Raf蛋白激酶与肿瘤关系的研究进展

Raf蛋白激酶是由Raf基因编码的蛋白产物,Raf激活的机制可能是多层次、多种因素相互作用的结果。被激活的Raf蛋白的过表达与细胞生长、细胞周期停滞甚至与凋亡有关。Raf突变在多种恶性肿瘤中被探测到,因此是肿瘤介入治疗的重要靶点。Raf的异常表达也影响着肿瘤细胞耐药性的产生。一些Raf阻断剂正在临床试验中,因特定Raf基因过表达而发生的恶性肿瘤很可能会对raf蛋白的阻断剂敏感。RNAi干扰技术在抗肿瘤治疗中的广泛应用为我们寻找能更有效降低Raf活性的方法提供了新的途径。

Raf蛋白激酶与细胞信号传导

Ras蛋白信号通路的信号传递蛋白Raf-1蛋白激酶,不仅在该通路中起重要作用,也能整合PKC的信号。Raf-1蛋白激酶活化后参与细胞增殖和转化、细胞编程死亡、发育和分化,以及细胞对不良因素的应激反应,是细胞内重要的、进化上十分保守的信号分子。

Raf蛋白激酶在前列腺癌脏器和骨转移中的研究进展

前列腺癌是威胁男性健康的常见恶性肿瘤,转移是影响前列腺癌预后的重要因素。据美国统计,每年因转移性前列腺癌而死亡的人数多达3万,约90%患者最终发展为骨转移,还可以转移到肺、淋巴结、肝脏、肾上腺等脏器。一线治疗方案主要为雄激素剥夺治疗（androgen deprive therapy,ADT）,但大部分患者经过14-30个月的平均缓解期后都会进展至去势抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer,CRPC）阶段.

Raf蛋白激酶与大肠癌的关系研究进展

细胞表面的外来刺激可引起一系列胞内信号，对促进细胞增值、分化和凋亡起重要的生理作用。而信号转导途径中的某个环节异常，可引起细胞异常增殖和细胞外基质过多集聚，这是肠道炎症和肿瘤的病理基础。促分裂原蛋白活化激酶（mitogen—activated protein kinases，MAPKs）是连接细胞膜表面受体和基因表达的重要信号调节酶，已发现哺乳动物肠道组织细胞内至少存在4种MAPKs，即ERK／MAPK（或称p44／42MAPK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK1／JNK2），p38MAPK（α，β）和ERK5／BMK。

乙肝病毒截短型表面抗原中蛋白与X蛋白对肾小管上皮细胞核转录因子的影响

目的:目的研究167例乙肝病毒截短型表面抗原中蛋白(C-terminally truncated middle size surface proteins,MHBst167)和X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)对肾小管上皮细胞核转录因子κB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)活化的影响及其相关机制探讨。方法:肾小管上皮细胞系(HK-2)转染mhbst167或(和)hbx后,蛋白印迹法检测NF-κB核易位及其抑制蛋白(inhibitor of nuclear factor-kappa B,IκBα)磷酸化水平的变化,凝胶电泳迁移率和双萤光素酶报告基因分析进一步检测NF-κB活性;通过对蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)活性和细胞外调节激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)磷酸化水平检测探讨NF-κB活化的机制。结果:HK-2细胞转染mhbst167或(和)hbx基因后,NF-κB核易位、磷酸化IκBα、κB结合活性及κB基因转录均增加(P<0.05);且PKC激酶活性和磷酸化ERK水平也增加(P<0.05),而Raf蛋白均无表达。结论:在肾小管上皮细胞中,MHBst167/HBx可能通过PKC/ERK通路(非Raf依赖性)活化NF-κB。

