抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路对MPP+处理的SH-SY5Y细胞自噬、凋亡及PD特征蛋白表达的影响

目的探讨抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)处理的SH-SY5Y细胞自噬、凋亡及帕金森病(PD)特征蛋白α-突触核蛋白(α-syn)、酪氨酸羟化酶(TH)表达的影响。方法以MPP+、PI3K/Akt激活剂胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、PI3K/Akt抑制剂LY294002作用于人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,CCK-8检测细胞存活率;流式细胞术检测细胞凋亡率;吖啶橙(AO)染色检测自噬空泡;Western blot检测α-syn、TH、p62、微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)、p-mTOR、mTOR、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白水平。结果MPP+干预显著降低SH-SY5Y细胞存活率,且呈现剂量依赖性(P<0.05)。MPP+和IGF-1处理后SH-SY5Y细胞存活率降低,凋亡率增高(P<0.05);细胞中自噬空泡减少,LC3BⅡ/Ⅰ降低,p62蛋白水平增高(P<0.05);TH蛋白水平降低,α-syn蛋白水平增高(P<0.05);p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt与p-mTOR/mTOR增高(P<0.05)。LY294002对SH-SY5Y细胞的影响与MPP+和IGF-1相反,且LY294002可在一定程度上逆转MPP+对SH-SY5Y细胞的影响(P<0.05)。结论抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路可能对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞毒性具有保护作用。

巨噬细胞过表达miR-125b促进其凋亡

目的探讨肺结核患儿外周血单个核细胞(PBMC)中miR-125b和靶基因Raf1原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(RAF1)表达;观察miR-125b对巨噬细胞凋亡和细胞活力的调节。方法收集和分离肺结核患儿和健康儿童的PBMC,采用荧光定量PCR检测miR-125b和RAF1的mRNA表达水平,Western blot法检测RAF1的蛋白水平。THP-1巨噬细胞分别转染miR-125b模拟物(miR-125b mimic)、阴性对照模拟物(NC-mimic)、miR-125b抑制物(miR-125b inhibitor)以及阴性对照抑制物(NC-inhibitor),共培养48 h;利用Western blot法检测THP-1巨噬细胞中RAF1表达,异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶(annexinⅤ-FITC/PI)双染色结合流式细胞术检测细胞凋亡,CCK-8法检测细胞活力。结果在结核患儿PBMC的miR-125b表达下调,RAF1的mRNA和蛋白水平都升高。在THP-1巨噬细胞中过表达miR-125b时,RAF1表达下调,促进巨噬细胞凋亡,降低细胞活力;在THP-1巨噬细胞中miR-125b表达被抑制时,RAF1表达升高,抑制巨噬细胞凋亡,提高细胞活力。结论结核患儿PBMC中miR-125b水平降低,上调THP-1巨噬细胞miR-125b水平促进巨噬细胞凋亡并抑制细胞活力。

甲状腺乳头状癌特异性肿瘤标志物的临床应用

目的探讨细胞角蛋白19(CK19)、半乳糖凝集素3(Gal-3)、p53、拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ)、Ki-67、细胞周期蛋白D1(CCND1)、人骨髓内皮细胞标志物1(HBME-1)、B-Raf原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶V600E突变型(BRAF^(V600E))在甲状腺乳头状癌(PTC)病理诊断中的临床应用价值。方法选取100例PTC和40例甲状腺良性病变标本,采用免疫组织化学染色EnVision法检测CK19、Gal-3、p53、TopoⅡ、Ki-67、CCND1和HBME-1在组织中的表达情况,通过荧光PCR检测BRAF^(V600E)在组织中的表达情况。结果PTC组织中CK19、Gal-3、TopoⅡ、CCND1、HBME-1和BRAF^(V600E)阳性表达率[97.0%(97/100)、98.0%(98/100)、56.0%(56/100)、95.0%(95/100)、66.0%(66/100)、75.0%(75/100)]高于甲状腺良性组织[45.0%(18/40)、20.0%(8/40)、15.0%(6/40)、55.0%(22/40)、25.0%(10/40)、12.5%(5/40)],差异均有统计学意义(P均<0.01)。8种标志物单独用于PTC的诊断时,CK19、Gal-3的灵敏度最高(97.0%、98.0%),Gal-3的准确度最高(92.9%);3种标志物联合应用并以其中任意2种阳性作为阳性判断标准时,CK19、Gal-3、HBME-1组合检测PTC的准确度最高(96.4%),其次为BRAF^(V600E)、CK19、Gal-3组合(91.4%)。结论CK19、Gal-3、TopoⅡ、CCND1、HBME-1、BRAF^(V600E)是诊断PTC的重要标志物,这些标志物联合应用有助于对形态不典型PTC与甲状腺良性病变进行鉴别。

Pim-1在肿瘤及相关信号通路中的作用

原癌基因蛋白质c—pim-1（Pim-1）在肿瘤组织中常表达增高且与肿瘤分期、预后密切相关。研究表明，Pim-1不仅参与调控细胞增殖和凋亡，在肿瘤转移过程中也发挥重要作用。多个信号传导通路可以调控Pim-1表达与活化，同时Pim-1也可影响通路中多个重要因子，其在肿瘤发生发展中作用十分广泛，已成为肿瘤治疗的潜在靶点。

Akt／mTOR在高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化中的表达及对核心结合因子的调节

目的观察蛋白激酶B／哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Akt/mTOR）在高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞（VSMC）钙化模型中的表达及其对核心结合因子α1（Cbfα1）表达的调节。方法体外培养的大鼠VSMC，分为正常磷组（1．3mmol/L）和高磷组（2．6mmol／L），培养7d后，观察细胞形态及茜素红染色细胞钙盐沉积，实时定量PCR检测Cbfα1、骨桥蛋白（OPN）mRNA水平，Western印迹检测磷酸化Akt（p-Akt）（ser473）、磷酸化mTOR（P-mTOR）（S2448）、Cbfα1和OPN蛋白的表达。检测到Akt、mTOR活化表达后，给予不同浓度的渥曼青霉素（5、10、30、50和100nmol/L）和雷帕霉素（1、10和100ng／m1）干预24、48h后，检测Cbfα1、OPN、P-Akt和P-mTOR基因和蛋白表达，7d后观察VSMC钙盐沉积变化。结果VSMC高磷干预7d后，与正常磷组相比，高磷组钙盐沉积明显，cbfal、OPNmRNA表达增高（均P〈0．05），p-Akt、P-mTOR、Cbfα1和OPN蛋白表达增高（均P〈0．05）。渥曼青霉素、雷帕霉素干预24h后，相对于高磷组，高磷＋渥曼青霉素30、50、100nmol/L组cbfal、OPNmRNA表达明显下调（均P〈0．05）；高磷＋雷帕霉素1、10和100ng／ml组Cbfα1、OPNmRNA表达下调（均P〈0．05）。渥曼青霉素、雷帕霉素干预48h后，与高磷组比较，高磷＋渥曼青霉素30、50、100nmol/L）组p-Akt、Cbfα1和OPN蛋白表达明显下调（均P〈0．05）；高磷＋雷帕霉素1、10、100ng/ml组，p-mTOR、CbfM和OPN蛋白表达呈剂量依赖性下调（均P〈0．05）。VSMC培养7d后，与高磷组相比，高磷＋渥曼青霉素和高磷＋雷帕霉素组钙盐沉积明显减轻。结论高磷可体外诱导大鼠VSMC钙化，Akt、mTOR参与了高磷诱导的大鼠VSMC钙化，并可能通过调控Cbfα1因子而起作用。