癌患者的预后

目的探讨Ras相关蛋白7A(RAB7A)在胃癌组织中的表达对预后的影响及其作用机制。方法基于癌症公共数据库和本院接受胃癌根治术的104例患者,分析RAB7A在胃癌及癌旁组织中表达的差异以及其与患者临床病理学参数和预后的关系;采用生物信息学富集分析预测RAB7A影响胃癌侵袭途径的作用和机制;通过慢病毒转染获得过表达和低表达RAB7A的胃癌细胞系(MGC803),采用免疫印迹、划痕及Transwell实验探究RAB7A对ECM降解的影响以及RAB7A对胃癌细胞迁移、侵袭的作用和机制。结果癌症公共数据库分析显示胃癌组织中RAB7A的表达高于正常对照组,且负面影响患者生存期(P<0.01)。本院患者数据显示,胃癌组织中RAB7A的表达高于癌旁组织(P<0.01),且与外周血胚抗原、糖类抗原19-9水平正相关(P<0.001)。单因素结合Cox多因素分析显示,RAB7A高表达是影响胃癌5年生存率的独立危险因素(HR:2.882;95%CI:1.459~5.693);ROC曲线分析显示,以RAB7A相对表达量2.625为截断值,其预测患者术后5年死亡的敏感性为84.62%,特异性为71.15%。生物信息学富集分析显示,RAB7A参与了胃癌组织ECM降解和PI3K/AKT信号激活;体外实验证实,过表达RAB7A可激活胃癌细胞PI3K/AKT信号(P<0.01),增强基质金属蛋白酶(MMP-2和MMP-9)表达(P<0.01),以及胃癌细胞迁移和侵袭能力(P<0.01)。结论RAB7A在胃癌组织中高表达并影响患者预后,其作用和激活胃癌PI3K/AKT信号并促进ECM降解和肿瘤侵袭有关。

基于蛋白质组学探讨RAB7对肾小球足细胞线粒体自噬的影响

目的通过蛋白质组学探究RAB7作为线粒体自噬生物标志物对肾小球足细胞线粒体自噬的影响。方法将6只SD大鼠随机分为对照组和模型组(n=3),尾静脉注射阿霉素复制慢性肾小球肾炎(CGN)模型。采用蛋白质组学技术联合自噬数据库鉴定CGN大鼠的差异自噬相关蛋白。体内采用Western blot方法验证相关蛋白的表达,体外采用嘌呤霉素氨基核苷(PAN)诱导肾小球足细胞损伤模型,使用免疫荧光、透射电镜、Western blot等方法检测线粒体自噬变化。结果共筛选出12个自噬相关蛋白,其中RAB7 degree值最高。体内经Western blot验证的SNRPE、CTNNBI、CAT、RAB7A、SOD2蛋白表达水平与蛋白质组学数据一致。体外实验中,与正常组比较,模型组中RAB7、Parkin和PINK1蛋白表达水平降低(P<0.01);RAB7过表达后,与正常组比较,模型组中自噬标志物LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表达水平升高(P<0.01),P62蛋白表达水平降低(P<0.01)。结论RAB7可能是CGN中线粒体自噬生物标志物,影响肾小球足细胞线粒体自噬。

