基于RACE模型的跨境电商独立站运营推广策略

当前跨境电商企业在选择独立站过程中面临着不亚于第三方平台的重大竞争压力,即使在实施了众多的网站营销策略与方法后收获仍然甚微,无法解决其窘迫的现状。本文以国内跨境电商公司在海外跨境电商企业独立站为例,基于RACE模型,通过对独立站进行分析,并依托模型提出有效的针对性解决方案,改善独立站运营效果,助力跨境电商企业独立站提高效益。

骆驼β-防御素caBD-1 cDNA基因全序列RACE扩增方法的建立

为获得骆驼β-防御素基因(caBD-1 cDNA)的全长序列,采用锚定PCR RACE技术,根据已获得的骆驼β-防御素基因的部分已知序列,设计了1条特异性引物作为上游引物,将反转录引物中的部分序列即3′接合器引物作为下游引物,成功地克隆了caBD-1 cDNA的3′末端序列;采用反向嵌套PCR RACE技术,根据已获得的骆驼β-防御素cDNA的部分序列,设计了1条5′末端磷酸化的特异性反转录引物和2对特异性反向嵌套PCR引物,首先进行反转录(RT),然后将mRNA反转录的cDNA进行环化,最后进行反向嵌套巢式PCR,成功地克隆了骆驼β-防御素caBD-1cDNA的5′末端序列。结果显示,获得了骆驼β-防御素caBD-1 cDNA基因的全序列。证实,RACE技术用于防御素基因的扩增是可行的。

SSH和“越轨”RACE分子克隆技术

SSH和“越轨”RACE(stepoutRACE)均为创建于PCR抑制作用基础上的cDNA基因克隆新技术。SSH具有真阳性率高、不同丰度的mRNA都能被有效分离等优点 ,“越轨”RACE具有高灵敏度、低背景、操作简便等长处 ,这两项技术现已经成功应用于大量EST的分离、减数cDNA文库的构建、差别表达新基因的分离 。

RACE法分离团头鲂生长抑素全长cDNA及其序列测定

生长抑素具有抑制脑垂体GH释放的作用,是调控鱼类生长的主要激素之一。本研究采用RT和RACE(rapid amplification of cDNA ends)法,分离和测定了团头鲂脑中生长抑素PSSI cDNA的全长核苷酸序列,并对该基因进行了结构和系统进化分析。3’RACE扩增得到700bp左右的片段,5’RACE分离得到500bp左右的片段,把3’片段与5’片段拼接得到全长cDNA。cDNA全长735bp[不含poly(A)],5’端非翻译区有100nt,3’端290bP[不包含poly(A)],阅读框(open reading frame,ORF)345bp。该序列与金鱼PSSI cDNA序列同源性为90％,主要差异在5’端非翻译区。团头鲂生长抑素mRNA阅读框编码114个氨基酸,包括一些酶切位点,产生26个氨基酸的大分子态生长抑素,进一步加工成与人等结构相似的14个氨基酸的生长抑素;团头鲂生长抑素前体氨基酸序列与金鱼、虹鳟、鲶鱼、鮟鱇、蛙、牛、鼠、鸡、猴、人等的比较发现,它与金鱼的同源性最高达95％,与鮟鱇最低50％,与人68％。这说明生长抑素基因在长期的进化中相当保守,同时,也因为鱼类生活环境多样导致基因变异较大。

RACE技术在钓取白血病相关基因LRP16全长cDNA中的应用

LRP16是我们应用甲基化敏感的限制性界标基因组扫描 (restrictionlandmarkgenomicscanning ,RLGS)技术时发现的一个与白血病复发相关的新基因。为钓取这一新基因的全长cDNA ,本实验采用了cDNA末端快速扩增法 (rapidamplificationofcDNAend ,RACE)。通过对RACE法若干步骤进行优化 ,克隆得到了LRP16基因cDNA的 5′ 与 3′ 非翻译区 ,进而获得其全长及完整的开放阅读框架 ,并作为新基因被GenBank收录。上述结果表明 ,RACE技术是钓取未知基因全长cDNA敏感而快速的方法 ,尤其是对 5′ 及 3′

