沼泽绿牛蛙病毒的分离及其细胞感染的初步研究

沼泽绿牛蛙病毒的分离及其细胞感染的初步研究张奇亚，李正秋，江育林，梁绍昌，桂建芳（中国科学院水生生物研究所，武汉４３００７２）关键词沼泽绿牛蛙（美国青蛙），病毒，细胞感染ＰＲＥＬＩＭＩＮＡＲＹＳＴＵＤＩＥＳＯＮＶＩＲＵＳＩＳＯＬＡＴＩＯＮＡＮＤＣＥＬ...

免疫组化法检测美国青蛙组织中的蛙虹彩病毒

分不同时间 ,收集经人工感染了蛙病毒的样蛙 ,取其心、肺、肾、肠、脾、肝六种组织 ,并通过免疫组化方法进行检测。结果分别在感染了病毒 3d、9d、1 1d后的幼蛙这六种组织中 ,由表及里观察到了深色的阳性信号 ,从而测定了病毒在入侵组织中的存在部位。其中 ,肺和肠组织中阳性信号最强 ,呈灶性分布 ,其余四种组织中的阳性信号则呈散在分布。在未注射病毒的幼蛙阴性对照组六种组织中没有检测到阳性信号。

淡水生态系统中几种大DNA病毒研究概述

淡水生态系统中的大DNA病毒指存在于淡水系统中、基因组大小接近或超过100 kb的DNA病毒,它们通常是感染鱼类、虾类及藻类等水生生物以及两栖类的病原体,影响水产养殖动物的健康及淡水生态平衡。文章以虹彩病毒科(Iridoviridae)的沼泽绿牛蛙病毒(Rana grylio virus, RGV)和大鲵蛙病毒(Andrias davidianus ranavirus, ADRV)、鱼蛙疱疹病毒科(Alloherpesviridae)的鲫疱疹病毒(Crucian carp herpesvirus, CaHV)、线头病毒科(Nimaviridae)的克氏原螯虾病毒(Procambarus clarkii nimavirus, PCV)及肌尾病毒科(Myoviridae)的铜绿微囊藻肌尾噬藻体-滇池株(Microcystis aeruginosa myovirus isolated from Lake Dianchi, MaMV-DC)为主线,对淡水生态系统中几种大DNA病毒代表株的研究现状与文献进行概述,并提出和讨论淡水水生大DNA病毒研究及水生病毒学科发展愿景,以期为相关科研人员提供参考。

蛙虹彩病毒一个晚期基因的鉴定

从沼泽绿牛蛙虹彩病毒(Rana gryliovirus,RGV)基因组中克隆了十四烷基化膜蛋白(myristylated membrane protein,MMP)基因的全部编码区,序列分析表明,RGVmmp基因全长972 bp,编码一个长为323 aa,分子量为35×103的蛋白.氨基酸同源性比对分析,与同为蛙病毒属的其他病毒的相应蛋白同源性都在64%以上.构建重组表达载体,进行了原核表达,获得一条约53×103的融合蛋白,并制备出抗血清.通过RT-PCR和Westernblot分析确定了RGV感染过程中mmp基因的表达时序,检测到感染4 h有转录,感染6 h有表达,且持续到感染48 h.用蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX)和DNA复制抑制剂阿糖胞苷(AraC)分别作为蛋白合成和病毒DNA复制的抑制剂进行药物抑制实验,鉴定出mmp是蛙虹彩病毒RGV的一个晚期基因.

