不同的核酸提取方法在布鲁氏菌检测中的应用评价

目的比较不同核酸提取方法对布鲁氏菌检出率的影响,为布鲁氏菌核酸快速提取检测提供技术参考。方法分别使用磁珠法、直接裂解法和高温裂解法对感染布鲁氏菌患者的20例全血样本、10例关节腔及浆膜腔积液样本进行核酸提取,然后进行实时荧光RT-PCR检测,采用SPSS 22.0对结果进行统计分析,评价该核酸快速提取试剂的DNA提取效率。结果磁珠法阳性检出率为100%,Ct值中位数为29.17(21.19~31.33),批内变异系数(CV)最高为1.33%。直接裂解法阳性检出率为63.33%,Ct值中位数为33.29(28.69~34.54),批内CV最高为1.28%。高温裂解法阳性检出率为100%,Ct值中位数为30.26(26.63~33.85),批内CV最高为1.21%。高温裂解法和磁珠法检出率比较差异无统计学意义(P>0.05),直接裂解法检出率显著低于磁珠法和高温裂解法(P<0.05)。结论核酸快速提取试剂在高温裂解条件下可保证核酸提取效率和重复性稳定,具有操作简单、检测时间短、降低实验室生物安全风险等优势,可以应用于布鲁氏菌的核酸检测。

一种快速有效提取植物和真菌DNA和RNA的简易方法

本文利用一种真菌核酸的快速提取方法提取了3种真菌的DNA和RNA,并将该法略作改进用于烟草DNA和RNA的提取。同时,通过低温保藏试验评价核酸提取液和提取产物的稳定性和有效性;利用凝胶电泳、PCR和RT-PCR等方法比较分析核酸质量;并将提取效果与传统方法或试剂盒的提取效果进行比较,以分析其有效性。结果表明,改进后的提取方法是一种简单、方便和有效的实验方法,不仅可用于真菌也可用于植物DNA和RNA提取,用这种方法提取得到的DNA和RNA在低温保存条件下比较稳定,能较长时间保持其原有活性。

一种快速提取香蕉叶片总核酸、总RNA和总DNA的新方法

在SDS法的基础上,以富含多糖、多酚等次生代谢物质的香蕉叶片为材料,通过选择性添加适量5 mol/L KAc(pH4.8)或不同体积无水乙醇分别提取香蕉叶片总核酸、总RNA(不含DNA)和总DNA(不含RNA)。结果表明:不添加KAc的可提取到总核酸;添加1/3体积和2/3体积的KAc得到总RNA,添加1/3体积无水乙醇处理得到总DNA。该结果获得一种简单、快速,能在1次实验中添加不同试剂提取香蕉叶片总核酸、总RNA和总DNA的新方法。

基于磁珠的核酸快速提取和纯化

采用纳米磁珠法对细菌基因组DNA、总RNA和质粒DNA进行提取纯化,并与试剂盒法和Trizol法提取效果进行比较,以期获得核酸最佳提取方法。结果发现,与试剂盒法和Trizol法相比,磁珠法在细菌基因组DNA和RNA提取、PCR产物检测及纯化中效率更高;而在PCR产物回收和质粒DNA的提取中,效率低于试剂盒法,质粒酶切效果与试剂盒法无差异。结果表明,纳米磁珠法相比试剂盒法和Trizol法在核酸提取纯化效果上更佳。

