阴道毛滴虫Rab1a基因的cDNA克隆及重组表达

目的克隆和分析阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis,Tv)Rab1a基因,构建Rab1a基因表达重组载体并表达其融合蛋白,以进一步探讨其功能。方法提取阴道毛滴虫基因组DNA为模板,扩增TvRab1a基因,用pQE80L载体与TvRab1acDNA克隆构建原核表达重组体并表达融合蛋白,纯化表达产物并由SDS-PAGE鉴定。结果在阴道毛滴虫cDNA文库克隆中发现了Rab1a基因,序列分析显示Rab1a基因的基因组DNA序列含有一个25bp大小的内含子。成功构建了pQE/Rab1a原核表达重组体,并表达出预期大小的重组蛋白质。结论分析表明TvRab1a基因是阴道毛滴虫Rab1鸟苷三磷酸酶同源基因,它含有一个25bp的内含子。获得了该基因的重组蛋白,将对TvRab1a基因的功能进行进一步研究。

阴道毛滴虫Rab1a重组蛋白的表达和细胞内定位

目的制备阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis,Tv)Rab1a重组蛋白及其多克隆抗体,并对TvRab1a蛋白进行阴道毛滴虫的细胞内定位。方法将我们已构建的pQE80L/TvRab1a重组表达质粒转入大肠埃希菌E.coliM15,在IPTG诱导下表达重组蛋白,经Ni-NTA亲和柱层析后获得纯度较高的TvRab1a的重组蛋白;用经复性处理的重组蛋白免疫动物,获得TvRab1a重组蛋白抗血清,免疫印迹WesternBlot鉴定抗血清。采用荧光免疫细胞化学对TvRab1a蛋白进行细胞内定位。结果WesternBlot分析显示,TvRab1a重组蛋白可与豚鼠的抗TvRab1a血清反应,同时该抗血清在滴虫提取蛋白中检测到与预测TvRab1a分子量一致的条带;免疫荧光化学检测发现TvRab1a分布于细胞核周围的高尔基复合体与内质网。结论获得的抗TvRab1a蛋白的多抗血清可用于TvRab1a基因功能的研究;TvRab1a功能场所位于高尔基复合体与内质网。

MiR-150-5p通过靶向调控Rab1A抑制乳腺癌细胞MDA-231的上皮-间质转化

先前的研究表明,miR-150-5p发挥抑癌基因的作用,调控肿瘤细胞的侵袭与转移。然而,关于其在乳腺癌细胞侵袭与转移中的机制尚不明确。本实验旨在研究miR-150-5p负向调控Rab1A在乳腺癌细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)中的作用。双荧光素酶的结果显示,miR-150-5p可负向调控Rab1A。荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示,miR-150-5p在乳腺癌细胞MCF-7及MDA-MB-231(MDA-231)中的表达水平明显低于正常乳腺上皮细胞MCF-10A;在MDA-231中过表达miR-150-5p后,qRT-PCR结果显示,Rab1A mRNA的表达水平明显降低。Western印迹结果显示,过表达miR-150-5p后,miR-150-5p组细胞中的Rab1A、波形蛋白(vimentin)及N-钙黏着蛋白(N-cadherin)的表达水平相对于对照组(NC)细胞明显降低,而E-钙黏着蛋白(Ecadherin)的表达水平明显增加。Transwell侵袭和划痕实验显示,与miR-150-5p+Con组细胞相比,miR-150-5p+Rab1A组细胞的侵袭和迁移能力明显增加。qRT-PCR结果显示,miR-150-5p+Rab1A组细胞的Rab1A mRNA表达水平明显增加。Western印迹结果显示,miR-150-5p+Rab1A组细胞中的波形蛋白、N-钙黏着蛋白表达水平明显增加,而E-钙黏着蛋白表达明显降低,过表达Rab1A后显著逆转了miR-150-5p对EMT的影响。综上所述,miR-150-5p可以通过负向调控Rab1A抑制EMT,进而抑制乳腺癌细胞的侵袭和迁移。

Rab1A对NSCLC细胞迁移和JAK1磷酸化的影响

目的:观察Rab1A(Ras-related protein Rab-1A)对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞系迁移的影响及其分子机制。方法:应用siRNA干扰Rab1A基因表达;应用RTCA(real-time cell analysis)法分析干扰Rab1A基因表达对NSCLC细胞迁移速率的影响;应用免疫印迹观察干扰Rab1A基因表达对JAK1(Janus Kinase 1)磷酸化水平的影响。结果:与阴性对照组相比,Rab1A siRNA转染组NSCLC细胞系的Rab1A蛋白表达水平显著下调(P<0.01);干扰Rab1A基因表达抑制NSCLC细胞迁移(P<0.01);干扰Rab1A基因表达可下调NSCLC细胞迁移相关蛋白JAK1磷酸化水平(P<0.01)。结论:Rab1A通过调节JAK1磷酸化水平影响NSCLC细胞迁移。

Rab1A蛋白在胃腺癌组织中的表达情况及预后意义

目的探讨Rab1A蛋白在胃腺癌(Gastric adenocarcinoma,GAC)组织中表达情况以及其表达水平与患者预后的影响。方法组织芯片技术、免疫组化En Vision法检测Rab1A在平均随访5年的300例胃腺癌组织中表达水平。通过SPSS 17.0软件分析胃腺癌组织中Rab1A蛋白的表达情况与胃腺癌患者临床病理之间的关系,以及Rab1A蛋白表达水平对患者预后的影响。结果胃腺癌组织中Rab1A蛋白高表达率明显高于癌旁非癌胃组织(82.26%vs 31.43%,χ2=12.825,P=0.0016);在高-中分化(23.2%)、T1-3分期(31.5%)及临床分期Ⅰ~Ⅱ期(48.3%)胃腺癌组织中Rab1A蛋白高表达较低(P<0.05);生存(Kaplan-Meier法)分析显示,Rab1A蛋白表达低组比Rab1A蛋白表达高组的生存期明显延长,无进展生存期(Progression-free surial,PFS)及总生存期(Overall survival,OS)均延长,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Rab1A蛋白高表达对胃腺癌的发生发展具有促进作用,可作为胃腺癌患者预后评估的重要指标及靶向治疗的潜在靶标。