虹彩病毒胁迫下东北林蛙NF-κB和I-κB的差异表达

根据实验室高通量测序所得核转录因子κB(NF-κB)NF-κB1、NF-κB2和I-κBα部分序列,应用荧光定量PCR技术,检测虹彩病毒(Rana grylio virus,RGV)胁迫下NF-κB1、NF-κB2以及I-κBαmRNA在东北林蛙(Rana dybowskii)肝脏、脾脏、皮肤中的差异表达,并对表达差异进行统计学分析。结果显示:在东北林蛙不同组织中,NF-κB1和NF-κB2的表达水平有差异,NF-κB1表达量约是NF-κB2的2倍,且皮肤和脾脏中的表达量远高于肝脏。在虹彩病毒刺激初,2个基因在3个组织中表达量立即下调,受刺激0.5 h后2个亚基在3个组织中都有上调趋势;肝脏和皮肤中,在刺激后2 h(在肝脏中)和4 h(在皮肤中)快速上调至峰值;在脾脏中,2亚基上调趋势缓慢,分别在16 h(NF-κB2)和24 h(NF-κB1)达到峰值;2亚基表达至峰值后开始下调,并在8 h(在肝脏中)和12 h(在皮肤中)下调至初始水平,在脾脏中2亚基72 h以后才达到初始水平。I-κBα在受刺激初期也立即下调而后上调,上调至峰值的时间点与NF-κB基本相同。统计分析结果表明:各实验组基因表达量与对照组存在统计学差异(P<0.05)。

原位杂交技术用于虹彩病毒对美国青蛙侵染的诊断

蛙虹彩病毒 (Rana grylio virus,RGV)能引起鱼类、两栖类和爬行类水生动物严重的系统性疾病 ,RGV是从我国患病蛙中分离到的一种虹彩病毒。体外扩增的 RGV经人工方法感染幼龄美国青蛙 (Rana grylio) ,运用原位杂交技术 ,分别对感染 1～ 3d后的蛙心、肺、肾、肠、脾、肝等 6种组织进行 RGV分子定位和检测。结果显示 ,在幼蛙的肺和肠中有较强的阳性信号 ,在其他组织中也检测到 RGV的存在。本试验探讨了 RGV感染早期在宿主体内的增殖及在不同组织中的分布状况 ,建立了一种蛙虹彩病毒的早期诊断方法 ,并为揭示 RGV的致病机制奠定了基础。

三种水生动物细胞系对两株蛙病毒敏感性的比较

利用3个不同物种的水生动物细胞系,包括爪蟾肾细胞系(A6)、大鲵胸腺细胞系(GSTC)和鲤上皮瘤细胞系(EPC),分别用沼泽绿牛蛙蛙病毒(RGV)和大鲵蛙病毒(ADRV)感染,进一步研究细胞病变显微形态、病毒滴度、细胞病变与不同感染时间的相关性等。结果显示,在光镜下可见感染病毒的细胞发生病变,A6和EPC细胞肿胀或破裂;GSTC细胞收缩或聚在一起形成多层。同种水产动物细胞系对不同蛙病毒的敏感性不同,在A6、EPC和GSTC细胞中,RGV的滴度分别为10^(3.6)、10^(5.9)和10^(6.6) TCID_(50)/m L;ADRV的滴度分别为10^(4.3)、10^(5.4)和10^(6.1) TCID_(50)/m L,表明GSTC细胞系对两种蛙病毒都更敏感。研究为后续蛙病毒致病机理提供了有用的信息和重要实验材料。

蛙虹彩病毒cop基因的克隆表达及亚细胞定位

从蛙虹彩病毒(Rana gryliovirus,RGV)基因组中克隆了含凋亡相关结构域的新基因-cop(Caspaserecruit ment domain only protein,COP)基因的全部编码区,成功构建了重组表达载体,进行了原核表达,并在鲤鱼上皮瘤细胞(Epithelioma papulosumcyprini,EPC)中进行了亚细胞定位.序列分析表明,RGVcop基因全长288 bp,编码一个长为95 aa,分子量为10.4×103的推定蛋白.二级结构预测表明其含有5个α螺旋.同源性比对分析显示,RGVcop与其他6株虹彩病毒及人类cop相关蛋白同源性最高为94%,最低为33%.重组原核表达质粒pET28a-COP转化大肠杆菌BL21后,经IPTG诱导表达,获得一条约14×103的融合蛋白.重组真核表达质粒pEGFPN3-COP转染EPC细胞,经DAPI染色后,在荧光显微镜下观察显示重组蛋白在整个细胞中均有分布.

