在大肠杆菌中高效表达可用于检测人源Rap1活性RapBD蛋白方法的建立

【背景】Rap1是一种小GTP酶,其活性的检测方法少,目前主要依赖试剂盒,检测成本太高。而Rap1下游效应蛋白RalGDS具有Rap1结合结构域(Rap binding domain,RapBD),该结构域能与有活性的GTP-Rap1特异性结合。【目的】利用大肠杆菌外源表达GST-RapBD融合蛋白,建立经济的检测人源Rap1活性的方法。【方法】合成RapBD基因序列,插入pGEX-4T-1载体,使该质粒表达GST-RapBD融合蛋白,再利用GST亲和树脂结合大肠杆菌中表达的GST-RapBD融合蛋白,最后利用GST-RapBD融合蛋白Pulldown检测GTP-Rap1。【结果】建立了检测人源Rap1活性的方法。【结论】序列优化使得pGEX-4T-1载体在大肠杆菌中高效表达能特异性结合人源GTP-Rap1且带有GST标签的RapBD蛋白,提高了Pulldown实验检测GTP-Rap1的效率,降低了检测人源小G蛋白Rap1活性的成本。