北极狐及乌苏里貉抑制素α亚基基因克隆及生物信息学分析

试验旨在克隆北极狐及乌苏里貉抑制素α(inhibinα,INHα)亚基基因并对其进行生物信息学分析。根据GenBank中犬科INHα预测mRNA序列(登录号:XM_545660.5)设计1对引物,用RT-PCR技术从北极狐及乌苏里貉的卵巢组织中扩增出INHα亚基基因,同时将其插入到克隆载体中,进行测序及生物信息学分析。测序结果表明,北极狐及乌苏里貉的INHα亚基基因CDS序列全长为1 107bp,编码369个氨基酸。北极狐及乌苏里貉的INHα亚基基因与犬的同源性最高,分别为97.9%与97.6%。系统进化树分析表明,北极狐及乌苏里貉与犬亲缘关系较近,同时也说明INHα亚基基因在不同物种及进化过程中具有高度保守性。对INHα亚基蛋白的高级结构预测发现,由于半胱氨酸间形成的二硫键导致其采用"蝴蝶形"或"开放手"构型,其中α-螺旋形成分子的"手腕"结构,β-折叠形成分子的"手指"结构。本研究成功克隆了北极狐及乌苏里貉的INHα亚基基因,同时进行了系统的生物信息学分析,为今后研究抑制素在卵母细胞-颗粒细胞同步发育过程中的生物学功能奠定了基础。

貉源阿留申病毒感染性克隆的构建及病毒拯救

旨在建立貉源阿留申病毒(RFAV)反向遗传系统,为在全基因水平上研究阿留申病毒的致病机制以及疫苗的研制提供平台。前期通过分段克隆成功获得RFAV中间编码区序列M1、M2、M3及末端序列信息。通过无缝克隆技术将RFAV中间编码区序列M1、M2、M3及人工合成的末端编码区序列构建到表达载体pBBSmaⅠ上,测序验证获得了全长质粒pBB-RFAV,将pBB-RFAV转染至F81细胞进行病毒拯救。通过细胞病变观察、PCR检测、qPCR检测病毒相对表达量、间接免疫荧光试验(IFA)、病毒粒子电镜观察共同验证拯救病毒。结果显示,细胞在转染后第48小时即可观察到明显的细胞病变,PCR检测到RFAV片段,qPCR鉴定发现拯救病毒可在F81细胞上稳定传代,增殖动态与水貂阿留申病毒(AMDV)相似,IFA结果显示感染细胞呈现特异荧光信号,通过电镜观察发现拯救病毒的粒子形态与AMDV已知形态特征基本一致。上述结果表明,构建了RFAV全基因组感染性克隆,并成功拯救出rRFAV,为深入研究阿留申病毒的病原学和免疫学奠定了基础。

貉狐源阿留申病病毒的感染检测与基因特征

为检测新发现的貉狐阿留申病病毒(RFAV)感染并分析该病毒的基因特征,应用PCR、对流免疫电泳(CIEP)和碘凝集(IAT)试验检测RFAV感染的貉、狐样品;用阿留申病病毒属保守引物对RFAV进行PCR扩增、测序并进行序列分析。结果显示,2012至2014年77只可疑RFAV感染病兽的PCR检测阳性率为81.8%,其中58份PCR阳性血清用AMDV-G抗原的CIEP检测的阳性率是100%,IAT检测的阳性率为92.0%。而健康貉、狐用PCR、CIEP和IAT检测均为阴性。RFAV的4个代表毒株蛋白NS1、VP2氨基酸序列与水貂阿留申病病毒(AMDV)的相似性分别小于76.7%、92.1%,与同属的灰狐阿留申病病毒(GFADV)的相似性更低。与AMDV和GFADV毒株相比,RFAV的NS3蛋白序列较短,为66aa;VP2蛋白的半胱天冬酶裂解位点417DTLS/A421是S420,不同于其他2种病毒的D420;NS1蛋白的半胱天冬酶裂解位点226EE/T228,与其他2种病毒不同。所有测序的RFAV高变区核酸序列进化树显示,RFAV形成阿留申病病毒属的一个新分支。3种方法检测结果分析表明,AMDV-G毒株抗原适用于狐、貉RFAV感染后抗体的CIEP检测;IAT试验可用于RFAV导致的貉高γ球蛋白血症检测。RFAV基因特征表明其不同于水貂阿留申病病毒,是自然感染貉和蓝狐的新种阿留申病病毒;这提示应采取有效措施预防貉、狐的阿留申病病毒感染。

貉源阿留申病毒全基因组测序及末端序列分子特征分析

貉源阿留申病毒(Raccoon dog and arctic fox amdoparvovirus,RFAV)是自然感染貉和蓝狐的新种阿留申病毒(Amdoparvovirus),为测序RFAV全基因组序列,预测分析RFAV末端发夹结构序列分子特征。本研究采用分段克隆成功获得3株长4832nt、4827nt、4830nt的RFAV全基因组序列,分别命名为RFAV-Y9J、RFAV-RD15、RFAV-HS-R,利用在线软件预测RFAV末端序列二级结构,并与水貂阿留申病毒(AMDV)末端序列进行同源性比对。结果显示阿留申病毒种间、种内3’末端基因组序列保守性强,均存在116nt的Y型发夹结构;RFAV-Y9J与RFAV-RD15毒株5′末端分别存在310nt、305nt的U型发夹结构,RFAV和AMDV种内5′末端基因组序列保守性强,而种间5′末端基因组序列有较大变异。本研究首次完整测序了RFAV的3′和5′末端序列,为其他种阿留申病毒的末端序列扩增提供一种有效方法,为构建RFAV的全基因组序列感染性克隆奠定了基础。