基于Illumina Novaseq高通量测序技术分析番红花不同生长期根际土壤中放线菌群落结构与多样性研究

目的以新疆番红花Crocus sativus L.不同生长期的根际土壤为材料,研究土壤放线菌群落结构与多样性。方法提取番红花不同生长时期的根际土壤放线菌总DNA,应用Illumina Novaseq高通量测序平台进行测序分析。结果对番红花3个生长期(生长初期S1、生长中期S2、生长后期S3)的3组样本进行高通量测序,共获得1686个分类单元(OTUs),包含15个放线菌门;并对检测到的放线菌属级相对丰度前20的放线菌属进行了分析;在放线菌门水平,番红花3个生长期共有优势放线菌群落为放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形杆菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes);在放线菌属水平,番红花3个生长期共有优势放线菌群落为红球菌属(Rhodococcus)、芽球菌属(Blastococcus)、弗兰克氏菌属(Frankia)、农球菌属(Agrococcus)、微杆菌属(Microbacterium)和康奈斯氏杆菌属(Conexibacter);不同之处,番红花S1还有诺卡氏菌属(Nocardioides)、分枝菌酸杆形菌属(Mycolicibacterium)和暂定微丝菌属(Candidatus Microthrix)优势群落,S2有节杆菌属(Arthrobacter)、分枝菌酸杆形菌属(Mycolicibacterium)和威廉姆氏菌属(Williamsia),S3有诺卡氏菌属(Nocardioides)、土壤红杆菌属(Solirubrobacter)、贫养杆菌属(Modestobacter)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、糖霉菌属(Glycomyces)和短状杆菌属(Brachybacterium)。Alpha多样性和Beta多样性分析结果表明,不同生长期的番红花根际土壤中放线菌群落结构与多样性存在差异,其多样性随番红花的生长呈现不断上升的趋势。结论该研究在番红花根际土壤中检测到对病原微生物具有拮抗作用、可合成次级代谢产物、相对丰度较大的根际促生菌和稀有放线菌资源,可为进一步研究其对番红花的促生功能、抗逆性作用和在根际微环境中对病原菌、病毒等有害微生物的拮抗机制,以及根际微生物间相互作用对番红花种球品质影响的研究奠定坚实基础。

祁连山高山植物根际土放线菌生物多样性

从祁连山老虎沟不同海拔位点的15种植物根际土中培养得到78株特异表型放线菌,并结合菌体形态、生理代谢特征、抗菌活性及16S rDNA序列对其生理及系统发育多样性进行了研究。结果表明,分离菌株分属于链霉菌属(Streptomyces spp.)(73株)、诺卡氏菌属(Nocardia spp.)(4株),另有1株与GenBank中同源性最高的菌株Micromonospora saelicesensis相似性达92%,为1潜在新种。链霉菌属为主要类群,占分离菌株的93.6%,该属菌株在5个海拔位点的15种植物根际土中均有分布,但存在海拔位点、植物种类的差异性和特异性;诺卡氏菌属的菌株仅见于海拔2200 m的猪毛菜、海拔2800 m的钉柱萎陵菜和3800 m处的甘肃蚤缀根际土中;1潜在新种分离自海拔2200 m处的沙生针茅根际土。次级代谢物产生和拮抗性筛选研究结果表明:H2O2酶、脂酶2(Tween-40)、脲酶、蛋白酶、脂酶3(Tween-80)、淀粉酶、H2S、脂酶1(Tween-20)、可溶性色素及有机酸这10类次级代谢物产生菌分别占供试菌株的89.7%、82.1%、70.5%、62.8%、53.8%、52.6%、48.7%、44.9%、32.1%和17.9%,其中,淀粉酶、脂酶1、色素和有机酸仅由链霉菌产生;有29株放线菌对参试人类病原菌具有抑制作用,占供试菌株的37.2%,分布于5个海拔位点的12种植物根际土,其中,从药用植物甘肃黄芪和四裂红景天根际土中分离到的抗性菌株占拮抗性放线菌总数的60%。研究表明,高山地区植物根际土放线菌资源丰富,菌株生理功能多样,是新放线菌种和生物活性物质的重要资源库。