沉默SIRT1降低胆管癌细胞对5-氟尿嘧啶的耐药:基于抑制FOXO1/Rab7自噬通路

目的探讨SIRT1靶向FOXO1/Rab7自噬通路调节胆管癌细胞5-氟尿嘧啶(5-FU)耐药的机制。方法不同浓度(50、100、150、200μg/mL)的5-FU处理HCCC-9810细胞构建HCCC-9810/5-FU耐药细胞模型,免疫荧光检测细胞中SIRT1表达情况,Western blot和q-PCR检测SIRT1、FOXO1、Rab7表达水平,Western blot检测自噬相关蛋白Beclin1、LC3、p62表达水平。SIRT1 siRNA和NC siRNA转染HCCC-9810/5-FU耐药细胞,CCK-8检测细胞耐药性,划痕实验检测细胞迁移能力,RT-qPCR检测FOXO1、Rab7 mRNA水平,Western blot检测SIRT1、FOXO1、Rab7、Beclin1、LC3、p62蛋白表达水平。结果不同浓度(50、100、150、200μg/mL)的5-FU均能抑制HCCC-9810细胞增殖。与对照组相比,HCCC-9810/5-FU耐药细胞中SIRT1荧光强度略有增强;SIRT1、Rab7、p62、FOXO1和Beclin 1蛋白表达上调(P<0.01),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加(P<0.001);SIRT1、Rab7和FOXO1 mRNA水平上调(P<0.05)。沉默SIRT1表达后,HCCC-9810细胞的5-FU耐药性降低,细胞迁移能力降低,SIRT1(P<0.01)、Rab7(P<0.05)、p62(P<0.05)、FOXO1(P<0.01)和Beclin1(P<0.001)蛋白表达降低,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低(P<0.001);FOXO1和Rab7 mRNA水平降低(P<0.05)。结论沉默SIRT1的表达抑制FOXO1/Rab7自噬通路激活。

马氏珠母贝Rab7基因序列特征及其与耐低温性状的关系

Rab蛋白是膜泡运输过程中的重要调节因子,在囊泡运输和水产动物的免疫应答中行使重要功能。本研究鉴定了马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)的Rab7基因(Pm-Rab7),分析了Pm-Rab7在6个组织中及在温度胁迫(低温组17℃、对照组22℃、高温组32℃)下的表达模式,筛选和比较分析了马氏珠母贝耐低温选育系(low temperature resistant line,R) F3和北部湾野生群体(Beibu Gulf wild population,W)的Pm-Rab7外显子区的SNP位点。结果显示,Pm-Rab7序列全长为1 153 bp,5′端、3′端和开放阅读框(ORF)序列长度分别为30、505和618 bp,共编码205个氨基酸;Pm-Rab7具有一个RAB保守结构域,并与太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)相似度最高(92.79%)。系统进化树结果显示,Pm-Rab7与太平洋牡蛎等软体动物聚为一支。Pm-Rab7在所检测的组织都有表达,其中在性腺和鳃中的表达显著高于外套膜和肝胰腺等组织(P<0.05)。Pm-Rab7温度胁迫后时序表达分析发现,在17℃低温组,Pm-Rab7的表达量呈先上升再下降的趋势,在6 h~3 d内均显著高于22℃对照组(P<0.05),在1 d时达到峰值;在32℃高温组,Pm-Rab7表达量总体稳定,仅12 h时显著高于对照组(P<0.05),其他时间点与对照组无显著差异(P>0.05);说明该基因的表达与马氏珠母贝对低温胁迫的响应密切相关。Pm-Rab7基因的外显子区域在马氏珠母贝耐低温选育系和北部湾野生群体中共检测到7个SNP位点,其中3个位点的基因型频率在2个群体间具有显著性差异,说明这些位点可能与其耐低温性状相关。结果表明,Pm-Rab7可能在马氏珠母贝耐低温适应过程中发挥重要作用,研究结果可为深入探讨马氏珠母贝对温度变化的环境适应性研究提供参考资料。

Rab7负向调控巨噬细胞中CpG诱导的细胞因子的表达

目的:研究Rab7过表达及失活突变(Rab7T22N)对CpG刺激的RAW264.7巨噬细胞中分泌细胞因子的影响。方法:采用RT-PCR和Real-time PCR检测RAW264.7细胞中Rab7在CpG刺激下表达模式。将Rab7真核表达质粒及失活突变质粒Rab7T22N通过脂质体法转染RAW264.7细胞,G418稳定筛选,Western法鉴定表达效果。用CpG刺激稳定表达Rab7的RAW264.7细胞系,RT-PCR和Real-time PCR检测细胞因子IL-6、IL-1β、IFN-β的表达量变化。结果:CpG刺激RAW264.7后,Rab7 mRNA表达水平逐渐增高,在8小时达到高峰,表达增高近4倍。Rab7过表达后,CpG刺激后产生的IL-6、IL-1β、IFN-β显著降低。巨噬细胞中Rab7失活突变后,在CpG刺激后IL-6、IL-1β、IFN-β的表达又显著增加。结论:CpG促进RAW264.7巨噬细胞中Rab7 mRNA的表达,Rab7抑制了CpG刺激的巨噬细胞中IL-6、IL-1β、IFN-β的表达,该抑制作用的发挥与其酶活性的GTP结合有关。该研究为进一步阐明Rab7在CpG/TLR9信号通路中的作用奠定了基础。