cDNA文库与RACE方法结合克隆马铃薯DnaJ-like基因全长cDNA

以青枯病菌小种3号(生化变种2)PO41诱导24h和48h的马铃薯抗青枯病基因型ED13叶片为材料,应用SMART技术构建了一个富集青枯病抗性相关基因的cDNA文库。继而利用RACE技术与该cDNA文库相结合克隆了一个马铃薯分子伴侣基因的全长cDNA。该cDNA长735bp,5′端有25bp的非翻译区,3′端具有完整的polyA尾,包含一个编码177个氨基酸的完整开放阅读框架(GenBank登录号:DQ885360)。该分子伴侣基因与拟南芥DnaJ-like20的部分核苷酸序列具有84%的一致性,与其编码的氨基酸序列具有59%的一致性,暂命名为StDnaJ。目前在马铃薯中尚未发现与之同源的已知基因。半定量RT-PCR结果表明,该基因同时受青枯病菌的诱导和茉莉酸的调节,可能在青枯病菌和茉莉酸胁迫下具有促使胁迫损害细胞恢复活性的功能。

用RACE技术扩增并克隆牛BMP4基因3′端序列

RACE技术是一项扩增基因末端序列的新技术。该研究从牛BMP4基因出发,以牛软骨的RNA为模板,按照不同物种BMP4基因的相似性设计特异引物,运用PCR和RACE技术扩增并获得了特异片段,该片段经PCR、酶切和测序验证,证实所克隆序列为牛BMP4的3′端序列,包含有1170bp组成的开放读码框(ORF),编码389个氨基酸,3′非编码区121bp个核苷酸和poly(A)15。同源性分析结果表明,牛BMP4 cDNA最大开放读码框所推测的氨基酸序列与已知人、小鼠、大鼠、狗、羊和鸡等真核生物BMP4氨基酸序列进行比较,分别有94.5%、93.1%、91.9%、87.4%、94.2%、79%的同源性。这为克隆其他物种的BMP4基因提供了依据,同时牛骨形态发生蛋白的测序为我们更好的理解牛的生骨机理提供帮助。

cDNA文库与RACE方法结合克隆一个马铃薯病程相关蛋白基因cDNA(英文)

为克隆马铃薯晚疫病抗性相关基因 ,深入研究马铃薯晚疫病抗性机制 ,应用SMARTLD PCR技术 ,以晚疫病菌混合小种诱导 4 8h的水平抗性马铃薯 (SolanumtuberosumL .) (R gene free)叶片为材料 ,构建了一个富集晚疫病抗性相关基因的cDNA文库。为提高克隆全长cDNA的效率 ,将cDNA文库与RACE技术结合 ,依据本实验室得到的病原诱导表达片段测序结果 ,在其内部设计两个特异引物 ,与文库载体臂上的通用引物配对 ,以文库噬菌体DNA为模板 ,用高保真PCR分别扩增出cDNA 5′端与 3′端 ,从而简便、快捷地得到全长cDNA序列。采用此方法 ,在马铃薯中克隆了一个受晚疫病菌诱导表达的cDNA ,该cDNA长 90 4bp ,5′端有 2 9bp的非翻译区 ,3′端具有完整的polyA尾 ,包含一个 6 78bp的完整开放阅读框架 ,编码 2 2 6个氨基酸 (GenBank登录号 :AY 1 85 2 0 7)。BLAST检索发现其氨基酸序列与烟草一个新的病程相关蛋白基因NtPRp2 7具有 90 %的同源性 ,在马铃薯中尚未发现与之同源的已知基因。Northern杂交结果表明 ,水杨酸 (SA)、茉莉酸 (JA)、茉莉酸甲酯 (MeJA)、机械伤害和渗透胁迫都能诱导该基因表达。

青花菜BrERF2基因的RACE克隆与模拟酸雨胁迫下的表达分析

为探讨青花菜在模拟酸雨胁迫下ERF基因的表达变化,应用RACE克隆技术,克隆获得青花菜的ERF因的1条c DNA全长序列,命名为Br ERF2。应用生物信息学方法,对该基因编码蛋白的氨基酸组成、理化性质、跨膜结构域、信号肽导肽、疏水性/亲水性、二级结构、亚细胞定位、保守结构域等方面进行了预测和分析。结果表明:获得c DNA全长为958 bp,开放阅读框为804 bp,编码267个氨基酸,Real-time PCR结果分析表明模拟酸雨胁迫下Br ERF2基因的表达量发生变化,模拟酸雨胁迫初期表达量显著增大,随时间延长,又开始下降,表明其可能参与了青花菜抗酸雨胁迫的应答机制。本研究为青花菜的抗酸雨胁迫研究奠定了基础。