鲤疱疹病毒Ⅱ型的核酸恒温扩增微流控快速检测芯片的建立

鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)主要感染锦鲤、鲫鱼及其变种,导致造血器官坏死,其致死率高,给养殖业造成了巨大损失。为建立一种快速、灵敏、准确的CyHV-2检测方法,可于大规模暴发之前进行疫情的早期诊断和及时防控,对CyHV-2建立了一种集核酸快速提取方法、竞争性互补介导核酸恒温扩增(competitive annealing mediated isothermal amplification,CAMP)与微流控芯片(microfluidic chip)于一体的检测方法。以CyHV-2基因保守区域片段为靶序列设计特异性引物,通过条件优化建立了一种基于CAMP技术的CyHV-2可视化检测方法,并且对该方法进行了特异性、灵敏性及临床样本的检测进行评估。结果表明:所建立CAMP方法的灵敏度最低检测限为10拷贝;对与其基因型有较高相似性的鲤疱疹病毒Ⅲ型(Cyprinid herpesvirus3,CyHV-3)无非特异性扩增,特异性良好;用本方法对89批次的临床样本进行检测,显示灵敏度及特异性均为100%。核酸快速提取的方法能够较快获得纯度较高的核酸,缩短了核酸提取时间,且极大节约了检测成本,具有操作简单、样本用量少等特点,且经核酸快速提取方法处理的病鱼组织样本能够满足CAMP现场检测的要求。此外,将针对CyHV-2所建立的CAMP可视化检测方法结合微流控芯片,可实现多目标病原的高通量、多指标筛查,将极大提高检测效率。本试验对鲤疱疹病毒Ⅱ型所建立的核酸快速提取、CAMP检测及微流控芯片的方法可在70min内实现对该病毒的现场快速检测及诊断,极大地提高了对CyHV-2疫病的早期防控能力,将为CyHV-2的快速检测及疫情早期预警提供参考。所建立的方法亦可应用于其他经济水生生物病原的现场快速检测及后续防控。

可视化核酸检测技术RPA-LFD的研究和应用进展

重组酶聚合酶扩增技术(recombinase ploymeraseamplication,RPA)是一种新型恒温核酸扩增技术,与PCR相比,操作简便,反应快速,灵敏度高,特异性强,无需精密仪器,是一种可以替代PCR的核酸检测技术,被认为是目前最有潜力成为快速分子诊断的工具。RPA与横向流动试纸条(lateral flowdipstick,LFD)结合的RPA-LFD技术,可实现扩增产物的可视化检测,在病原体现场核酸快速检测中具有良好的应用前景,这为实验动物的质量监督检验提供了一种新的方法。本文对RPA-LFD这一新型核酸检测方法的技术原理、研究现状、技术瓶颈及用于现场核酸提取的研究进展进行综述。

噬菌体基因组DNA快速提取方法

针对传统噬菌体基因组DNA的提取方法缺乏广泛适用性,并且提取中用到酚/氯仿抽提,操作步骤繁琐,会对操作人员身体造成一定程度的损伤等不足,笔者建立了1种噬菌体基因组DNA快速提取方法。其提取的主要步骤包括宿主核酸降解、噬菌体粒子沉淀、噬菌体DNA释放、杂质去除、DNA吸附、DNA清洗和DNA洗脱等。结果表明,通过此法能快速提取以溶藻弧菌、大肠杆菌和阴沟肠杆菌为宿主菌的多种噬菌体基因组DNA,最快可以在2 h内完成,而且提取的产量和纯度均较高,DNA浓度超过100 ng·μL^(-1),OD_(260/280)达到1.8以上,提取产物不受宿主菌基因组DNA污染,可用于下游的实验分析。

磁珠快速核酸提取法在南美白对虾病原检测中的应用及其性能评价

为实现南美白对虾相关病原核酸快速、便捷提取,并实现原材料国产化,降低成本,建立了一种基于国产磁珠的核酸快速提取方法(以下简称磁珠法).以携带虾肝肠胞虫的南美白对虾为实验样本,通过微流控芯片对3种磁珠提取的核酸进行测试,并对裂解液中盐酸胍浓度及洗涤液2中乙醇浓度进行了优化.通过优选实验确定:奥润磁珠提取效果优于其他两种磁珠;裂解液中盐酸胍的最佳浓度为4 mol·L^(-1);洗涤液2中乙醇的最佳质量分数为75%.在此基础上,分析评价了优化后的磁珠法核酸提取线性范围、灵敏度、精密度、特异性及抗干扰能力等技术性能.结果显示:稀释10^(4)倍后的低浓度病原核酸仍保持较好的扩增效果,变异系数为2.03%,表明建立的磁珠法具有较宽的检测范围,灵敏度高,特异性和抗干扰能力强.本文建立的磁珠法可实现快捷、通用、高纯度、低成本的南美白对虾主要病原的核酸提取.