用PCR-DGGE研究长期施用无机肥对种稻红壤微生物群落多样性的影响

以中国科学院红壤生态试验站的发育于第四纪红粘土的种稻红壤为研究对象，采用PCR-DGGE方法研究了长期施用无机肥对土壤微生物群落多样性的影响。在种植双季稻、连续13a施用不同无机肥后，土壤中细菌、古菌、放线菌和真菌的群落结构发生了较大的变化。未种植水稻的土壤与种稻土壤间四类微生物SSUrDNADGGE带谱相似性只有33％～66％。施磷肥的处理NP、PK、NPK之间微生物群落结构相似性较高，4类微生物的SSUrDNADGGE带谱相似性高达75％～81％。施氮钾肥（NK）、不施肥（CK）处理与施磷肥处理间土壤微生物群落结构的差异较大，其四类微生物的SSUrDNADGGE带谱相似性分别为69％～77％、55％～77％。研究的目的是深入地了解土壤中微生物群落的多样性，为科学施肥、合理利用土壤、保护微生物多样性和实现农业生态系统的可持续发展提供科学依据。

河西走廊石羊河下游地区盐碱土中放线菌多样性——以民勤县为例

为了解甘肃省河西走廊石羊河流域地区盐碱土中放线菌种群结构及多样性,采用非培养法对河西走廊石羊河下游流域的3种不同类型土样(原生盐碱土、次生盐碱土和农田土)的总DNA进行提取,用放线菌特异性引物对16S r RNA基因进行扩增,构建放线菌16S r RNA克隆文库.用HaeⅢ和HhaⅠ两种限制性内切酶对阳性克隆子进行16S r DNA扩增片段限制性内切酶分析(Amplifed Ribosomal DNA Restriction Analysis,ARDRA),提取酶切带型不同的菌液进行测序,构建其系统发育树并进行多样性指数分析.结果显示:原生盐碱土克隆文库中90个阳性克隆分归于20个OTUs,分属于微球菌科(Micrococcaceae)、中村氏菌科(Nakamurellaceae)、类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)和未知类群;次生盐碱土克隆文库中98个阳性克隆分归于32个OTUs,分属于纤维素单胞菌科(Cellulomonadaceae)、微球菌科(Micrococcaceae)、地嗜皮菌科(Geodermatophilaceae)、类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)、小单孢菌科(Micromonosporaceae)、伪诺卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)、链孢囊菌科(Streptosporangiaceae)、高温单孢菌科(Thermomonosporaceae)、动孢囊菌科(Kineosporiaceae)、糖霉菌科(Glycomycetaceae)和未知类群;农田土克隆文库中98个阳性克隆分归于10个OTUs,分属于微球菌科(Micrococcaceae)、博戈里亚湖菌科(Bogoriellaceae)、地嗜皮菌科(Geodermatophilaceae)、中村氏菌科(Nakamurellaceae)、类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)和未知类群.其中,微球菌亚目(Micrococcineae)是3种不同类型土壤中的优势类群.多样性指数和稀释性曲线分析结果显示,3种不同类型土壤中放线菌多样性为次生盐碱土>原生盐碱土>农田土.