基于RAS/RAF/MEK/ERK信号通路探讨黑逍遥散干预AD模型大鼠氧化应激的作用机制

目的:探讨黑逍遥散调控RAS蛋白(RAS)/RAF激酶(RAF)/有丝分裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路干预阿尔茨海默病(AD)大鼠氧化应激的作用及其机制。方法:4月龄SPF级Wistar雄性大鼠100只,随机选取10只作为空白组,10只作为假手术组(双侧海马注射生理盐水1μL),其余80只双侧海马注射β淀粉样蛋白1-42(Aβ_(1-42))溶液1μL复制AD模型。遴选造模合格大鼠50只,随机分为模型组、盐酸多奈哌齐组(0.5 mg·kg^(-1))及黑逍遥散高、中、低剂量组(15.30、7.65、3.82 g·kg^(-1))。连续灌胃42 d,每天1次。灌胃结束后,Morris水迷宫实验测试大鼠学习记忆能力,尼式染色法检测海马CA3区神经元病理结构改变,免疫荧光观察Aβ沉积和tau蛋白磷酸化水平,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测海马组织RAS、RAF、磷酸化(p)-RAF、MEK、p-MEK、ERK、p-ERK蛋白表达,生化法检测海马组织活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平。结果:与假手术组比较,模型组大鼠第5天逃避潜伏期显著延长(P<0.01),目标象限游泳距离显著缩短(P<0.01),尼氏小体数量减少,染色不均;Aβ、p-tau荧光强度显著增强(P<0.01),海马组织中RAS、p-RAF、p-MEK、p-ERK蛋白表达显著增高(P<0.01),ROS和MDA含量显著增高(P<0.01),SOD活性显著降低(P<0.01);与模型组比较,盐酸多奈哌齐组和黑逍遥散高、中、低剂量组大鼠第5天逃避潜伏期显著缩短(P<0.01),目标象限游泳距离显著增加(P<0.01);尼氏染色显示神经元排列整齐,细胞形态、结构完整,尼氏小体清晰可见,盐酸多奈哌齐组和黑逍遥散高、中、低剂量组Aβ、p-tau荧光强度显著下调(P<0.01),RAS、p-RAF、p-MEK、p-ERK蛋白表达明显增高(P<0.05,P<0.01),ROS、MDA含量显著降低(P<0.01),SOD活性显著增高(P<0.01)。结论:黑逍遥散可能通过RAS/RAF/MEK/ERK信号通路干预氧化应激,降低Aβ和p-tau水平,抑制海马神经元损伤,从而改善学习记忆能力。

夏枯草多糖对小鼠Graves病的改善作用及其机制

目的观察夏枯草多糖对小鼠Graves病的改善作用,并分析其可能机制。方法用稳定表达促甲状腺激素受体A亚单位的重组腺病毒Ad-TSHR-289免疫BALB/c雌鼠建立Graves病模型。将30只造模成功小鼠随机为模型组、夏枯草多糖组、甲巯咪唑组,各10只,另取10只正常雌鼠作为正常对照组。夏枯草多糖组与甲巯咪唑组分别灌胃夏枯草多糖和甲巯咪唑,其他两组给予同体积生理盐水灌胃。5周后,观察小鼠的一般情况,观察小鼠甲状腺组织形态学变化;测定血清四碘甲状腺原氨酸(T 4)、三碘甲状腺素原氨酸(T 3)、促甲状腺激素受体抗体(TRAb)、干扰素γ、白细胞介素(IL)-6、IL-17和转化生长因子β1(TGF-β1)水平;检测甲状腺组织中Raf、丝裂原活化蛋白激酶的激酶(MEK)1/2、细胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2以及磷酸化Raf、MEK1/2、ERK1/2蛋白的表达水平。结果(1)模型组小鼠出现易动、烦躁、互相攻击、脱毛的现象,夏枯草多糖组与甲巯咪唑组上述异常现象有所减少,且夏枯草多糖组症状改善优于甲巯咪唑组。(2)模型组小鼠甲状腺组织出现增生性改变、滤泡增大、间质血管浸润,夏枯草多糖组与甲巯咪唑组小鼠甲状腺组织结构明显恢复,夏枯草多糖组改善优于甲巯咪唑组。(3)其他3组的血清TRAb、T 4、T 3、干扰素γ、IL-6、IL-17、TGF-β1水平,以及甲状腺组织磷酸化Raf、MEK1/2、ERK1/2蛋白的表达水平均高于对照组,而模型组、甲巯咪唑组、夏枯草多糖组以上指标水平均依次降低(均P<0.05)。结论夏枯草多糖能改善Graves病小鼠的症状及甲状腺功能,这或与其抑制Raf、MEK1/2及ERK1/2的磷酸化,调控Ras/Raf/有丝分裂原活化蛋白激酶/ERK信号通路,以及下调细胞因子干扰素γ、IL-6、IL-17和TGF-β1的表达有关。

巨噬细胞过表达miR-125b促进其凋亡

目的探讨肺结核患儿外周血单个核细胞(PBMC)中miR-125b和靶基因Raf1原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(RAF1)表达;观察miR-125b对巨噬细胞凋亡和细胞活力的调节。方法收集和分离肺结核患儿和健康儿童的PBMC,采用荧光定量PCR检测miR-125b和RAF1的mRNA表达水平,Western blot法检测RAF1的蛋白水平。THP-1巨噬细胞分别转染miR-125b模拟物(miR-125b mimic)、阴性对照模拟物(NC-mimic)、miR-125b抑制物(miR-125b inhibitor)以及阴性对照抑制物(NC-inhibitor),共培养48 h;利用Western blot法检测THP-1巨噬细胞中RAF1表达,异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶(annexinⅤ-FITC/PI)双染色结合流式细胞术检测细胞凋亡,CCK-8法检测细胞活力。结果在结核患儿PBMC的miR-125b表达下调,RAF1的mRNA和蛋白水平都升高。在THP-1巨噬细胞中过表达miR-125b时,RAF1表达下调,促进巨噬细胞凋亡,降低细胞活力;在THP-1巨噬细胞中miR-125b表达被抑制时,RAF1表达升高,抑制巨噬细胞凋亡,提高细胞活力。结论结核患儿PBMC中miR-125b水平降低,上调THP-1巨噬细胞miR-125b水平促进巨噬细胞凋亡并抑制细胞活力。