新型快速中药材DNA提取方法的探索与应用

目的建立一种无设备快速30 s提取中药材DNA的方法。方法使用常规定性滤纸作为核酸吸附的载体,通过裂解液的裂解,释放核酸并吸附在滤纸上,利用洗脱液进行核酸纯化,即可完成不到30s的整个核酸提取过程,吸附核酸的滤纸可直接放入反应体系进行扩增。结果此方法可以成功提取不同药用部位的中药材核酸,提取得到的核酸经扩增验证,可获得与传统提取方法相一致的检测结果。结论此新型快速中药材DNA提取方法简单易行、速度快、成本低,可使核酸提取变得越来越大众化,不再局限于专业人员和实验室环境,为分子生药学的应用和发展提供了新思路。

一种快速核酸提取试剂在流感病毒检测中的应用评价

目的探讨一种快速核酸提取试剂在流感病毒检测中的适用性及有效性。方法选取流感病毒H3亚型、乙型Yamagata系细胞株和甲型H1N1型鸡胚株各1株,对其倍比稀释液及2015年北京市流感病原学监测阳性的67份咽拭子样本,同时采用快速提取法及离心柱提取法提取病毒核酸,经实时荧光PCR法进行定性、定量检测,检测结果采用SPSS19.0软件进行统计分析。结果快速提取法提取细胞培养液、鸡胚培养液中流感病毒核酸的最低检测限高于离心柱法10倍,咽拭子样本则高100倍;快速提取法提取核酸后检测到的病毒载量均低于离心柱法,其中对含有病毒量较高的毒株检测到的病毒载量低于离心柱法10倍,而对病毒量较少的咽拭子样本,则低100倍;快速提取法稳定性优于离心柱法;提取后的核酸-80℃保存10 d后冻融复测,快速提取法核酸损失量大于离心柱法。67份离心柱提取法检测阳性咽拭子样本使用快速提取法提取核酸后检测,两种方法阳性符合率总计为92.54%,其中10~102拷贝/ml组,阳性符合率为76.92%,102~103拷贝/ml组,阳性符合率为92.59%,〉103拷贝/ml组,阳性符合率为100%。结论快速提取法具有稳定性高、易于操作、不易污染的优势,适用于细胞培养液、鸡胚培养液等病毒含量较高的大量样本中流感病毒核酸提取,适于检测样本量大、人手不足、设备欠缺的基层实验室使用;但-80℃冻融后核酸损失量较大,不宜反复冻融后使用;传统的离心柱法对于病毒含量较少的咽拭子样本及核酸需被反复冻融使用时具有优势。

一种快速核酸提取试剂在流感病毒检测中的应用评价

目的评价一种快速核酸提取试剂在流感病毒检测中的可应用性,为流感病毒核酸快速提取检测提供技术参考。方法分别使用离心柱法、磁珠法和快速法核酸提取试剂对流感病毒MDCK细胞株的不同稀释度标本以及20份阳性咽拭子标本进行核酸提取,然后进行实时荧光PCR检测,用SPSS 21.0软件对结果进行统计分析,评价核酸快速提取方法的RNA提取效率。结果快速核酸提取试剂对不同稀释度的流感病毒细胞株提取效率要高于离心柱法和磁珠法,Ct值与离心柱法的差值中位数为-1.51(-1.18～-2.01),与磁珠法的差值中位数为-1.09(-0.83～-1.31),咽拭子标本检测结果也显示出快速法核酸提取试剂核酸提取效率高于离心柱法和磁珠法。3种检测方法检出率和重复性差异无统计学意义。结论快速提取试剂具有操作简单、时间短、对设备要求不高等优势,并且核酸提取效率优于离心柱法和磁珠法,提示快速提取试剂可以应用于流感病毒的核酸检测。

