萝卜抗真菌蛋白基因Rs-AFPs在大肠杆菌中的表达及其转化番茄的研究

通过基因工程手段将萝卜抗真菌蛋白基因Rs AFP1( 2 ) 插入大肠杆菌表达载体pTrxFus中并诱导表达 ,其融合表达产物约 2 2kD ,约占总可溶蛋白的 0 .4 5 % (0 .5 % )。抑菌活性试验表明 :重组Rs AFP1( 2 ) 有抑菌活性 ,其中Rs AFP2 较Rs AFP1抑菌活性强。构建了Rs AFP2 基因的植物表达载体pBIAFP2 。利用农杆菌介导法将pBIAFP2 导入番茄中 ,并诱导出完整的植株 32株。对其中 2 8株进行PCR和PCR SouthernBlot检测 ,其中 17株呈阳性。对经PCR SouthernBlot检测呈阳性的植株进行SouthernBlot检测 ,6株呈阳性。

萝卜抗真菌蛋白Rs-AFP_2基因PCR定点突变及其在大肠杆菌中的表达

根据已报道的萝卜抗真菌蛋白Rs AFP2 基因序列 ,结合基因及其表达调控中遗传密码的偏爱性 ,人工合成引物 ,利用PCR重叠延伸法 ,使编码序列区的部分核苷酸突变 ,采用嵌套PCR ,迅速克隆到目的基因片段Rs AFPm ,连接到 pGEM Teasy载体上 ,转化大肠杆菌XL1菌株 ,筛选到阳性克隆。序列分析结果表明 ,PCR产物全长 2 40bp ,有一个阅读框 ,编码 2 9个氨基酸的信号肽和 5 1个氨基酸的抗真菌蛋白 ,与突变前的Rs AFP2 基因相比 ,在编码区第 3号氨基酸Lys相差一个碱基 (TTG→TTA) ,第 5号氨基酸Gln相差一个碱基 (CAG→CAA) ,第 6号稀有密码Arg相差两个碱基 (CAG→CGA) ,但二者编码产生相同。重新合成引物 ,将切除信号肽的Rs AFP2 基因和Rs AFPm基因分别克隆到pET 2 1b(+ )质粒载体上 ,导入大肠杆菌BL2 1菌株。Tricine SDS PAGE电泳显示工程菌中存在 6KD左右的目的蛋白带 ;软件分析显示 ,突变后pETAFPm的表达产物约为突变前 pETAFPo表达产物的2倍 ;抑菌结果表明 ,pETAFPm表达产物的抑菌半径大于 pETAFP2 表达产物的抑菌半径。这些都说明改造后的Rs AFPm基因与Rs AFP2 基因相比 ,已有效的提高表达量。