LITAF、RAB7、LMNA和MTMR2基因在中国人腓骨肌萎缩症患者的突变分析

为了分析LITAF、RAB7、LMNA和MTMR2基因在中国人腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth disease,CMT)的突变特点,文章分别应用PCR结合DNA序列分析方法和PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)结合DNA序列分析方法对6个常染色体显性遗传家系先证者和27个散发病例进行LITAF和RAB7基因突变分析;应用PCR-SSCP结合DNA序列分析方法对14个常染色体遗传的CMT家系先证者和27个散发患者进行LMNA和MTMR2基因突变分析。结果发现:LITAF基因c.269G→A、c.274A→G序列变异和LMNA基因c.1243G→A、c.1910C→T序列变异,未发现RAB7和MTMR2基因的序列变异。其中LITAF基因c.269G→A、LMNA基因c.1243G→A和c.1910C→T为新发现的单核苷酸多态;LITAF基因c.274A→G为已知多态。说明LITAF、RAB7、LMNA和MTMR2基因突变在中国人CMT患者中罕见。

α-硫辛酸对糖尿病肾病自噬相关因子LC3、Rab7和Beclin1表达的影响

目的:研究α-硫辛酸对糖尿病肾病(DN)自噬相关因子LC3、Rab7和Beclin1表达的影响。方法:2型糖尿病肾病Ⅲ期患者110例,其中55例常规治疗为对照组,55例患者在常规治疗的基础上加用硫辛酸治疗为研究组;建立DN模型大鼠,对比硫辛酸治疗的DN患者和DN模型组大鼠Scr、BUN水平和肾脏组织中LC3、Rab7和Beclin1的表达的影响。结果:治疗后两组患者Scr和BUN均显著降低(P<0.05),且研究组患者治疗后Scr和BUN均显著低于对照组患者(P<0.05),肾脏组织中LC3、Rab7和Beclin1蛋白表达均显著高于对照组(P<0.05);DN模型大鼠经硫辛酸治疗后,Scr和BUN均显著降低(P<0.05),肾脏组织中LC3、Rab7和Beclin1基因表达显著升高(P<0.05)。结论:α-硫辛酸对糖尿病肾病肾脏的保护作用可能通过促进肾脏中自噬相关因子LC3、Rab7和Beclin1的表达有关。

SIRT1通过调节FOXO1/RAB7信号通路促进低氧诱导的胰腺癌细胞自噬

目的:探讨SIRT1对低氧诱导的胰腺癌细胞自噬的影响及FOXO1/RAB7信号通路在其中的作用。方法:利用Western blot和免疫荧光法检测SIRT1在低氧诱导的自噬胰腺癌细胞核内的表达情况。将下调 SIRT1 基因的小干扰RNA和过表达 SIRT1 的质粒转染到胰腺癌Panc-1细胞中,敲减和过表达 SIRT1 基因;激光共聚焦显微镜追踪双色LC3荧光蛋白表达,Western blot实验检测自噬相关蛋白LC3、p62及FOXO1/RAB7信号通路的蛋白表达情况。通过生物信息学GEPIA网站关联性分析预测SIRT1与FOXO1的相互作用,并进一步利用免疫共沉淀技术检测 SIRT1与FOXO1蛋白的相互作用。结果: SIRT1在低氧诱导的胰腺癌细胞核内表达增加。敲减SIRT1 的表达可以引起胰腺癌细胞自噬受抑制。过表达 SIRT1 能够增强Panc-1细胞中FOXO1和RAB7的蛋白表达水平( P <0.05),而当 SIRT1 表达下调时,FOXO1和RAB7表达受到抑制( P <0.05)。SIRT1与FOXO1蛋白存在相互作用。结论: SIRT1可能参与胰腺癌细胞自噬的调控,其机制可能与 FOXO1/RAB7信号通路有关。

