哈蟆油酶解物激活MAPK/ERK信号凋亡途径修复皮质酮诱导HT-22细胞损伤作用

为研究哈蟆油(Oviductus Ranae,OR)对海马神经元细胞保护作用机制,该研究通过皮质酮(Corticosterone,CORT)诱导HT-22细胞损伤模型探究哈蟆油酶解物对小鼠海马神经元细胞(HT-22)细胞损伤模型的保护作用及其作用机制。采用CORT与HT-22细胞共同培养建立HT-22细胞损伤模型,给予哈蟆油酶解物再次孵育,将ERK信号通路抑制剂PD98059加入HT-22细胞中。采用MTT法、Hochest 33258染色、流式细胞术、Western blot技术检测HT-22细胞凋亡情况和相关蛋白表达以及MAPK/ERK信号通路蛋白表达。结果显示高水平CORT能够诱导HT-22细胞损伤,哈蟆油酶解物能够使CORT诱导的HT-22细胞活力提升62.5%~87.5%,凋亡比例降低50%~70%。哈蟆油酶解物能够上调BCL-2、P-ERK1/2蛋白表达,同时下调BAX、Caspase-3、Caspase-9的蛋白表达。上述结果表明,高水平CORT是通过抑制MAPK/ERK信号通路促进凋亡的发生从而诱导HT-22细胞损伤,哈蟆油酶解物能够通过激活MAPK/ERK信号通路调节BLC-2、BAX、Caspase-3、Caspase-9凋亡相关蛋白的表达进而抑制凋亡的发生减轻神经元损伤,该作用机制为哈蟆油发挥抗抑郁作用的关键途径之一。

哈蟆油蛋白酶解物氨基酸组成和安全性研究

研究哈蟆油蛋白酶解物的氨基酸组成,通过急毒试验和30 d喂养试验对其安全性进行评价。采用柱前衍生化法测定哈蟆油蛋白酶解物中的氨基酸的相对含量;急性毒性试验以动物最大耐受剂量灌胃给药,观察急性毒性反应和死亡情况;30 d喂养试验按临床给药剂量的100倍、75倍、50倍灌胃给药,观察大鼠的一般行为情况、体质量、血液学指标、血清生化指标、各脏器重量及脏器比,检查大鼠各脏器病理组织。哈蟆油蛋白酶解物氨基酸组成的结果为必需氨基酸的相对含量高达45.87%,半必需氨基酸14.78%。急毒试验结果为哈蟆油蛋白酶解物以临床剂量的127倍灌胃给药,未发现毒性反应。30 d喂养试验结果,与对照组相比,哈蟆油蛋白酶解物各剂量组大鼠一般情况、体质量、血液学指标、血清生化指标、脏器重量及脏体比、病理组织学检查均无显著性差异。综上判定哈蟆油蛋白酶解物对大鼠的生长、发育、代谢及脏器无急性不良影响,并可为机体提供大量必需氨基酸。

林蛙油蛋白酶水解物的免疫促进功能与抗氧化活性

用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶制备林蛙油蛋白酶水解物,分别称为PAH、TPH、NPH、APH。巨噬细胞吞噬中性红实验结果表明,4种酶水解物均具有促进巨噬细胞功能作用,其中NPH的免疫促进作用最强,其次为PAH、TPH及APH。巨噬细胞体外释放NO实验结果再一次表明,林蛙油蛋白酶水解物具有免疫促进作用,其中还是NPH的活性最强,其次为PAH、APH及TPH。用总抗氧化能力测定实验,检测林蛙油蛋白4种酶水解物的抗氧化作用,结果表明,4种酶水解物也均具有一定抗氧化性,其中仍是NPH的抗氧化活性最强,其次为PAH、APH和TPH。比较4种酶水解物的促进巨噬细胞功能和抗氧化活性,发现具有较强免疫促进作用的林蛙油蛋白酶水解物同时也具有较强的抗氧化活性。

