甘薯Ran基因的克隆和表达分析

Ran蛋白是小GTP结合蛋白家族成员之一,控制着蛋白和RNA分子的运输过程。研究发现有些Ran基因受多种逆境胁迫的诱导表达。为了获得甘薯Ran基因,本试验通过RT-PCR克隆了1个甘薯Ran基因。测序结果显示其含有长666bp的完整开放阅读框,编码的蛋白含221个氨基酸,推测分子量为25.15kDa。比对分析发现甘薯与多种生物的Ran蛋白的氨基酸序列同源性都超过90%,荧光定量PCR研究表明IbRan基因受低温、PEG、盐和植物激素ABA的诱导表达。这为利用基因工程手段调控甘薯的抗逆性奠定了基础。

三明野生蕉Ran基因克隆及其组织特异性与低温胁迫表达分析

【目的】探讨三明野生蕉Ran基因在低温胁迫响应过程中的作用。【方法】通过RT-PCR与RACE相结合的方法和q RT-PCR克隆Ran基因,并对其在响应低温胁迫和水杨酸处理过程中的表达进行分析。【结果】分离得到6条含有完整开放阅读框的Ran基因c DNA序列,编码的蛋白质与其他植物Ran蛋白高度同源,带有GTP水解结构域、Ran GAP结合结构域和酸性尾巴等典型结构域。q PCR分析结果表明,三明野生蕉Ran基因在根、叶片、花序轴、苞片、花、果皮和果肉中均有表达,在根中表达量最低,在叶片、花和果肉中的表达量较高。此外,低温胁迫和水杨酸处理可显著影响三明野生蕉Ran基因的表达。【结论】三明野生蕉Ran基因与细胞分裂、低温胁迫响应和水杨酸信号转导有关。

RAN基因沉默对辐射诱发基因组不稳定肝细胞HL-7702凋亡及细胞周期的影响

为研究RAN基因沉默对基因组不稳定肝细胞凋亡及细胞周期的影响,利用慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)技术沉默基因组不稳定肝细胞中RAN基因的表达,通过流式细胞术检测RAN基因沉默后基因组不稳定肝细胞的凋亡率及细胞周期。实时荧光定量PCR检测表明,RAN siRNA能有效沉默RAN基因mRNA的转录(p<0.01);流式细胞术检测表明,RAN基因沉默诱发基因组不稳定肝细胞G0/G1期细胞增加(p<0.05),发生G1期阻滞,同时,细胞凋亡率较阴性对照组明显降低(p<0.01)。说明RAN基因可能通过参与周期调控及促进细胞凋亡进而维持肝细胞基因组的稳定性。

日本囊对虾Ran基因的克隆表达与蛋白质GTP结合活性分析

在日本囊对虾抑制性差减杂交(suppression subtractive hybrid ization,SSH)研究过程中,首次发现一段经同源比较为Ran基因的部分序列,在抗病日本囊对虾中上调表达.为了进一步探索日本囊对虾Ran基因的功能,通过RACE-PCR的方法克隆得到了日本囊对虾Ran基因全长共1 441个碱基,其中开放阅读框为645个碱基,共编码215个氨基酸,这是首次在海洋无脊椎动物体内克隆到该基因.还将该基因克隆到原核表达载体PGEX-4T-2中并转化大肠杆菌BL21,37℃下诱导6 h,超声裂解表达菌株,结果表明GST-Ran融合蛋白在大肠杆菌中为可溶性表达,蛋白大小约为50 ku,经纯化得到了纯度大于90%的GST-Ran融合蛋白.随后的GTP结合试验验证了Ran蛋白具有GTP结合活性.