Rab7在自噬体和溶酶体融合过程作用的研究进展

自噬体与溶酶体的有效融合是细胞发挥自噬功能对细胞内多余物质进行降解和再利用的关键。自噬体与溶酶体的融合受控于复杂的信号通路网络,涉及多个环节及众多分子的协同作用,并与内吞机制有部分重叠。Ras相关蛋白7(Rab7,小GTP酶家族的成员)可能是自噬体与溶酶体的融合进程中最为重要的分子之一,在指导自噬体成熟、胞内负荷运输及与溶酶体的对接与融合过程中发挥重要调节功能。自噬体与溶酶体的融合障碍可引起先天性及适应性免疫应答异常,导致炎症、肿瘤及胞内微生物感染的加重。因此控制Rab7的活性可能成为治疗这些疾病的潜在靶点。

花生AhRab7基因的克隆及其原核表达研究

为了研究花生小G蛋白AhRab7基因在大肠杆菌中的表达模式及与高盐胁迫的关联性,采用RT-PCR技术从花生(Arachis hypogaea L.)品种花育20中克隆了AhRab7(7-1、7-2)的cDNA全长序列,通过核苷酸序列和氨基酸序列分析结果表明AhRab7(7-1、7-2)的cDNA全长分别为872 bp、816 bp,分别含1个621 bp、618 bp大小的开放阅读框(ORF,open readingframe),拟编码氨基酸数分别为206aa、205aa。将携带完整的ORF序列连入表达载体pET-28a(+)中,经IPTG诱导后进行耐盐性测定,结果表明两种全长重组酶(分别含pET-28a-Rab7-1和pET-28a-Rab7-2的重组质粒)均具有正常酶活性,明显缓解了高盐环境(5.5%～10%NaCl溶液)对大肠杆菌的生长胁迫,而对照组(含空载体pET-28a)未能检测出相同的酶活性,结果表明AhRab7基因表达可以显著缓解高盐胁迫影响。目的基因经IPTG诱导后高效表达,SDS-PAGE电泳检测到目标蛋白的大小为23kDa,与预测结果一致。这为后期探讨花生对盐胁迫及其他非生物胁迫的研究奠定了一定的基础。

Rab7基因沉默对巨噬细胞中R848激活的细胞因子及MAPK信号通路影响

目的:本实验阐述了Rab7对Raw264.7巨噬细胞中R848激活TLR7(Toll like receptor-7)所产生的细胞因子的影响,并探讨Rab7对MAPK信号转导的影响。方法:使用Rab7刺激silence-Rab7-Raw264.7细胞,检测R848激活TLR7后产生的TNF-α、IL-6、IFN-α、IFN-β与IP-10,通过Western blot检测MAPK的磷酸化水平,分析Rab7对MAPK的信号转导的作用。结果:Rab7对TLR7激活后细胞因子的产生具有抑制作用,Rab7对MAPK信号通路具有抑制作用。结论:本实验结果进一步说明Rab7是TLR7信号转导通路的负向调控因子,并且参与到MAPK信号通路中。

Rab7 GTPase负向调节巨噬细胞中poly I:C诱导的细胞因子的表达

目的:通过构建Rab7的失活突变载体tRab7(Rab7T22N),研究Rab7失活突变后对poly I:C诱导的RAW264.7巨噬细胞中细胞因子的影响。方法:利用PCR定点突变法构建Rab7的失活突变载体Rab7T22N,将Rab7的真核表达载体及其突变体tRab7通过脂质体法瞬时转染RAW264.7细胞,通过Western blot方法检测Rab7的表达情况。poly I:C刺激转染细胞不同时间后检测细胞因子IFN-β、IP10、TNF-α和IL-1β的表达变化。结果:Western blot检测结果显示,与转染空质粒的对照细胞相比,转染Rab7和tRab7的细胞中Rab7的蛋白水平显著增高。Rab7过表达后,抑制了巨噬细胞RAW264.7中poly I:C刺激后IFN-β、IP10、TNF-α和IL-1β的产生,而Rab7失活突变体tRab7(Rab7T22N)过表达后显著促进了IFN-β、IP10、TNF-α和IL-1β的表达。结论:Rab7抑制了poly I:C刺激的巨噬细胞中IFN-β、IP10、TNF-α和IL-1β的表达,该抑制作用依赖于其GTP结合活性。本研究为进一步阐明Rab7在TLR3信号转导通路中的作用奠定了基础。