林蛙油蛋白胰蛋白酶水解物对小鼠脾淋巴细胞和巨噬细胞功能的影响

用胰蛋白酶水解林蛙油蛋白,并制备不同浓度林蛙油蛋白胰蛋白酶水解物,通过小鼠脾淋巴细胞增殖试验、巨噬细胞吞噬中性红试验和巨噬细胞体外释放NO试验,观测林蛙油蛋白胰蛋白酶水解物对小鼠脾淋巴细胞和巨噬细胞功能的影响。结果显示,不同浓度林蛙油蛋白胰蛋白酶水解物对脾淋巴细胞和巨噬细胞具有明显的免疫促进作用,当该水解物浓度大于100μg/m L时,对淋巴细胞增殖和巨噬细胞杀伤功能的促进效果极显著(P<0.001);当该水解物浓度大于200μg/m L时,对巨噬细胞释放NO的促进效果极显著(P<0.001)。该试验表明林蛙油蛋白的胰蛋白酶水解物可显著提高脾淋巴细胞和巨噬细胞功能(P<0.001),且随着浓度的增加,其作用效果增强。

哈蟆油蛋白酶解物对乙醇诱导的L-02细胞损伤的作用

目的:研究哈蟆油蛋白酶解物(ORPH)对乙醇诱导的L-02细胞损伤相关通路蛋白表达影响的作用机制研究。方法:复合酶解法制备ORPH,以400 mmol·L^(-1)乙醇建立L-02肝细胞损伤模型,细胞增殖与活性检测试剂盒-8(CCK-8)检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡、周期变化,JC-1/Hochest染色观察形态学变化;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测凋亡相关蛋白、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路及细胞焦亡相关蛋白在L-02肝细胞中的表达变化,研究ORPH对乙醇所致肝细胞损伤的保护作用及机制。结果:CCK-8法结果表明400 mmol·L^(-1)乙醇可在12 h内明显引起L-02肝细胞损伤;与空白组比较,模型组L-02细胞活力显著下降(P<0.01),细胞处于G0/G1期的细胞占比显著升高(P<0.01),细胞总凋亡率显著升高(P<0.01),线粒体膜电位下降;B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)相关X蛋白(Bax),细胞色素C(Cyt C),半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)凋亡相关蛋白的表达明显升高(P<0.05,P<0.01),MAPK信号通路相关蛋白c-Jun氨基末端激酶(JNK),p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)明显上调(P<0.05,P<0.01),且焦亡蛋白Caspase-1,白细胞介素-1β(IL^(-1)β)表达明显增强(P<0.05),Bcl-2显著下降(P<0.01);与模型组比较,ORPH处理组细胞周期阻滞有所改善(P<0.05,P<0.01),细胞总凋亡率显著下降(P<0.01),线粒体膜电位升高,呈剂量相关性;Bax,Cyt C,Caspase-3蛋白表达明显降低(P<0.05,P<0.01),Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01),MAPK信号通路相关蛋白及焦亡相关蛋白表达均呈下降趋势(P<0.05,P<0.01)。结论:ORPH可通过抑制乙醇诱导L-02肝细胞引起的氧化应激肝细胞损伤,改善恢复线粒体膜电位,降低线粒体介导的细胞凋亡通路蛋白的表达,并抑制MAPK信号通路相关蛋白、焦亡通路相关蛋白表达,从而降低乙醇诱导L-02肝细胞的线粒体功能障碍及炎症反应并减轻氧化应激,对酒精性肝损伤起到治疗作用。

哈蟆油蛋白酶解物对小鼠微核、精子畸形及Ames试验的研究

目的对哈蟆油蛋白酶解物致畸毒性进行研究。方法通过小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验和Ames试验对哈蟆油蛋白酶解物进行观察研究。结果与阴性对照组相比,各剂量组小鼠的嗜多染红细胞含微核率、精子畸形率均无显著性(P<0.001),无论在加和不加S9混合液时,各剂量组均未引起试验菌株的回复突变菌落数显著增加。结论哈蟆油蛋白酶解物无毒、无致突变性。