蚯蚓吞食过程中土壤理化性质与放线菌多样性的变化特征

为探明土壤理化性质与放线菌多样性在蚯蚓吞食过程中的变化特征,将蚯蚓生活土壤、肠道内容物和蚓粪视作蚯蚓吞食前、中、后阶段的3种特殊生境土壤,采用纯培养法分离纯化3阶段中的放线菌;克隆文库法分析3阶段中的放线菌多样性;国标法测定吞食前、中、后土壤的基本理化性质;并利用主成分分析与相关性分析法分析土壤理化性质与放线菌多样性的相关性。结果显示:从生活土壤、肠道内容物和蚓粪中分别获得27株、15株和17株放线菌,形态、培养特征及16S rDNA序列鉴定生活土壤放线菌分为链霉菌属、拟诺卡氏菌属、束丝放线菌属,肠道内容物和蚓粪放线菌均属链霉菌属;放线菌多样性从生活土壤、蚓粪、肠道内容物依次递减。生活土壤文库含40个OTUs,分为11科,未知菌占24%,类诺卡氏菌科是优势菌群;肠道内容物文库含20个OTUs,分为6科,未知菌占3.3%,微杆菌科是优势菌群;蚓粪文库含30个OTUs,分为6科,未知菌占11.7%,链霉菌科是优势菌群。3种土壤全磷含量无显著差异,生活土壤其余理化含量均最低,肠道内容物速效氮含量最高,蚓粪的有机质、全氮、钾及有效磷、钾含量最高。主成分分析和相关性分析显示:蚯蚓吞食过程中,土壤有效磷、全氮、全钾、速效钾和有机质含量对放线菌多样性影响较大,其中全氮、有效磷与放线菌多样性显著负相关,相关系数分别为-0.998、-1,从而为明确蚯蚓、土壤与放线菌的相互关系提供了理论依据。

石油污染土壤非培养放线菌多样性分析

采取大港油田石油污染土壤,分析其石油污染状况。利用放线菌传统培养分离技术、荧光PCR检测技术以及放线菌16S rDNA克隆文库分析技术,探讨了石油污染土壤放线菌群落丰度及其结构特征。研究结果表明:石油污染导致了土壤放线菌群落丰度降低,而荧光PCR检测较传统的培养分离技术,更能准确、真实地反映土壤放线菌群落丰度。同时,放线菌16S rDNA克隆文库结果显示油污土壤非培养放线菌主要包括链霉菌属(Streptomyces)、分支杆菌属(Mycobacterium)、类诺卡氏菌属(Nocardioides)、微杆菌属(Microbacterium)、放线菌属(Actinomyces)、酸微菌属(Acidimicrobium)、地嗜皮菌属(Geodermatophilus)和乔治菌属(Georgenia)等8个类属,其主要种属与目前报道的具有石油烃降解功能的放线菌类群较为一致。该研究为从非培养放线菌角度修复石油污染土壤提供了重要的理论基础。

小麦黄花叶病毒病不同发生度土壤的微生物多样性研究

2016年于山东省临沂市、枣庄市、济宁市采集3组小麦黄花叶病毒病发生严重度不同地块的土壤,采用平板稀释分离法分别分离其中的真菌、细菌和放线菌,统计土壤微生物总量及3种可培养微生物的种类和数量,研究其与小麦病毒病发生程度的关系。结果表明,同一地块中细菌数量占绝对优势,其次为放线菌,真菌最少;但是分离得到的可培养真菌的种类和数量最多,其次为细菌,放线菌数量最少;并且发病严重地块的土壤微生物总量均高于轻病地块,其中发病严重地块的真菌数量和种类增加的最为显著,其次为细菌,放线菌基本无变化。

河西走廊盐碱土中未培养放线菌多样性研究

用放线菌特异性引物扩增16SrRNA基因片段构建基因的克隆文库,研究河西走廊盐碱土壤中放线菌的种群结构及多样性.结果显示,164个阳性克隆分归于50个OTUs,系统发育分析得出这50个OTUs分属于放线菌目的7个亚目,分别是丙酸杆菌亚目、假诺卡氏亚目、棒杆菌亚目、微单孢菌亚目、链霉菌亚目、微球菌亚目和链孢囊菌亚目,其中微球菌亚目为克隆文库中的优势种群,占总克隆数的37.2%.还有一部分克隆属于放线菌门的未知种群,占总克隆数的14.01%.未趋向于平缓的稀释性曲线表明该区域的盐碱土壤中放线菌多样性较高.

