兔皮肤成纤维细胞的体外培养和NESTED-PCR支原体污染检测

[目的]为动物细胞核移植、转基因操作等提供充足的供体材料。[方法]通过对兔皮肤成纤维细胞的体外原代、传代培养和冷冻复苏,检测支原体污染状况。[结果]结果表明:在含有15%FCS(Fetal Calf Serum)的DMEM中培养的细胞初期生长状态较10%FCS中的细胞长势好,后期则相反。用PCR法对培养至25代的兔皮肤成纤维细胞进行支原体检测,均没有发现支原体污染现象。[结论]PCR法检测细胞培养支原体污染具有灵敏、准确、简便、快速、特异性好的优点。

扩张兔皮肤超微结构的变化

目的 :动态观察扩张兔皮肤超微结构的变化。方法 :选用 2～ 3kg新西兰大白兔 6 4只 ,分为 2大组 ,快速扩张组和常规扩张组 ,每组 32只 ,每大组再分为 4组 ,为扩张完成后即时、1周、12周、2 4周组 ,每组 8只 ,其中 4只为实验组 ,另 4只植入扩张器不扩张作为对照组。透射电子显微镜观察各组皮肤超微结构的变化。结果 :表皮扩张后经历一由扩张刺激引起的创伤至完全修复的过程。扩张后即时真皮中成纤维细胞大量增生 ,功能由静止转向活跃 ,胶原纤维碎裂成片 ,弹力纤维部分断裂 ,炎症细胞浸润 ;扩张后 1周常规扩张组基底膜连续性基本恢复 ,显示成纤维细胞合成功能活跃。扩张后 12周、2 4周 ,成纤维细胞趋于稳定、形态狭长 ,部分胶原排列紊乱 ,部分有似瘢痕样改变。结论 :扩张刺激可致兔皮肤创伤 。

兔成纤维细胞的分离与体外培养

用Ⅰ型、Ⅳ型胶原酶消化分离兔皮肤细胞，Ⅰ型胶原酶消化皮肤块获得的细胞数显著高于Ⅳ型胶原酶。用组织块直接培养法，也可以得到皮肤的原代培养细胞。２．５ｇ／Ｌ胰酶消化胎儿组织，可获得足够原代培养的细胞量。结合使用酶消化法和反复贴壁法，经２～３代后，可获得纯化的成纤维细胞。分离纯化的胎儿和皮肤成纤维细胞的生长曲线都正常且相似。胎儿和皮肤成纤维细胞可分别传至第１３代与第１１代，传代后染色体数目不变。

碱性成纤维细胞生长因子对兔皮肤成纤维细胞增殖的作用

目的:评价碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 对兔皮肤成纤维细胞增殖的影响.方法:在培养的兔皮肤成纤维细胞中添加浓度为10-1～102 μg/L的bFGF,应用甲基噻唑基四唑(MTT)法测定细胞增殖情况.结果与结论:10-1～102 μg/L的bFGF对兔皮肤成纤维细胞增殖有促进作用,且以50 μg/L浓度作用最佳.

重组人酸性成纤维细胞生长因子促进家兔体表溃疡愈合作用研究

目的观察重组人酸性成纤维细胞生长因子(rhaFGF)对家兔体表溃疡愈合的促进作用。方法建立家兔的体表溃疡模型,其中2组分别按90,60 AU.(cm2)-1的剂量给予rhaFGF,阳性对照组按60 AU.(cm2)-1的剂量给予重组牛碱性成纤维细胞生长因子(rb-bFGF),阴性对照组给予与第二组等量的溶媒。采用创面照相、透明膜描记称量法记录溃疡形成后第1,4,8天溃疡面面积,比较面积收缩量;用注水法测量伤腔容积,比较容积缩小量。溃疡形成后第8和第14天取创面组织,经10%甲醛溶液固定后制片,常规染色,重点观察创面肉芽组织生长情况,包括毛细血管生长、胶原沉积与再上皮化变化,以评价修复效果。结果各组家兔溃疡面面积随时间的延长而逐渐缩小,其中rhaFGF 60AU.(cm2)-1组和rb-bFGF60 AU.(cm2)-1组疗效更显著(均P<0.05)。各组家兔伤腔容积随伤后时间的延长而逐渐缩小,其中rhaFGF 60 AU.(cm2)-1组和rb-bFGF 60 AU.(cm2)-1组更为明显(均P<0.01)。组织学检查,可见rhaFGF60 AU.(cm2)-1组和rb-bFGF60 AU.(cm2)-1组治疗8 d后家兔的溃疡面成纤维细胞生长活跃,数量多,毛细血管胚芽与成纤维细胞数量显著多于阴性对照组;第14天,rhaFGF60 AU.(cm2)-1组和rb-bFGF60 AU.(cm2)-1组家兔溃疡面创面收缩和再上皮化明显,且优于阴性对照组。结论rhaFGF对家兔体表溃疡有促进愈合作用,可促进创面肉芽组织生长、毛细血管胚芽形成与再上皮化。