一株新的重组蛙病毒Δ67R-RGV的构建及基因67R的初步功能鉴定

沼泽绿牛蛙病毒(Rana grylio virus,RGV)属于虹彩病毒科(Iridoviridae),蛙病毒属(Ranavirus),其基因组中含编码尿嘧啶脱氧核糖核苷三磷酸酶(dUTPase)的基因67R。通过构建缺失67R的重组病毒Δ67R-RGV,探讨67R在RGV复制和感染过程中的功能。首先构建携带有作为标记的绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescence protein,EGFP)基因的质粒(pGL3-67RL-p50-EGFP-67RR),然后将该质粒与RGV基因组在67R位点进行同源重组(homologous recombination),并接种到培养的鲤鱼上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum cyprinid,EPC)单层细胞中。利用荧光显微观察,判断并筛选有感染性的重组病毒(Δ67R-RGV)。经过十轮挑斑分离,直至在普通显微镜下观察到的细胞病变空斑与荧光显微镜观察到的绿色荧光空斑完全吻合,获得一株新的、纯化的重组蛙病毒Δ67R-RGV。再以野生型蛙病毒(wt-RGV)为对照,分别扩增并提取wt-RGV和Δ67R-RGV的基因组DNA,进行PCR检测。结果显示,在wt-RGV基因组中可检测到67R;但在Δ67R-RGV基因组中仅检测到EGFP,却检测不到67R,证实在构建重组病毒时,EGFP的确按预期插入67R位点。进一步分别测定了wt-RGV与Δ67R-RGV的一步生长曲线,结果无显著差别,表明67R及其编码产物dUTPase的缺失并不影响RGV的正常复制,67R为病毒非必需基因。

蛙病毒同源蛋白RGV-27R和ADRV-85L的表达及其免疫原性分析

沼泽绿牛蛙病毒(Rana grylio virus,RGV)和大鲵蛙病毒(Andrias davidianus ranavirus,ADRV)同属虹彩病毒科(Iridoviridae)蛙病毒属(Ranavirus)成员,是引起水产动物高死亡率的病原。其同源早期蛋白RGV-27R和ADRV-85L与蛙病毒代表株蛙病毒3型(Frog virus 3,FV3)25R基因所编码的大小为31kD的早期蛋白P31K(FV3-P31K)同一性超过99%。我们在观察和比较RGV与ADRV感染大鲵胸腺细胞(Giant salamander thymus cell,GSTC)显微病变的基础上,将ADRV-85L和RGV-27R基因分别克隆到原核表达载体pET-32a与pMAL-p5X中,转化宿主菌E·coli BL21(DE3)并诱导表达,经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测,对这两种蛋白的原核表达及其产物免疫原性进行分析。结果显示这两种基因在载体pET-32a中的表达效率要显著高于pMAL-p5X。随后,取高效诱导表达的pET-32a-RGV-27R产物,经Ni-NTA His-Bind亲和层析分离提纯,获得浓度为1.2 mg/mL的融合蛋白His-RGV-27R,用其免疫动物,制备了抗体27R-Ab,酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测抗体的效价为1∶6.25×10~6。用经正常大肠杆菌菌液和正常GSTC细胞悬液吸附处理后的抗体作为一抗,对被RGV或ADRV感染的GSTC细胞悬液进行Western Blot检测,并以重组原核质粒表达的融合蛋白His-RGV-27R和HisADRV-85L作为阳性对照,以正常GSTC细胞悬液为阴性对照,分别从RGV或ADRV感染的GSTC细胞悬液中,检出大小同为31kD的特异性蛋白条带。本研究证实两种蛙病毒同源早期蛋白RGV-27R和ADRV-85L不仅都能在两栖动物细胞中表达,且具有相同的抗原特性,这为深入研究这类病毒蛋白对蛙病毒复制的影响及其与宿主相互作用的分子机制提供了实验材料。