Rab7蛋白参与了BLP耐受巨噬细胞对细菌清除能力增强的过程

目的:探讨Rab GTP酶是否参与了对细菌脂蛋白(BLP)耐受的骨髓诱导分化巨噬细胞(BMDMs)杀菌能力增强的过程。方法:首先利用real-time PCR比较BLP耐受巨噬细胞和非耐受细胞中Rab5a、Rab5b、Rab7、Rab9、Rab9b、Rab11a、Rab11b、Rab12、Rab32和Rab34的表达变化,筛选出水平升高的Rab7分子;进一步用real-time PCR和Western blot实验证实Rab7的mRNA和蛋白表达是否在BLP耐受细胞感染大肠杆菌后继续升高;接下来用RNAi技术下调BLP耐受巨噬细胞Rab7表达,观察细胞对细菌的吞噬能力及杀灭能力的影响。结果:在检测的10个Rab GTP酶中,Rab7在BLP耐受BMDMs的mRNA水平升高,是非耐受细胞的1.4倍;进一步用real-time PCR和Western blot实验证实Rab7的mRNA和蛋白表达在BLP耐受细胞感染大肠杆菌后,随着时间延长均明显升高;下调Rab7表达不影响BLP耐受巨噬细胞对细菌的吞噬能力,但是显著降低其对细菌的杀灭能力。结论:BLP耐受通过上调巨噬细胞Rab7的表达,在增强巨噬细胞对细菌的杀灭过程中发挥重要作用。

鸡Rab7b在细胞晚期内吞体定位和结合恒定链的分子特征

Rab蛋白是介导胞内活性蛋白转运的分子家族。恒定链(invariant chain,Ii)具有协助抗原肽转运、B细胞成熟和作为细胞因子的受体等免疫学功能。前期研究发现,鸡(Gallus gallus)Rab5a在细胞早期内吞体中与Ii结合,但不清楚是否还有其他转运蛋白有该特性。基于Rab7b分子定位于晚期内吞体,并与胞内分子转运相关,本研究探索了鸡Rab7b与Ii结合的分子结构特征。首先,用自行设计的引物扩增了鸡和小鼠(Mus musculus)Rab 7 b基因,并进行了氨基酸同源性比对分析;构建了含鸡Rab7b及其67位氨基酸突变体Rab7bQ67L的原核和真核重组质粒。其次,将含红色荧光蛋白和目的基因的重组质粒转染鼠巨噬细胞系Raw264.7,培养后用绿色荧光素(FITC)标记的鼠抗晚期内吞体蛋白1(LAMP1)抗体染色,观察目的蛋白在内吞体的定位。进一步将鸡Rab7b和Rab7bQ67L分别与Ii共转染293T细胞,观察它们与Ii的共定位。最后用拉下法和免疫印迹检测鸡Rab7b及Rab7bQ67L与Ii的结合。结果表明,所克隆获得的鸡Rab 7 b基因与预期大小一致,其开放阅读框为624 bp,编码208个氨基酸。鸡和鼠的Rab7b蛋白质结构相似性为74%。尽管鸡Rab7b和突变体Rab7bQ67L均能结合Ii,但只有Rab7b可以定位于晚期内吞体,而突变体却改变了该定位特性。综上所述,鸡Rab7b与Ii不仅在晚期内吞体共定位,而且还能互相结合;鸡Rab7b的第67位氨基酸影响其在细胞内定位而不影响与Ii结合。综上表明,Rab分子参与了Ii在细胞内细胞器的转运,为进一步研究Ii在细胞内的转运机制提供了新的途径。

腓骨肌萎缩症RAB7基因突变分析

目的探讨RAS相关GTP结合蛋白7(RAB7)基因在中国人腓骨肌萎缩症的突变特点。方法应用聚合酶链反应—单链构象多态性(PCR-SSCP)并结合DNA序列分析的方法,对已经排除PMP22的大片段重复突变和PMP22、MPZ、Cx32、NEFL、GDAP1、Hsp22、Hsp27点突变的33例患者进行RAB7基因突变分析。结果33例患者所有外显子PCR产物量和特异性均较好,但SSCP均未出现异常条带,未发现RAB7基因突变。结论RAB7基因突变可能在中国人腓骨肌萎缩症患者中少见。

