基于RAG1基因的中国近海13种石首鱼科鱼类系统进化关系

为探讨中国近海石首鱼类的系统进化关系,通过PCR扩增和序列测定,获得了石首鱼类9属13个种类的RAG1基因序列。对序列变异进行分析,基于Kimura双参数法计算属间和种间的遗传距离,并结合GenBank中的同源序列,以攀鲈为外群构建分子系统进化树。将所得的分子数据与形态学分类进行比较,推论如下:(1)中国近海石首鱼类分为两个类群。(2)叫姑鱼亚科与石首鱼亚科以极高的置信度(90%)聚类,并处于系统进化树的基部,支持了形态学上二者是原始种类的分类观点。(3)分子系统树显示黄姑鱼属比银姑鱼属更为原始,但二者在形态分类上归为一个亚科的观点有待进一步商榷。(4)支持尖头黄鳍牙与银牙置于同一牙亚科的不同属的观点。(5)支持了形态学上黄鱼亚科分化最晚的结论。

成人B细胞性急性淋巴细胞白血病RAG1表达特点及临床意义

目的:探讨成人B细胞性急性淋巴细胞白血病(B-ALL)中RAG1基因的表达特点及其临床意义。方法:应用实时定量PCR方法检测104例初发、22例复发成人B-ALL患者和30例正常对照者RAG1基因的表达,分析基因表达特点及其与临床和实验室参数之间的关系。结果:初发、复发成人B-ALL患者RAG1基因表达水平均高于正常对照者(3.94 vs 1.23)(P<0.001);(5.86 vs1.23)(P<0.01)。6例初发与复发患者成对标本分析显示,RAG1表达水平在疾病复发时显著高于初发(13.65 vs2.31)(P<0.01)。IKZF1基因外显子3-6缺失的异构体Ikaros isoform 6(Ik6)阳性患者RAG1基因表达水平显著高于Ik6阴性患者(5.30 vs2.11)(P<0.05)。RAG1高表达组LDH水平大于1 000 U/L患者的比例显著高于低表达组(42.2%vs20.5%)(P<0.05)。结论:RAG1基因表达上调在成人B-ALL发生发展中尤其在复发过程中可能起重要作用,其上调与IKZF1基因缺失相关。监测RAG1表达水平的变化可能为临床预测成人B-ALL患者疾病进展提供帮助。

红笛鲷重组激活基因rag1原核表达条件的优化及纯化

克隆编码红笛鲷(Lutjanus sanguineus)RAG1蛋白(recombination activating protein1)活性核心区的基因序列,并与pET-28a(+)载体连接,构建原核表达载体pET-28a-RAG1,将其转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,利用IPTG进行诱导表达。为提高融合蛋白的表达效率,运用传统的实验方法对诱导条件进行优化。SDS-PAGE分析表明,在37℃条件下,利用0.1 mmol/L IPTG诱导8 h后,RAG1重组融合蛋白的表达量最大,相对分子质量与预测值相符,该蛋白主要以包涵体形式高效表达,利用His Trap HP亲和柱使其得到进一步纯化;Western blot分析显示,该融合蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性结合,说明表达蛋白为目的蛋白。

基于Rag1基因序列的黄河高原鳅群体遗传结构分析

【目的】明确不同水域黄河高原鳅群体免疫基因多样性水平和遗传组成,为黄河高原鳅自然种质资源现状的评估、保护及合理开发提供理论依据。【方法】采集黄河中上游不同河段的黄河高原鳅自然群体[青海循化(XH)群体、青海大通(DT)群体及甘肃景泰(JT)群体]样品,基于重组激活基因(Rag1)序列对不同黄河高原鳅群体的遗传多样性水平和遗传组成差异进行研究。【结果】在不同黄河高原鳅群体的Rag1基因序列中共检测到8个单倍型(H1~H8),其中有5个单倍型(H1、H2、H3、H4和H6)在2个以上的群体间相互共享,尤其是单倍型H1、H4和H6在所有群体中均有分布。黄河高原鳅总群体的单倍型多态性为0.742,核苷酸多态性为0.003,在3个黄河高原鳅群体中共检测到28个多态位点。不同黄河高原鳅种群间的单倍型多态性范围在0.575~0.872,核苷酸多态性范围在0.002~0.003。XH群体与JT群体间的遗传分化系数(Fst)为0.037,XH群体与DT群体间的Fst为-0.041,JT群体与DT群体的Fst为-0.022;不同黄河高原鳅群体的分子遗传变异主要发生在群体内(占99.56%)。单倍型网络结构图及NJ聚类树和ML聚类树均显示,不同黄河高原鳅自然种群个体相互混合在一起,未按照采样河段地理位置形成明显的聚类结构,即黄河高原鳅不同单倍型间呈现混合的分布格局。【结论】黄河高原鳅群体遗传多样性水平中等,不同自然群体间的遗传多样性水平存在一定差异,但并未检测到显著的遗传差异,建议在野外进行管理和保护时仍可视为一个整体。