利用RACE技术扩增大豆抗病基因同源cDNA 5′末端序列

利用抗病基因保守序列筛选大豆cDNA文库,获得一抗病基因同源cDNA片段,命名为KR3-1。根据KR3-1设计两个基因特异引物(GSP和NGSP),分别与通用引物(UPM)和巢式通用引物(NUP)共同扩增,成功地克隆到了该基因的5’末端序列。该扩增片段长447bp,与已知序列重叠部分为129bp。

肝细胞癌高表达基因片段P02的全长RACE扩增和序列分析

目的扩增肝细胞癌高表达基因基因P0 2的全长cDNA序列,并利用生物信息学知识对其进行分析,为进一步研究该基因在肝细胞癌发生、发展中的作用奠定基础。方法运用SMARTRACE(RapidAmplificationofcDNAEnds)技术扩增P0 2的5’和3’末端cDNA ,对RACEPCR产物作TA克隆,碱裂解法抽提阳性克隆质粒,酶切和PCR验证目的片断的插入,Sanger双脱氧链中止法测序,利用BLAST、基因探索者等生物学软件对序列进行分析、拼接,获得全长cDNA ,利用在线预测软件预测该基因的生物学功能。结果获得865bp的全长cDNA序列,其开放读码框长172个氨基酸,与TPT1基因高度同源,是一个生理功能尚未完全明了、与生长相关的蛋白质,蛋白质结构和功能预测提示该基因产物可能是一个位于细胞膜的与生长相关的裂解酶。结论在肝细胞癌组织中成功克隆扩增了长865bp的P0 2全长cDNA序列,为进一步功能研究奠定基础。

用RACE结合cDNA文库筛选的方法获取新的锌指蛋白基因

大多数有重要功能的蛋白质都含相应的由保守氨基酸顺序组成的功能结构域。本文首先根据蛋白质功能结构域保守氨基酸序列设计简并引物 ,用PCR方法扩增出基因EST序列 ,再利用改进的快速扩增cDNA末端(RACE)方法从cDNA文库中扩增出基因非同源部位 ,然后以非同源序列为探针 ,筛选cDNA文库。利用此方法成功地从人骨髓cDNA文库中克隆到几个编码锌指蛋白并代表原有EST的新的全长cDNA。这一策略也应适用于筛选编码具有其他序列保守性功能结构域蛋白的基因。

3种5’RACE技术的比较与优化

目的研究环化法、末端脱氧核糖核酸转移酶法和SMART反转录酶法3种常用5’RACE的技术的特点,并对它们进行了优化。方法以播娘蒿RNA为模板,先按文献标准方法进行5’RACE,然后通过增加反应时间,提高部分反应物浓度等方法进行优化。结果未优化前环化法和TdT酶法条带几乎不可见,SMART反转录酶法隐约可见条带,但不清晰。优化条件后,环化法出现弥散条带,TdT酶法胜之,但条带依旧弥散,而SMART反转录酶法最佳,获得清晰特异性条带。结论SMART5’RACE效果最好,其次为TdT酶法,环化法效果有待改进,同时通过优化条件可以明显增加产物的特异性,为实验研究中5’RACE方法的选择提供了依据。

利用RACE方法克隆小麦β-1，3-葡聚糖酶基因的全长cDNA

【目的】研究小麦抗条锈菌的分子机制,在受条锈菌侵染的非亲和组合小麦叶片中克隆一个新的β-1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA。【方法】采用RT-PCR、cDNA末端快速扩增技术(RACE),在感染小麦条锈菌的小麦(水源11)叶片中进行-β1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA的扩增。【结果】得到了一个1338 bp-β1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA,Genbank上注册号为DQ090946,测序结果和序列生物信息学分析结果表明,其与-β1,3-葡聚糖酶基因gi3757681和gi6782375的同源性分别为94.3%和92.1%。该全长cDNA具有完整的编码框,编码334个氨基酸,Genbank上注册号为AAY96422,与-β1,3-葡聚糖酶CAA77085和AAA32958的同源性分别为95.8%和86.7%。【结论】初步推断此全长cDNA是小麦中编码-β1,3-葡聚糖酶的一个新基因。