河北及云南部分地区土壤放线菌物种多样性分析

从河北及云南的不同地区及植被下采集土样。用 4种培养基分离放线菌 ,并对放线菌的数量、组成、形态、细胞壁化学组分等进行了研究 ,将其归属。对两地土壤放线菌物种多样性、不同植被土壤中的放线菌分布进行了比较。其结果表明 :两省放线菌分布具有相似的的规律 ,分别分离到 7-8个属的放线菌 ,但各属比例具有一定的差异 ;放线菌多样性与植被类型具有密切的相关性 ,在所调查的 9种植被类型土壤中 ,季雨林土壤中具有最高的放线菌物种多样性。

黔东北喀斯特土壤放线菌多样性研究

为探明贵州喀斯特区域土壤放线菌分布特点及其多样性特征,从黔东北区域采取土样61份,采用平板稀释法,利用3种培养基分离放线菌,通过形态特征、分子鉴定及16S rDNA系统发育分析鉴定放线菌,并对部分菌株进行抗菌活性测试。结果从土样中共分离出80株放线菌株,经初步鉴定排重后,选取22株进行分子鉴定,经16S rDNA序列分析,分属于链霉菌属(17株)、诺卡氏菌属(2株)、小单孢菌属(2株)、高温单孢菌属(1株),链霉菌属放线菌占了77%。并有5株放线菌分别对大肠杆菌(3株),金黄色葡萄球菌(3株),青霉菌(2株)具有抑菌性。本研究初步揭示了黔东北喀斯特土壤放线菌多样性和丰富度,为贵州喀斯特土壤放线菌分布和多样性研究奠定了基础。

耕作土壤中蚯蚓肠道可培养放线菌的多样性研究

从同一地区耕作土和森林土的蚯蚓肠道内分离得到15株和8株放线菌,分别进行形态、培养特征、16S rDNA序列鉴定和系统发育分析.对比2种土壤的理化性质和肠道放线菌的多样性发现,土壤N、P、K富集化导致放线菌数量的增加,重金属含量增高则使放线菌多样性降低.2种环境下,链霉菌属始终是肠道放线菌中的优势菌群.

四川攀枝花地区印度块菌菌根根际土壤内可培养放线菌功能多样性

以四川攀枝花地区印度块菌菌根根际土壤为对象,利用4种放线菌分离培养基筛选其中的放线菌,采用基于16S rRNA基因的PCR-RFLP方法结合传统的形态学观察进行鉴定。通过测定各分离菌株摇瓶培养发酵液中酶活性或代谢产物获取各菌株降解碳水化合物以及产促生剂的能力,采用平板对峙法测定各菌株抗病原真菌活性。结果共分离得到125株放线菌,经形态学观察去重复得到57株(W1-W57),经多样性分析将其归于3个属的23个种,其中以链霉菌属最多(91.3%),功能分析表明:有23株、17株、15株和18株放线菌能分别降解1,3-β-葡聚糖、几丁质、纤维素和果胶,其中有47.8%、26.1%和26.1%的菌株能同时降解4、3和2类碳水化合物;有19株、3株和2株放线菌分别能产含铁载体、IAA和ACC脱氨酶,其中有21.7%、56.6%和21.7%的菌株能分别产生3、2和1种根际促生剂;有10株放线菌表现出对不止一种病源真菌的拮抗能力,其中菌株W2和W19对4种病源真菌同时具有拮抗活性,且这2株菌对4种病源真菌抑菌能力比其他菌强;同时获得了包括W2、W3、W17、W19、W20、W34、W36和W54等在内的多功能高活性菌株,该研究表明四川攀枝花地区印度块菌菌根土壤内含丰富的多功能放线菌。所获结果可为我国印度块菌人工种植新技术的开发提供新思路。