RAG1基因新发变异致重症联合免疫缺陷1例报告及文献复习

目的提高重症联合免疫缺陷临床表型及基因型的认识。方法回顾性分析1例重症联合免疫缺陷患儿的临床资料及基因检测结果。结果患儿,女性,1月6天,发现体质量不增半月余。住院后并发感染且不易控制,血常规复查提示中性粒细胞绝对值波动于(0.34~5.51)×10^(9)/L,骨髓穿刺未见明显异常,粒细胞集落刺激因子治疗效果欠佳,淋巴细胞亚群符合T^(-)B^(-)NK^(+)免疫表型。全外显子测序发现RAG1基因母源性的c.1229G>A(p.Arg410Gln)、c.2428A>G(p.Ile810Val)错义变异和父源性的c.2005G>A(p.Glu669Lys)错义变异,但前者为国内首次报道,第2个为国际首次报道。结论扩充了国际及国内重症联合免疫缺陷基因变异谱。

RAG1基因新发突变1例分析及文献复习

目的探讨人重组激活基因1(RAG1)变异引起的联合免疫缺陷病(CID)患儿的临床、免疫特征及基因表型。方法对2020年3月佛山市妇幼保健院的1例CID患儿的临床资料进行分析并复习相关文献。结果该患儿因巨细胞病毒及耶氏肺孢子菌感染导致重症肺炎。血常规提示淋巴细胞减少,为(0.95~2.81)×10^(9)/L,CD3^(+)细胞、B细胞、免疫球蛋白水平明显低于同龄儿童。基因检测结果显示RAG1存在一处纯合子突变c.3074dupT(重复突变),导致氨基酸改变p.L1025Ffs*40(移码突变40位后蛋白翻译提前终止)。这个新型变异未被报道过。结论 CID患儿易被条件致病源引发严重感染;RAG1基因变异可致CID;新发现RAG1基因纯合子突变。

尼罗罗非鱼整胚原位杂交技术的建立和初步应用

为了研究尼罗罗非鱼胚胎发育和器官形成过程中基因功能和基因表达图式,本研究建立了尼罗罗非鱼的整胚原位杂交流程。尼罗罗非鱼的胚胎具有卵黄大、不透明、色素出现早等特点,因此现有鱼类整胚原位杂交方法不能完全适用于尼罗罗非鱼的胚胎,故本研究做了相应的调整和优化:通过提高H2O2的浓度和添加KOH,改良了尼罗罗非鱼胚胎的色素去除方法;使用冷丙酮代替蛋白酶K在提高胚胎通透性的同时保持胚胎完整;减少了探针回收和抗体回收后的洗涤次数,完善了结果的图像采集和胚胎保存方案。使用尼罗罗非鱼的重组激活基因Rag1作为探针基因,整胚原位杂交结果显示Rag1基因表达的位置与已报道的斑马鱼和日本青鳉的Rag1基因在胚胎中的表达位置高度保守,胚胎完整,基因表达位置清晰可见,表明此套尼罗罗非鱼的整胚原位杂交技术流程成功有效。

南海常见7种石斑鱼的DNA条码构建与亲缘关系分析

利用特异性聚合酶链式反应(PCR)技术扩增获取了南海海域常见的7种石斑鱼———鲑点石斑鱼(Epinephelus fario)、青石斑鱼(E.awoara)、黑边石斑鱼(E.fasciatus)、赤点石斑鱼(E.akaara)、七带石斑鱼(E.septemfasciatus)、斜带石斑鱼(E.coioides)、棕点石斑鱼(E.fuscoguttatus)———线粒体DNA COI基因及核DNA的RAG1基因部分序列。测定序列的比较分析结果显示:①该研究获取的COI基因部分序列能将7个物种分别开来,可以作为DNA条码;②线粒体DNA COI基因及核DNA的RAG1基因部分序列分别构建的系统发生树较为一致,结果都支持7种石斑鱼分为3支:青石斑鱼和斜带石斑鱼为第1支;鲑点石斑鱼、黑边石斑鱼、赤点石斑鱼和棕点石斑鱼为第2支;七带石斑鱼为第3支。研究表明,COI基因部分序列不但可以作为物种辨识的良好DNA条码,而且在石斑鱼属内的种间系统发生关系分析方面也具有一定的适用性。

V(D)J重组起始阶段的研究进展与展望

重组激活基因(recombination activating gene)1和2编码的RAG1和RAG2蛋白通过对V(D)J重组起始阶段的调节作用,使得抗原受体基因重排严格地按组织、细胞发育阶段进行。本文将就RAG蛋白结合和催化断裂抗原受体基因机制作简要介绍。这些新发现明确了体内V(D)J重组发生的部位以及其出现错误时可能发生的地方,提示V(D)J重组机制不仅对淋巴细胞正常发育起关键性作用,而且对基因组不稳定性和淋巴系统恶性肿瘤的发生也具有重要意义。