稳转GFP-RAB7的肾小管上皮细胞在缺氧状态下RAB7的表达及位置变化

目的:了解缺氧状态下RAB7蛋白在稳转GFP-RAB7表达载体的肾小管上皮细胞中的表达及位置变化,验证其对细胞自噬与内吞现象的指示作用。方法:构建GFP-RAB7表达融合蛋白慢病毒载体转染肾小管上皮细胞(HK-2),缺氧处理后,采用RT-qPCR、蛋白质印迹技术和激光共聚焦技术检测外源基因RAB7在细胞内的表达及位置的变化。结果:成功将GFP-RAB7基因的表达载体转染到HK-2细胞中,并获得稳定表达GFP-RAB7蛋白的HK-2细胞;在缺氧状态下,RAB7 mRNA的表达轻微降低,蛋白水平没有变化;激光共聚焦显微镜发现GFP-RAB7蛋白发生聚集,显示自噬与内吞的形成。结论:成功建立稳定转染的表达GFPRAB7的HK-2细胞系,GFP-RAB7融合蛋白可指示自噬与内吞现象,为研究缺氧状况下肾小管上皮细胞自噬与内吞提供了有效工具。

SapM诱导的自噬体-溶酶体融合阻断依赖于SapM和Rab7的相互作用

目的研究Rab7在结核分枝杆菌毒力因子分泌性酸性磷酸酶(SapM)诱导的自噬体-溶酶体融合阻断中的作用。方法采用Rab7小干扰RNA(si Rab7)转染Raw264.7细胞,Western blot法检测P62蛋白水平。m Cherry-SapM转染Raw264.7细胞后免疫荧光检测SapM与Rab7共定位情况,免疫共沉淀分析SapM与Rab7的关系。用3种SapM的突变体SapM△ARCA,SapM△FRED和SapM△CT转染Raw264.7细胞,分析SapM的不同突变体与Rab7的关系。结果 si Rab7处理后,细胞P62水平显著增高;免疫组织化学染色结果显示SapM与Rab7在胞内共定位;免疫共沉淀分析显示SapM与Rab7可相互沉淀;3种不同突变形式的SapM中,只有SapM△CT不能与Rab7相互作用。结论 SapM诱导的自噬体-溶酶体融合阻断依赖于SapM与Rab7的相互作用。

鸡Ii结合Rab5a和Rab7b分子的分析

本研究旨在探明鸡恒定链(invariant chain,Ii)与内吞体转运蛋白Rab5a和Rab7b结合的结构域和在细胞内共定位的特征。首先,用PCR和基因突变技术将Ii胞浆区与跨膜区[Ii_((Cyt-Tra))]、Ii CLIP(classⅡ-associated invariant chain peptide)-三聚体区[Ii_((CLIP-TRIM))]和Ii突变体[Ii(M81-87aa)、Ii_((M91-99aa))和Ii_((M81-99aa))]分别插入pET-32a和pEGFP-C1构建相应的原核和真核重组质粒。其次,将构建的含有绿色荧光蛋白的重组质粒与实验室保存的含有红色荧光Rab5a和Rab7b的重组质粒共转染至人胚胎肾细胞系293 T,观察它们的共定位。将构建的原核重组质粒进行表达和纯化,最后用拉下法和免疫印迹检测Ii与Rab5a和Rab7b的结合域。结果表明,成功构建Ii结构域及Ii突变体的重组质粒。Ii_((Cyt-Tra))及Ii突变体均能与Rab5a和Rab7b在细胞内共定位,而Ii_((CLIP-TRIM))与空载体却不能。Ii的胞浆区和跨膜区是与Rab5a和Rab7b结合的功能结构域,而不是CLIP与三聚体区。综上所述,鸡Ii与Rab5a和Rab7b共定位和结合的区域是其胞浆区和跨膜区,而不是内质网腔区。这些结果提示Rab分子参与了Ii在胞内细胞器的转运机制,为进一步研究Ii及其载体在细胞内的转运机制和功能提供了新的途径。