砂藓干旱胁迫相关转录因子基因RcTIFY1的克隆及表达分析

TIFY是植物特有的转录因子,可以调控植物分生组织的分裂,控制果实成熟度,也能提高植物抗旱性,并且减少机械损伤造成的伤害。本研究以砂藓(Racomitrium canescens)为材料,从砂藓干旱胁迫转录组数据库中筛选获得1个在干旱胁迫处理中具有显著差异表达的TIFY基因的m RNA序列,将该序列命名为RcTIFY1。我们对RcTIFY1基因全长CDS序列进行了克隆,并对RcTIFY1基因进行生物信息学分析,同时分析了砂藓在干旱和高温胁迫处理下RcTIFY1基因的表达变化。结果表明,该基因cDNA全长为1326 bp,包含1287 bp的开放阅读框,编码含有428个氨基酸残基的多肽片段。预测RcTIFY1基因编码的蛋白质有TIFY家族的保守结构域。预测RcTIFY蛋白质分子质量为46.14 kD,理论等电点为9.31,具有亲水性,不属于跨膜蛋白且不存在信号肽。本研究可为进一步探索RcTIFY1基因在苔藓植物中的抗逆机制提供数据基础。

砂藓总蛋白质提取方法的选取及双向电泳体系的建立

为进行砂藓(Racomitrium canescens)蛋白质组学的双向电泳工作,首要前提是获得质量较好的砂藓总蛋白质,并建立一套完整高效的适用于砂藓的双向电泳体系。本研究以砂藓为研究对象,比较了Tris-酚抽提法、TCA-丙酮法和试剂盒法3种蛋白质提取方法获得砂藓总蛋白质的浓度和完整性,并对砂藓中蛋白质双向电泳的运行条件进行了优化和比较。结果表明:在3种砂藓总蛋白质提取方法中,Tris-酚抽提法获得的砂藓总蛋白质浓度最高,SDS-PAGE电泳结果中条带清晰且较完整,双向电泳后获得的蛋白质点最多,是3种方法中提取砂藓蛋白质浓度最高完整性最好的方法;基于Tris-酚抽提法的基础上进一步对砂藓总蛋白质双向电泳体系进行优化,结果显示:利用pH值范围为pH 4~7的IPG胶条,蛋白质上样量为1 000μg的条件下,获得的砂藓蛋白质双向电泳图谱蛋白质点最多,图谱中可分辨的蛋白质点共(872±15)个,且低丰度蛋白质点清晰。本研究筛选出的方法获得了蛋白质点分布均匀、背景清晰、分辨率高、质量较高的双向电泳图像,建立了砂藓蛋白质组学研究体系的较好方法。本研究结果为砂藓蛋白质组学研究提供了良好基础。

砂藓抗旱相关基因磷脂酶D的克隆和表达分析

磷脂酶D是广泛存在于植物中的一种磷脂酶,在细胞结构组成和生理功能的变化中具有非常重要的作用。在本研究中,以在砂藓(Racomitrium canescens)转录组数据库中获得的一条与抗旱相关的磷脂酶D基因为基础,采用RT-PCR技术克隆得到该基因的全长CDS序列,命名为Rc PLD。生物信息学分析结果表明,Rc PLD基因c DNA全长1 420 bp,含有894 bp的开放阅读框,能够编码长度为297个氨基酸的多肽链。Rc PLD蛋白质的生物信息学分析结果表明,Rc PLD相对分子质量为33.192 k D,理论等电点p I为6.60,不含有跨膜结构,存在信号肽,具有磷脂酶D的保守结构域,属于不稳定的疏水性蛋白质。实时荧光定量PCR分析表明,在砂藓的复水过程和脱水处理条件下Rc PLD基因均有差异表达,说明该基因可能参与砂藓中响应干旱胁迫的某些生理代谢途径。本研究可为苔藓植物中抗旱机制的研究提供理论基础。

砂藓抗高温相关基因RcDAPDC的克隆及表达分析

二氨基庚二酸脱羧酶(diaminnopimelate decarboxylase, DAPDC)是合成赖氨酸的关键酶,在生物体的生命活动及非生物胁迫应答过程中发挥重要作用。本研究在砂藓(Racomitrium canescens)高温胁迫蛋白质组数据中发现一个表达量上调的DAPDC蛋白质,将其命名为RcDAPDC,并对编码此的基因全长CDS序列进行了克隆,还对此基因进行了基本的生物信息学分析,同时对砂藓在60℃高温胁迫、脱水和复水条件下的表达变化进行了分析。RcDAPDC基因CDS全长1 521 bp,编码蛋白质的氨基酸数为506,相对分子质量为55.9 kD,理论等电点为5.83,不稳定指数为36.91,是一个稳定蛋白,亲水性的平均值(GRAVY)为-0.169,预测该蛋白质为亲水性蛋白,不具有跨膜结构域。实时荧光定量PCR结果显示,RcDAPDC基因在60℃高温处理1 h时表达量最高;RcDAPDC基因在干旱和复水过程中呈现差异性表达,推测RcDAPDC不仅可能参与砂藓的抗高温胁迫反应,而且还可能参与砂藓的干旱胁迫响应和复水过程。本研究对进一步研究砂藓RcDAPDC基因的生物学功能提供了一定的理论基础和研究方向。

砂藓RcRab基因响应非生物胁迫的表达分析及载体构建

为了研究砂藓(Racomitrium canescens)中的小G结合蛋白基因RcRab在非生物胁迫下发挥的作用,以砂藓为材料,利用实时荧光定量PCR,对砂藓的RcRab基因的表达情况进行了分析。结果表明,RcRab在不同的逆境胁迫处理下的表达不相同;与对照相比,RcRab在干旱和高温处理下表达量均升高,在低温和水渍处理下表达量先下降再上升,说明RcRab基因在多重胁迫下发挥重要的调控作用。将RcRab基因成功构建到植物表达载体pRI101-AN上,为进一步研究其抗逆功能奠定基础。