彩鲫ran基因原核表达蛋白多克隆抗体的制备

采用SDS-PAGE分离纯化彩鲫(Carassius auratus gibelio)ran基因编码区cDNA全长序列的原核表达蛋白,并以此为抗原免疫家兔,制备了相应的多克隆抗体;W estern b lotting结果表明,该抗体效价为1∶1000,具有较高的特异性。并从抗原蛋白相对分子质量、每次注射蛋白量、注射方式、注射途径等诸方面对该技术的要点进行了介绍。

橡胶树HbRAN1基因的克隆与表达分析

利用本课题组获得的二代测序(FLX454)转录组数据库,筛选并克隆获得到1条969 bp的核苷酸序列,该序列编码1个由221个氨基酸组成的25.11 ku蛋白,氨基酸同源性分析发现,此氨基酸序列具有GTPase活性区域,属于小G蛋白RAN亚家族,且与蓖麻、烟草、水稻、小麦等的RAN1基因序列高度同源,命名为HbRAN1(GenBank登录号:KC577150)。实时荧光定量PCR分析结果表明,该基因受割胶、伤害、高温、低温、干旱及乙烯利等因素调控,同时其表达模式与橡胶树死皮程度相关,但对SA、GA、JA、ABA、CTK、2,4-D等激素处理应答不明显。结果表明,HbRAN1基因编码1个典型的RAN蛋白,可能在橡胶树抗逆过程中起作用,可作为橡胶树抗逆分子育种的靶标基因。

青虾Ran基因的克隆、表达及其在卵巢发育中的功能

本研究应用RACE技术克隆了青虾(Macrobrachium nipponensis)Ran(Ras related nuclear protein,Ras相关核蛋白)基因全长cDNA序列,该基因cDNA全长1191 bp,包括218 bp的5'UTR,648 bp的开放阅读框(ORF),405 bp的3'UTR,编码215个氨基酸。青虾Ran基因属于P-loop-NTPase超级家族,拥有PTZ00132跨结构域,多肽分子量约为24.57 kDa,理论等电点7.13。系统进化树分析表明,在动物界进化中非常保守的青虾Ran多肽与罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)聚为一支,具有最近的亲缘关系。使用荧光定量PCR技术检测Ran基因在成体青虾不同组织和卵巢不同发育期的表达差异,结果显示,Ran基因在青虾不同组织中均有表达,其表达量在卵巢中最高,是精巢表达量的7~8倍;随着卵巢的发育,Ran基因的表达水平呈现上升趋势,在卵巢消退期又恢复到较低水平。RNA干扰后,实验组Ran基因表达量显著低于对照组(P<0.05),同时卵巢发育关键基因Vg(vitellogenin)在卵巢中的表达量也显著低于对照组(P<0.05),推测Ran基因参与雌性卵巢发育过程并对Vg基因的表达起到调控作用。

辐射诱发基因组不稳定性肝细胞Ran基因过表达和RNAi模型的构建

目的构建基因组不稳定细胞Ran基因过表达和RNAi模型,为进一步研究该基因在辐射诱发基因组不稳定的功能提供研究工具。方法根据Ran基因信息,以慢病毒载体GV218设计合成2种重组质粒,分别包含Ran基因全长序列以及阴性对照序列;以慢病毒载体GV248设计合成2重组质粒,分别包含Ran基因的小干扰序列以及用于干扰对照的阴性序列。利用Western blot和qPCR进行过表达和RNAi重组质粒表达的检测;通过转染293T细胞进行慢病毒的包装;利用qPCR和荧光法分别进行滴度的检测;再用包装好的慢病毒感染辐射诱导基因组不稳定性HL-7702肝细胞,利用qPCR检测Ran基因表达量。结果测序结果表明重组质粒构建成功,并能够有效转染293T。过表达病毒滴度为2.0×108 TU/mL;RNAi病毒滴度为3.0×108 TU/mL。过表达慢病毒能有效地上调Ran基因的表达,过表达效率为85%。RNAi干扰慢病毒能够有效抑制Ran基因的表达,抑制效率为73%。结论成功构建基因组不稳定肝细胞Ran基因过表达和RNAi模型,为进一步研究Ran基因在辐射诱发基因组不稳定细胞中的功能提供了有效的研究工具。