肝豆汤对肝豆状核变性皮肤成纤维细胞模型铜代谢的影响

目的 :在细胞水平探讨中药复方肝豆汤治疗肝豆状核变性的机理。方法 :通过建立 2 3例肝豆状核变性皮肤成纤维细胞模型 ,观察加入含肝豆汤兔血清前后细胞内Cu2 + 、Zn2 + 等微量元素含量的变化。结果 :加入含肝豆汤兔血清前与加入 2 4h后相比较 ,细胞内铜含量从 (80 94± 34 76 )ng/mg ,减少到(4 6 90± 2 2 14)ng/mg(P <0 0 1) ,细胞内锌含量从 (140 4 3± 33 81)ng/mg ,增加到 (151 4 3± 37 83)ng/mg(P <0 0 1)。结论 :肝豆汤具有显著的细胞内排铜作用和使细胞内锌含量增加的作用。

丹参酮ⅡA微针抑制瘢痕增生的作用及机制研究

目的考察丹参酮ⅡA(TSA)微针对瘢痕增生的抑制作用及机制。方法(1)动物实验:将42只新西兰兔随机分成正常组、模型组、空白微针组、阳性药物组(2.5%积雪草总苷)以及丹参酮ⅡA微针(TSA-MN)低、中、高剂量组[(173.93±3.55)μg、(421.44±6.67)μg、(619.94±12.39)μg]。通过新西兰兔耳腹侧面制备创口使其增生,得到兔耳增生性瘢痕模型,连续观察28 d;模型复制成功后给药干预,每日1次,连续21 d。采用HE染色观察增生性瘢痕组织病理形态变化,并测量瘢痕增生指数(SEI)和成纤维细胞密度;采用ELISA法检测兔血清中转化生长因子β1(TGF-β1)、白细胞介素2(IL-2)和白细胞介素4(IL-4)水平。(2)细胞实验:采用体外培养人皮肤成纤维细胞,分为空白对照组、空白微针组、丹参酮ⅡA原料药组(4μg·mL^(-1))以及丹参酮ⅡA微针高、中、低剂量组(6、4、2μg·mL^(-1))。采用Western Blot法检测人皮肤成纤维细胞中TGF-β1、Smad7蛋白表达。结果与正常组比较,模型组兔血清中的TGF-β1、IL-2、IL-4水平及兔耳增生性瘢痕组织SEI值均明显升高(P<0.05)。与模型组比较,丹参酮ⅡA微针中、高剂量组兔血清的IL-2、TGF-β1水平及兔耳增生性瘢痕组织SEI值、成纤维细胞密度均明显降低(P<0.05),丹参酮ⅡA微针高剂量组兔血清的IL-4水平明显降低(P<0.05)。Western Blot实验结果表明,与空白对照组比较,丹参酮ⅡA微针中、高剂量组人皮肤成纤维细胞的TGF-β1蛋白表达明显下调(P<0.05,P<0.01),丹参酮ⅡA微针低、中、高剂量组人皮肤成纤维细胞的Smad7蛋白表达显著上调(P<0.01)。结论丹参酮ⅡA微针有抑制增生性瘢痕的作用,可能与调节TGF-β1/Smad通路及其抗炎作用有关。

兔皮肤成纤维细胞在脱细胞真皮支架材料表面生长的研究

为了研究兔皮肤成纤维细胞在脱细胞真皮支架材料表面的生长活性,体外分离、扩增兔皮肤成纤维细胞,鉴定后作为种子细胞接种于脱细胞真皮支架材料上,对细胞在材料上的黏附率及其生长活力进行检测。利用DAPI荧光染色及SEM对细胞在材料上生长情况进行观察,对脱细胞真皮支架材料作为细胞载体的可行性以及用于移植的可行性进行了探讨。结果显示,可分离出单一的成纤维细胞,细胞在材料上的黏附率为96.78%,与在孔板内生长的细胞黏附率无显著性差异(P>0.05);细胞在材料上和在孔板上的生长趋势相似,但是在材料上生长活力较在孔板上小(P<0.01);DAPI荧光染色观察发现,材料上生长的细胞核形完整,且随着培养时间的增加,细胞数量增加;SEM观察结果显示,细胞在材料上能紧密黏附,培养5～10d,细胞在材料上能融合成细胞膜片。提示此脱细胞真皮支架材料可作为成纤维细胞培养载体和移植材料。