甜菜夜蛾泛素延伸蛋白基因cDNA的3′RACE-PCR扩增及其克隆和表达

根据已知的草地夜蛾Spodopterafrugiperda的泛素延伸基因 5′端核苷酸序列设计引物 ,应用 3′RACE PCR技术 ,从甜菜夜蛾S .exigua脂肪体组织总RNA中反转录扩增泛素基因的cDNA片段。扩增得到的片段全长 5 13bp ,3′末端有 12 3bp的非翻译区 ,翻译区编码一个长为 12 9个氨基酸残基的蛋白质 ,预测分子量为 14 8kD。同源分析表明 ,此cDNA序列为ubiquitin 5 3aaextensionprotein(ubi 5 3)基因 ,在泛素蛋白后融合了一个核糖体L4 0蛋白 (ribosomalL4 0protein)。用MagAlign和Genedoc软件对cDNA编码的氨基酸序列进行了同源性分析 ,结果表明 :甜菜夜蛾的ubi 5 3基因与真核生物家蚕Bombyxmori、草地夜蛾、果蝇Drosophilamelanogaster和人Homosapienes泛素的同源性分别为 96 9%、98 5 %、95 3%和 93 0 % ,与甜菜夜蛾核型多角体病毒(SeNPV)泛素的同源性为 78 8% ,说明真核生物的泛素基因与核型多角体病毒的泛素基因可能存在不同的分子进化途径。将甜菜夜蛾的ubi 5 3基因克隆到原核表达载体pET 2 8a上 ,转化至BL2 1(DE3)中 ,用IPTG进行诱导表达 ,用异源泛素单克隆抗体进行Westernblot检测 。

RACE法克隆亚麻COMT基因及生物信息学分析

利用RACE技术克隆得到亚麻木质素合成关键酶基因COMT基因的cDNA全长序列,该基因cDNA全长1 726 bp(GenBank登录号为KC832865)。含有1 104 bp完整的开放阅读框,5'非编码区长423 bp,3'非编码区长199 bp。对序列进行生物信息学分析的结果 :编码的蛋白由367个氨基酸组成(其中亮氨酸38个,丙氨酸32个和丝氨酸28个),相对分子量为40 kD,等电点pI为5.7;蛋白质二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主;构建系统进化树表明与赤桉(Eucalyptus camaldulensis)亲缘关系最近。

全长cDNA的获得──RACE及其他方法进展

全长cDNA的获得是基因克隆的重要内容，也是基因组研究的重要内容之一。cDNA末端快速扩增技术（RACE）是获得全长cDNA的主要辅助手段之一，本文对RACE技术的原理、改进和近几年发展起来的新型RACE（包括RNA连接酶介导的RACE、oligo－capping等）作了综述。同时，对用干全长CDNA克隆的其他技术，如引物载体法、固相支持物法作了介绍。

RACE技术及其在植物基因研究中的应用

综述了RACE的技术原理、局限性、方法改良和新型的RACE技术,并且讨论了RACE技术在植物基因研究中的技术优势、应用现状和发展前景。

常规PCR与RACE结合法快速从cDNA文库中克隆基因

首先根据Fe(Ⅱ ) 转运蛋白基因家族的保守区设计同源的常规PCR引物 (F1,R1) ,扩增出 4 90bp的特异片段 .然后根据RACE法原理 ,巧妙地设计 3′RACE(F2 )和 5′RACE(R3)特异性引物 ,使两者既能分别与文库载体上的筛选扩增引物配对扩增cDNA 3′和 5′末端序列 ,又能使扩增出的 3′RACE和 5′RACE产物序列有重叠部分 ;另外设计引物时还兼顾到使F2和R3也能配对 ,从而能对 3′RACE和 5′RACE扩增产物进行双特异性引物常规PCR鉴定 .该方案不但能够直接根据序列鉴定 3′RACE和 5′RACE产物是否为同一基因序列 ,还能快捷地用常规PCR鉴定 3′RACE和5′RACE扩增产物是否为特异性扩增 ,避免了对非特异性扩增产物的克隆测序等繁琐的鉴定过程 ,优化了基因克隆策略 .最后根据拼读出的全长序列设计引物 (F4 ,R4 )扩增出完整编码区 .应用该方法成功地从小金海棠缺铁处理的根系cDNA文库中克隆了Fe(Ⅱ ) 转运蛋白基因的cDNA .

5’-RACE技术在钓取未知基因中的应用

目前，钓取基因CDNA全长的方法包括CDNA文库筛选法和5’－RACE（RapidamplificationofcDNAends，RACE）技术’。CDNA文库筛选法烦琐、工作量大，费用昂贵；而5’．RACE技术灵敏、快速。我们采用5’－RACE技术钓取ECRGI、ECRGZ（ECRG！、ECHGZ通过mRNA差异显示技术得至IJ的...