基于生物信息学方法构建肝癌患者预后相关内源竞争RNA调控网络

目的:基于生物信息学方法探索肝细胞癌相关的差异表达基因(DEGs),并构建预后相关内源竞争RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)调控网络。方法:利用数据集GSE89377,筛选肝细胞癌不同发展时期的肿瘤组织与正常组织间的差异表达基因;通过GEPIA,HPA数据库探究DEGs的mRNA和蛋白在肝细胞癌中的表达,及对患者预后的影响;随后通过Cox回归分析,筛选可独立预测患者预后的关键基因;进一步通过GO和KEGG富集分析探索关键基因相关信号通路。最后,通过miRmap、miRWalk和Targetscan数据库预测关键基因的上游微小RNA (microRNA,miRNA),并筛选预后相关miRNAs;通过Starbase和Lncbase预测重要miRNAs的LncRNAs,并筛选预后相关LncRNAs。以此构建影响肝癌患者预后的差异基因-miRNA-LncRNAs的ceRAN调控网络。结果:韦恩分析及表达分析发现,4个DEGs在肝癌组织及正常组织间差异表达,即AKR1B10、LAGLS4、MUC13、IGFALS;其中,AKR1B10高表达可独立预测肝癌患者不良结局;共预测到5个AKR1B10的上游miRNA,其中miRNA-486-5p与AKR1B10的表达呈显著负相关,其低表达可降低肝癌患者的总生存率;共预测到4个miRNA-486-5p的lncRAN,生存分析显示RAB30-AS1的表达影响肝细胞癌患者的预后。通过上述分析,构建了影响肝癌患者预后的ceRAN调控网络,即AKR1B10-miRNA-486-5p-RAB30-AS1。结论:通过生物信息学分析,构建了肝癌患者预后相关ceRAN调控网络AKR1B10-miRNA-486-5p-RAB30-AS1,有望成为肝癌治疗的新策略。

配对肝癌组织与非癌肝组织基因组差异的随机扩增多态性DNA分析

目的：研究同一肝癌患者配对肝癌组织与非癌肝组织基因组之差异。方法：应用随机扩增多态性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）分析技术。结果：６例配对标本作基因组差异分析显示，与各自配对的非癌肝组织相比，所有肝癌组织基因组ＤＮＡ的ＲＡＰＤ指纹图谱均存在差异，其中３例配对肝癌基因组中均存在一相同的０．９ｋｂ的随机扩增片段。结论：ＲＡＰＤ技术为差异基因分析提供了一有效方法。

RNA干预的机制与应用

综述RNAi的作用机制,RNAi对生物的作用,RNAi技术的应用。

LncRNA SNHG15通过调控miRNA-451a促进乳腺癌细胞的上皮间质转化研究

目的:研究长链非编码RNA小核仁RNA宿主基因15(LncRNA SNHG15)与miRNA-451a对乳腺癌细胞的生物学活性的影响。方法:qRT-PCR法检测SNHG15、miRNA-451a及趋化因子受体4(CXCR4)在乳腺癌耐药细胞SKBR3-PR中的表达情况;细胞划痕实验检测干扰SNHG15及miRNA-451a抑制剂对SKBR3-PR的细胞迁移能力的影响;流式细胞术检测对细胞凋亡情况的影响;Western blotting实验检测CXCR4、上皮间质转化(EMT)相关蛋白Vimentin、Snail水平表达。结果:相比于亲本细胞,乳腺癌耐药细胞株中SNHG15表达量上调,但差异无统计学意义(P>0.05),miRNA-451a表达量下降(P<0.05),CXCR4表达量上调(P<0.01);划痕实验结果显示SNHG15促进细胞的迁移(P<0.01),miRNA-451a可抑制细胞迁移(P<0.01);细胞凋亡实验结果表明SNHG15抑制细胞凋亡(P<0.01),miRNA-451a促进细胞凋亡(P<0.01);Western blotting表明干扰SNHG15后,EMT相关蛋白Snail和CXCR4表达水平下降,miRNA-451a抑制剂组Snail和CXCR4表达水平上升(P<0.01),Vimentin表达水平无统计学意义(P>0.05)。结论:LncRNA SNHG15可能通过调控miRNA-451a促进乳腺癌细胞的迁移、凋亡,并且潜在调控CXCR4诱导乳腺癌细胞的EMT。