喀斯特地貌高海拔自然保护区土壤放线菌多样性研究

为了揭示贵州喀斯特地貌高海拔读取土壤放线菌多样性,通过在贵州喀斯特地貌高海拔自然保护区采集土壤,对放线菌进行分离、提纯和培养;并对已获得的放线菌菌株的16Sr DNA、18Sr DNA、ITS以及26S通过引物进型PCR扩增,扩增后行进DNA序列测定以及菌株鉴定。结果表明:该区域土壤中包含了1株为疑似新型放线菌、1株为链孢囊菌属,为较稀有菌属。4株为拟诺卡氏菌属,11株为链霉菌属、为常见菌属。此次研究初步揭示了贵州喀斯特地貌高海拔地区土壤中放线菌多样性。

山西太子滩温泉土壤放线菌多样性及功能基因筛选的研究

收集太子滩温泉周围的4份土壤样品,用6种分离培养基对土壤中的细菌进行分离,再通过分析16SrRNA基因序列对分离菌株进行初步分类鉴定。采用PCR技术和琼脂糖凝胶电泳检测放线菌是否具有抗生素生物合成基因NRPS、PKSⅠ、PKSⅡ。从4个土壤样品中共分离出104株放线菌,主要分布于放线菌域的3目5科12属,包括链霉菌属(Streptomyces)、微杆菌属(Microbacterium)、壤霉菌属(Agromyces)等;菌株M6W4-7-2与发表菌株Streptomyces ruberNRRC 14600^T的16SrRNA基因序列相似性为98.58%,可能为链霉菌科链霉菌属的潜在新种。太子滩温泉附近土壤有着丰厚的放线菌资源,且放线菌的抗生素合成基因的阳性率较高,具备从中发现放线菌新物种及新抗生素的潜力。

柽柳根际土壤放线菌的分离及拮抗活性筛选

【目的】分析柽柳根际土壤放线菌物种多样性,研究其抗菌活性,为新疆主要农牧业病害的防控奠定菌种基础。【方法】选择新疆南疆地区10种柽柳根际土壤的放线菌资源,采用四种培养基,通过菌株16SrDNA测序,采用平板对峙法筛选抗菌活性。【结果】分离出294株菌株,鉴定的150株,分属于7个纲12个目16科24个属,另有9个潜在新种,以金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、解淀粉欧文氏菌、伤寒沙门氏菌、白色念珠菌、链格孢菌、棉花黄萎病菌、棉花枯萎病菌为靶标菌。【结论】筛选出68株活性放线菌。柽柳根际土壤放线菌的分离丰富了微生物资源及菌种的储备。

福建武夷山地区土壤可培养放线菌多样性分析

采用培养法连续两年对福建武夷山地区24个定位观测点土壤放线菌进行分离培养和纯化,并应用16S rRNA基因进行物种鉴定及其多样性分析.结果表明:(1)分离获得的109株放线菌可包含了5个目、6个科、10个属,10个属分别为链霉菌属(Streptomyces)、节杆菌属(Arthrobacter)、假节杆菌属(Pseudarthrobacter)、类节杆菌属(Paenarthrobacter)、北里孢菌属(Kitsatospora)、小单孢菌属(Micromonospora)、中国单胞菌属(Sinomonas)、拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、类诺卡氏菌属(Nocardiodies)和野野村菌属(Nonomuraea).(2)分离获得链霉菌属菌株最多(79株),有42个种,是武夷山地区土壤可培养放线菌的优势菌属;其次是北里孢菌属(17株),有5个种.慧苑坑土壤分离获得的放线菌物种最多(9种),而麻粟样地海拔1280 m处只分离到1种.(3)黄溪洲海拔1200 m和鬼洞处土壤中放线菌群落的Simpson和Shannon指数均为最高,茶洞的Simpson和Shannon指数均最低.