基于Raf/MEK/ERK信号通路及ROS水平研究石蒜碱调控肝癌HepG-2细胞凋亡的机制

目的:探讨石蒜碱诱导肝癌HepG-2细胞凋亡的的机制。方法:裸鼠成瘤实验检测石蒜碱对体内肝癌细胞增殖能力的影响;MTT法分析石蒜碱对肝癌HepG-2细胞增殖的抑制作用;将25、50及100μmol/L石蒜碱作用于HepG-2细胞48 h,倒置荧光显微镜观察细胞形态;流式细胞仪检测细胞凋亡;激光共聚焦观察活性氧荧光强度;测定SOD的活性,MDA的水平;Western blot法检测细胞Raf蛋白激酶(Raf)、p-Raf、丝裂原活化蛋白激酶(MEK)、p-MEK、细胞外调节蛋白激酶(ERK2)、p-ERK2、半胱天冬酶3(cleaved Caspase-3)、cleaved Caspase-9蛋白表达水平。结果:裸鼠成瘤实验显示石蒜碱对肝癌HepG-2细胞裸鼠皮下移植瘤生长具有抑制作用;MTT结果显示,石蒜碱对肝癌HepG-2细胞的增长具有抑制作用;Hoechest 33342染色和流式细胞仪检测,细胞凋亡率明显增加(P<0.05或P<0.01);与模型对照组比较,25、50、100μmol/L石蒜碱能增加ROS、MDA含量,降低SOD活性;上调凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9表达,50、100μmol/L的石蒜碱能降低HepG-2细胞中p-Raf/Raf、p-MEK/MEK、p-ERK2/ERK2比值(P<0.05或P<0.01)。结论:石蒜碱能抑制肝癌HepG-2细胞增殖,促进细胞凋亡,其机制可能和调控Ras/raf/MEK/ERK信号通路和ROS水平有关。

穗花杉双黄酮对鼻咽癌细胞恶性生物学行为的影响

目的研究穗花杉双黄酮(AF)调节Ras/Raf/促分裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路对鼻咽癌(NPC)细胞恶性生物学行为的影响。方法将NPC细胞株CNE-1随机分为对照组、低浓度AF组(AF-L组,50μmol·L^(-1)AF)、中浓度AF组(AF-M组,75μmol·L^(-1)AF)、高浓度AF组(AF-H组,125μmol·L^(-1)AF)和高浓度AF+Ras激活剂RASAL1组(AF-H+RASAL1组,125μmol·L^(-1)AF+2 ng·mL^(-1)RASAL1)。以噻唑蓝(MTT)实验检测细胞增殖能力;以划痕愈合实验检测细胞迁移能力;以Transwell实验检测细胞侵袭能力;以流式细胞术检测细胞凋亡率;以蛋白质印迹法检测细胞中Ras/Raf/MEK/ERK信号通路相关蛋白表达。结果对照组、AF-M组、AF-H组CNE-1细胞OD490值(48 h)为0.62±0.06、0.45±0.05、0.29±0.03;细胞划痕愈合率为(38.66±4.07)%、(23.14±2.20)%、(12.47±1.15)%;细胞侵袭数目为(137.59±10.25)、(103.42±8.49)、(76.38±7.96)个;Ras蛋白表达水平分别为0.84±0.08、0.59±0.06、0.34±0.03;Raf蛋白表达水平分别为0.79±0.08、0.53±0.05、0.24±0.02;MEK蛋白表达水平分别为0.87±0.09、0.64±0.06、0.28±0.03;ERK1/2磷酸化水平分别为0.75±0.08、0.50±0.05、0.21±0.02;细胞凋亡率分别为(4.25±0.63)%、(18.42±2.10)%、(35.28±2.26)%,以上指标,AF-M组、AF-H组与对照组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。RASAL1减弱了AF对NPC细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用,抑制了其凋亡。结论AF可能通过下调Ras/Raf/MEK/ERK信号通路抑制NPC细胞增殖、迁移和侵袭,促进其凋亡。