基于基因表达式编程的数据驱动湍流建模

计算流体动力学是湍流研究的重要手段,其中雷诺平均模拟在航空航天等实际工程中得到了广泛应用.雷诺平均模拟的结果很大程度上依赖于湍流模型的预测精度,而实际工程应用中常用的模型往往精度有限.近年来,数据驱动的湍流建模方法得到越来越多的关注.本文介绍了基于基因表达式编程(gene-expression programming,GEP)方法的湍流建模相关进展.本文首先讨论基因表达式编程应用于湍流建模的具体方法,包括基本算法、显式代数应力模型和湍流传热两种建模框架、模型测试方法以及损失函数设置等.在此基础上,基因表达式编程方法被应用于涡轮叶栅尾流混合、竖直平板间自然对流、三维横向流中的射流等问题.结果表明,GEP可以有效提升常用模型对于尾流混合损失、壁面热通量等关键参数的预测精度.基因表达式编程方法可以显式给出模型方程,因此模型具有可解释性强等特点.基于双向耦合方法得到的模型还被证明具有较好的后验测试精度和鲁棒性.基因表达式编程方法还被初步应用于大涡模拟亚格子应力和边界层转捩等问题的建模,在不同湍流建模领域表现出很大的潜力.

李Ran基因的克隆与生物信息学分析

本研究以芙蓉李为材料,采用同源克隆和RACE技术从芙蓉李叶片中分离得到2个李Ran基因PsRan1和PsRan3,长度分别为984 bp和952 bp。生物信息学分析结果表明,PsRan1和PsRan3均编码221个氨基酸。PsRan1和PsRan3与其他物种的Ran蛋白具有很高的相似性,均具有Ran蛋白的特征结构域,包括与GTP结合与水解有关的结构域、C-末端酸性结构域和影响因子结合结构域。NetPhos2.0Server预测结果表明二者具有10个相同的磷酸化位点。

miRNA成熟相关基因DICER、DROSHA、RAN基因多态性与不明原因复发流产的相关性研究

目的探讨miRNA成熟关键基因DICER、DROSHA和RAN的基因多态性与女性复发流产的相关性。方法收集2013年6月至2015年12月于四川大学华西第二医院就诊的不明原因复发流产(URSA)患者共217例,至少有1次生育史的育龄妇女为正常对照组390例,对照组为同期进行体检和孕前检查育龄妇女。采用病例对照研究的方法,应用PCR-限制性片段长度多态性技术检测miRNA成熟过程中关键基因DICER rs3742330、DROSHArs10719和RAN rs14035单核苷酸多态性。结果 DICERrs3742330,DROSHArs10719和RANrs14035各等位基因和基因型频率在URSA组和对照组差异无统计学意义(P>0.05)。联合分析发现,DICERrs3742330/DROSHArs10719GG/TT+TC协同会增加复发流产的风险(OR=1.657,95%CI=1.006~2.731,P=0.047)。虽然DICERrs3742330/RANrs14035GG/TT+TC在URSA组较对照组增高,但差异无统计学意义(OR=1.977,95%CI=0.956~4.087,P=0.066),而DROSHA10719/RAN14035TT+TC/TT+TC与复发流产无相关性(OR=0.958,95%CI=0.679~1.353,P=0.808)。结论DICERrs3742330联合DROSHA rs10719可能与URSA相关。

Ran结合蛋白RanBP1的同源基因M3的克隆与功能分析

以Ran结合蛋白RanBP1的保守区域作为探针 ,低严谨条件下杂交筛选人视网膜cDNA文库 ,得到阳性克隆M 3,它与鼠zhx 1基因高度同源 .RH作图将其定位于 8q2 4.11～q2 4.3.拼接EST序列并填补缺口 ,得到M 3cDNA全长 4934bp ,与Northernblot得到的主要转录本长度一致 .此cDNA全序列包括 2 6 2 2bp开放阅读框 ,编码 873氨基酸 ,含有 2种翻译调控元件uUAG和TTATTTAT .该基因预测蛋白含有 2个锌指结构 ,5个同源盒保守区 ,1个双侧核定位序列 (NLS)及 35个磷酸化位点 ,表明它既可能作为转录调控因子 ,也可能受到上游因子的调控 .