胡杨根际土壤来源放线菌分离及其拮抗活性筛选

根际土壤微生物在抵御病原微生物的入侵、提高植物的抗病能力等方面具有重要作用。胡杨作为沙漠地区的常见植物,其根际土壤微生物种类丰富且具有很高的研究价值。为了探究根际土壤微生物的作用,丰富和完善极端环境拮抗活性微生物菌种库,本研究基于选择培养基筛选法分析了新疆南疆地区10种不同地区的胡杨根际土壤的放线菌资源多样性,并采用细菌的16S rDNA测序和平板对峙法筛选。结果表明:经过分离与筛选,共获得269株菌株,选择生长状态较好的78株进行分析鉴定,分别为5个属,其中链霉菌属(Streptomyces)为优势类群。利用平板对峙法和琼脂扩散法以白色念珠菌(Candida albicans)、细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylohydrolylic)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)为靶标菌,对分离出来的菌株进行拮抗活性检测,筛选出32株活性放线菌。这些结果丰富了微生物资源并为新疆主要农牧业病害的防控提供了菌种基础。

南方红豆杉内生及根际放线菌多样性及其生物活性

【目的】研究药用植物南方红豆杉内生及根际土壤放线菌的多样性及其抑菌、抗肿瘤等重要生物活性并获得一些具有强抑制植物病原真菌以及抗肿瘤等重要生物活性的菌株。【方法】选择7种培养基从南方红豆杉及其根际土壤中分离放线菌,对链霉菌进行形态学分类,去重复后对其进行抑制植物病原真菌以及抗肿瘤活性的筛选并对高活性菌株进行初步鉴定。对部分菌株进行16S rRNA基因测序分析研究其多样性。【结果】研究共分离得到277株放线菌,经去重复后剩余111株放线菌,可归类到6个亚目、7个科、8个属。其中链霉菌可分为10个类群。生物活性研究结果显示:30.9%的菌株具有抑制植物病原真菌活性,其中6株放线菌对多种植物病原真菌显示了强的抑菌活性。分别有44.1%和33.3%的菌株对胃癌肿瘤细胞株SGC-7901和肺癌肿瘤细胞株NCI-H460的抑制率在40%以上。【结论】药用植物南方红豆杉及其根际土壤蕴含种类丰富的放线菌资源,具有良好的生物学活性。菌株KLBMP 2170具有显著的抑菌以及抗肿瘤活性,值得我们去进一步研究。

辐射污染区土壤中放线菌的分离及多样性

从辐射污染区采集42份土样,分别采用6种分离培养基进行放线菌的分离,共获得152株放线菌。经形态、核糖体DNA扩增片段限制性内切酶(Amplifed ribosomal DNA restriction analysis,ARDRA)分析比较,选取其中的60株进行16S rRNA基因测序。通过序列比对、聚类分析,60株菌分布在放线菌纲中的12个属,链霉菌属占大多数,有大量稀有放线菌,这表明辐射污染区具有较丰富的放线菌属种多样性。

四川盐边植烟土壤放线菌的遗传多样性及抗菌活性

从四川省盐边县代表性烟草种植区域的植烟土壤样品中分离出52株放线菌菌株,采用16S rDNA限制性片段长度多态性(16S rDNA-RFLP)和16S rDNA序列分析研究了其遗传多样性及系统发育地位,并初步探索了其抗菌活性.16S rDNA-RFLP分析结果表明,在非加权组平均法(UPGMA)聚类图中,所有菌株在75%的相似水平上聚为一类,而在88%的相似水平上分为8个遗传类型.在主成分分析聚类图中,供试菌株可分为5个类群,揭示了植烟土壤放线菌菌株具有一定的遗传多样性.代表菌株系统发育分析显示,供试菌株均属于链霉菌属(Streptomyces),链霉菌是植烟土壤中的绝对优势放线菌.初筛结果显示,共有13株菌株表现出了一定的抗菌活性,而在复筛中仅有3株表现较好.根据初筛和复筛结果选择菌株SAUAS3-2进行玉米盆栽试验,结果表明,该菌株具有一定抗菌活性的同时还具有促生作用.本研究揭示了盐边县植烟土壤具有丰富的放线菌资源.