鸡Rab7b在细胞晚期内吞体定位和结合恒定链的分子特征

Rab蛋白是介导胞内活性蛋白转运的分子家族。恒定链(invariant chain,Ii)具有协助抗原肽转运、B细胞成熟和作为细胞因子的受体等免疫学功能。前期研究发现,鸡(Gallus gallus)Rab5a在细胞早期内吞体中与Ii结合,但不清楚是否还有其他转运蛋白有该特性。基于Rab7b分子定位于晚期内吞体,并与胞内分子转运相关,本研究探索了鸡Rab7b与Ii结合的分子结构特征。首先,用自行设计的引物扩增了鸡和小鼠(Mus musculus)Rab 7 b基因,并进行了氨基酸同源性比对分析;构建了含鸡Rab7b及其67位氨基酸突变体Rab7bQ67L的原核和真核重组质粒。其次,将含红色荧光蛋白和目的基因的重组质粒转染鼠巨噬细胞系Raw264.7,培养后用绿色荧光素(FITC)标记的鼠抗晚期内吞体蛋白1(LAMP1)抗体染色,观察目的蛋白在内吞体的定位。进一步将鸡Rab7b和Rab7bQ67L分别与Ii共转染293T细胞,观察它们与Ii的共定位。最后用拉下法和免疫印迹检测鸡Rab7b及Rab7bQ67L与Ii的结合。结果表明,所克隆获得的鸡Rab 7 b基因与预期大小一致,其开放阅读框为624 bp,编码208个氨基酸。鸡和鼠的Rab7b蛋白质结构相似性为74%。尽管鸡Rab7b和突变体Rab7bQ67L均能结合Ii,但只有Rab7b可以定位于晚期内吞体,而突变体却改变了该定位特性。综上所述,鸡Rab7b与Ii不仅在晚期内吞体共定位,而且还能互相结合;鸡Rab7b的第67位氨基酸影响其在细胞内定位而不影响与Ii结合。综上表明,Rab分子参与了Ii在细胞内细胞器的转运,为进一步研究Ii在细胞内的转运机制提供了新的途径。

鸡Ii结合Rab5a和Rab7b分子的分析

本研究旨在探明鸡恒定链(invariant chain,Ii)与内吞体转运蛋白Rab5a和Rab7b结合的结构域和在细胞内共定位的特征。首先,用PCR和基因突变技术将Ii胞浆区与跨膜区[Ii_((Cyt-Tra))]、Ii CLIP(classⅡ-associated invariant chain peptide)-三聚体区[Ii_((CLIP-TRIM))]和Ii突变体[Ii(M81-87aa)、Ii_((M91-99aa))和Ii_((M81-99aa))]分别插入pET-32a和pEGFP-C1构建相应的原核和真核重组质粒。其次,将构建的含有绿色荧光蛋白的重组质粒与实验室保存的含有红色荧光Rab5a和Rab7b的重组质粒共转染至人胚胎肾细胞系293 T,观察它们的共定位。将构建的原核重组质粒进行表达和纯化,最后用拉下法和免疫印迹检测Ii与Rab5a和Rab7b的结合域。结果表明,成功构建Ii结构域及Ii突变体的重组质粒。Ii_((Cyt-Tra))及Ii突变体均能与Rab5a和Rab7b在细胞内共定位,而Ii_((CLIP-TRIM))与空载体却不能。Ii的胞浆区和跨膜区是与Rab5a和Rab7b结合的功能结构域,而不是CLIP与三聚体区。综上所述,鸡Ii与Rab5a和Rab7b共定位和结合的区域是其胞浆区和跨膜区,而不是内质网腔区。这些结果提示Rab分子参与了Ii在胞内细胞器的转运机制,为进一步研究Ii及其载体在细胞内的转运机制和功能提供了新的途径。

胎膜早破与GBS感染和胎膜Rab7b、Smad3表达的关系

目的探讨胎膜早破孕妇B族链球菌(GBS)感染情况及胎膜Rab蛋白7b(Rab7b)、Smad同源物3(Smad3)的表达。方法选取2018年11月-2020年11月于新乡市中心医院住院分娩的胎膜早破孕妇94例为研究组,同期住院正常分娩的孕妇64名为对照组,分析两组孕妇GBS携带情况;采用免疫组织化学法检测胎膜组织中Rab7b表达,免疫印迹法(WB)检测Smad3表达;酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中C-反应蛋白(CRP)水平。结果研究组GBS检出率为34.04%,高于对照组的检出率15.62%(P<0.05);Rab7b蛋白在两组孕妇胎膜组织中均未见表达;研究组Smad3蛋白相对表达量为(1.24±0.15)低于对照组(t=12.888,P<0.001);胎盘绒毛膜羊膜炎在研究组中的发生率高于对照组(P<0.05);CRP在研究组中测定阳性率为82.98%,显著高于对照组的阳性率18.75%(P<0.05)。结论GBS感染与胎膜早破的发生有关,在胎膜早破孕妇胎膜中Smad3含量呈低表达,血清中CRP表达水平升高。

孕妇GBS感染对PROM胎膜组织细胞凋亡和胎膜弹性相关蛋白表达的影响

目的 探讨B族链球菌(GBS)感染对胎膜早破(PROM)产妇胎膜组织中白细胞介素-18(IL-18)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、B细胞淋巴瘤基因-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和Rab蛋白(Rab7b)表达及妊娠结局的影响。方法 选取2017年11月-2020年11月医院收治的108例PROM产妇为PROM组,选择同期于医院分娩的无PROM产妇58名为对照组,采用免疫组化法测定两组胎膜组织中IL-18、MMP-2、Bcl-2、Bax、Rab7b蛋白表达,分析两组妊娠结局。结果 PROM组GBS感染、绒毛膜羊膜炎、剖宫产比例均高于对照组(P<0.05)。PROM组胎膜组织中IL-18、MMP-2、Bax阳性表达率和相对表达量均高于对照组,Bcl-2阳性表达率和相对表达量均低于对照组(P<0.05)。PROM组中GBS感染产妇胎膜组织中IL-18、MMP-2、Bax相对表达量均高于GBS未感染产妇,Bcl-2表达量低于GBS未感染产妇(P<0.05)。GBS感染PROM产妇新生儿早产、宫内窘迫、宫内感染发生率高于GBS未感染产妇(P<0.05)。结论 PROM产妇GBS感染率异常上升,GBS感染导致PROM产妇胎膜组织中IL-18、MMP-2、Bcl-2和Bax表达异常,并提升不良妊娠结局发生率。