实时荧光重组酶聚合酶扩增在白色念珠菌检测中的初步应用

目的探讨实时荧光重组酶聚合酶扩增(RPA)在白色念珠菌检测中的初步应用效果。方法(1)取1mL白色念珠菌标准株及阴性对照菌铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、大肠杆菌、光滑念珠菌标准株菌液,使用酵母/细菌基因组试剂盒提取DNA。分析PCR、实时荧光定量PCR、实时荧光RPA检测白色念珠菌的特异性。(2)取1株白色念珠菌标准株,以光滑念珠菌为阴性对照菌,复苏摇菌并计数,10倍倍比稀释为1×10^7~1×10^1集落形成单位(CFU)/mL,同实验(1)提取DNA,分析PCR、实时荧光定量PCR、实时荧光RPA检测白色念珠球菌的灵敏性。统计实时荧光定量PCR扩增曲线达到阈值所需循环数及实时荧光RPA出现特异性扩增曲线所需时间,并与PCR结果进行比对。统计3种方法对白色念珠菌的检出下限及检出率,分析实时荧光RPA中白色念珠菌浓度与检测时间之间的相关性。(3)取1株白色念珠菌标准株,同实验(1)提取DNA,分别行PCR、实时荧光定量PCR、实时荧光RPA,统计3种方法检测总时长。(4)取31份疑似感染白色念珠菌的临床样本和1份棉拭子取材的白色念珠菌临床样本提取DNA,进行PCR与实时荧光RPA,统计阳性检出率。分别采用酵母/细菌基因组试剂盒、chelex-100加热煮沸法、液氮反复冻融法提取上述2种方法检测均出现阳性结果的临床样本的DNA。同前行实时荧光RPA检测(以光滑念珠菌为阴性对照菌)和PCR检测,阴性对照菌同实验(1),观察2种方法检测是否出现阳性结果,并统计实时荧光RPA中扩增曲线达到荧光阈值所需时间。对数据行线性相关分析和t检验。结果(1)3种方法检测中白色念珠菌均出现阳性结果,5种阴性对照菌均未出现阳性结果。(2)白色念珠菌菌液浓度越低,实时荧光定量PCR中扩增曲线达到阈值所需循环数越多,实时荧光RPA中出现特异性扩增曲线所需时间越长,PCR中凝胶条带的亮度越弱,3种检测方法中阴性对照菌均未出现相应的阳性结果。实时荧光RPA、PCR与实时荧光定量PCR中白色念珠菌的检出下限均为1×10^1CFU/mL。实时荧光RPA中白色念珠菌浓度与检测时间呈明显负相关,r=-0.95,P<0.01。PCR与实时荧光定量PCR对1×10^1~1×10^7CFU/mL的白色念珠菌的阳性检出率均为100%。实时荧光RPA对1×101CFU/mL的白色念珠菌的阳性检出率为78%,对1×10^2~1×10^7CFU/mL的白色念珠菌的阳性检出率均为100%。(3)PCR、实时荧光定量PCR、实时荧光RPA检测白色念珠菌的总时间分别为133、93、35min。(4)实时荧光RPA对31份疑似感染白色念珠菌临床样本的阳性检出率为32.26%(10/31),低于PCR的35.48%(11/31)。11份临床样本经实时荧光RPA与PCR检测均出现阳性结果,阴性对照菌均未出现阳性结果。采用酵母/细菌基因组提取试剂盒、chelex-100加热煮沸法提取DNA进行实时荧光RPA,扩增曲线达到阈值所需时间分别为(438±13)、(462±12)s,二者相近(t=1.32,P>0.05)。液氮反复冻融法提取DNA进行实时荧光RPA,扩增曲线达到阈值所需时间为(584±15)s,明显长于另外2种方法(t=7.55、6.39,P<0.01)。结论实时荧光RPA检测白色念珠菌具有检测快速、操作简单、灵敏性高、特异性好等优点,值得临床推广应用。

基于CRISPR/Cas12a的核酸便捷化检测方法和现场快速便携式检测装置

核酸检测是病原体检测的必备流程,也是提升重大疾病和传染病应对能力、实施精准医疗的关键,在疾病防控、临床诊断、生物安全、环境监测等领域被广泛应用。目前临床上常用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)方法进行核酸检测,但该方法的检测周期较长,且对实验室环境、硬件设备等的要求较高。本文提出了一种基于CRISPR/Cas12a(Cpf1)的核酸便捷化检测方法,并设计了一种现场快速便携式检测装置。基于前期开发的新型管中管耗材,本团队建立了基于肉眼或智能手机识别检测结果的单样本便捷核酸检测方法,并开发设计了多样本同时自动化检测的便携式小型化装置以及基于同轴光纤的荧光检测光路。基于上述方法和装置对新型冠状病毒核酸进行检测,检测灵敏度低于10 copy/μL,检测时间可缩短至32 min,检测过程中无需开盖,适用于家庭自检或现场快速检测。