RAG1基因新发现变异位点的结构分析及致病性预测

目的探索胚胎植入前单基因遗传学检测(preimplantation genetic testing for monogenic,PGT-M)周期前与重症联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency,SCID)相关的重组激活基因1(recombination activating gene 1,RAG1)基因结构和功能,并对其新发现变异位点进行致病性预测。方法针对2016年8月于中山大学附属第一医院生殖医学中心就诊的先证者的外显子报告及其父母外周血染色体核型及Sanger测序数据,利用PROVEAN、PolyPhen-2和Mutation Taster致病性预测软件对RAG1基因变异位点的基因结构、蛋白保守结构域进行分析,并对突变与野生型RAG1蛋白的结构进行三维结构重建,实现致病性的预测。结果双方均为RAG1基因突变携带者,突变位点位于11号染色体上,女方为c.946T>G(p.C316G)杂合错义突变,男方为c.11941196del(p.L399del)杂合整码突变。两个突变位点对应的氨基酸在人、黑猩猩、猪、牛、大鼠、小鼠6个物种中高度保守。二级三级结构重建显示,c.946T>G(p.C316G)突变导致对应的RING型锌指结构丧失结合锌离子的能力,c.11941196del(p.L399del)突变引起的第399位亮氨酸缺失导致氢键减少1条。结论推测RAG1两个新发现变异位点为可致病性突变,扩大了RAG1基因的突变谱,具有重要的研究价值。

重组活化因子1基因突变所致不同临床表型严重联合免疫缺陷病3例分析

目的总结分析重组活化因子(RAG)1基因突变所致严重联合免疫缺陷病(SCID)的不同临床及免疫特点。方法 2012年9月至2013年4月首都医科大学附属北京儿童医院收治的3例SCID患儿,经RAG1基因突变分析获得明确诊断,经HLA配型方法除外母体T淋巴细胞经胎盘输注,经细胞遗传学方法判断淋巴细胞增殖功能。结果病例1表型为经典SCID,病例2表型为Omenn综合征,病例3为伴反复自身免疫性溶血性贫血的非典型SCID。RAG1基因突变分析结果,病例1复合杂合位点1:1870 C>T,Arg624Cys;位点2:2005 G>A,Glu669Lys。位点1为已报道突变,位点2为新发现的错义突变。病例2复合杂合位点1:994 C>T,Arg332X;位点2:1439 G>A,Ser480Asn。均为新发现突变。病例3纯合2095 C>T,R699W,为已报道突变。前两例患儿均于自动出院后不久夭折,后者仍处于反复住院治疗自身免疫性溶血性贫血过程中。结论 RAG1突变所致SCID临床表现有差异,经典SCID和Omenn综合征预后严重,需移植治疗。

两例Omenn综合征的基因诊断及发病机制研究

目的探讨2例Omenn综合征患儿的临床特征和基因突变类型。方法对2例疑似严重联合免疫缺陷（severecombinedimmunodeficiency，SCID）的患儿及其家族成员的RAGl及RAG2基因进行PCR扩增、测序，对其T细胞受体基因TCRⅧ亚家族克隆谱型进行分析。结果两例患儿均有反复感染病史、红皮病皮疹和脱发秃顶等典型的Omenn综合征的临床表现。例1免疫学表型为T—B-NK＋，例2免疫学表型T十B-NK十、IgE和嗜酸性细胞升高。2例患儿均携带RAGl基因的复合杂合突变。例1基因突变位点为c．1328G〉A（P．R443K）；e．2486—2490delGGAAA（p．R829fsX869），二者均为新突变。例2的突变位点为c．1209C〉T（P．R403w）、C．2892delT（P．ASN964LYSfs＊14），其中e．2892delT（P．ASN964LYSfs＊14）为新突变。两例患儿的父母均为突变携带者。在100名正常儿童中未发现相同的突变。两例患儿的绝大多数TCRVp亚家族基因扫描图呈现单克隆或寡克隆峰，TCR邯多态性严重受阻。植物凝集素刺激淋巴细胞增殖极度低下。结论新发现并确认了3种能够引起Omenn综合征的突变。Omenn综合征患儿发病时间早，病情复杂且进展迅速，早期诊断并迅速干预可以降低死亡率。

SNC73基因在结肠癌细胞中的表达及重组的研究

目的 观察上皮来源的肿瘤细胞SNC73(IgHα1)基因的表达 ,探讨其在上皮细胞中的重组机理。方法 采用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)和Western印迹杂交方法 ,分析经无血清培养基培养的大肠癌细胞系SW4 80中SNC73和重组激活基因 (RAG1和RAG2 )的表达 ,并对RT PCR产物进行序列分析 ;利用免疫组织化学方法检测IgHα1、Igλ和Igκ在SW 4 80中的表达。 结果 SNC73、RAG1、RAG2、IgHα1和Igκ在SW 4 80细胞系中表达阳性 ,而Igλ则为阴性。对SNC73RT PCR产物的序列进行分析 ,发现SW 4 80中表达的SNC73基因的恒定区序列与免疫球蛋白A1完全一致。对RAG1和RAG2RT PCR产物的序列进行分析以及Western印迹杂交检测 ,表明其与前B淋巴细胞表达的完全相同。结论 上皮来源的肿瘤细胞表达免疫球蛋白A1,且轻链为κ;RAG1和RAG2在上皮来源的肿瘤细胞中的表达 。