微RNA-196a-1-3p靶向Ras响应元件结合蛋白调控胆管癌细胞增殖的机制研究

目的探讨转化生长因子β(TGF-β)调控人胆管癌细胞系RBE细胞增殖的关键微RNA(miRNA)及其潜在的机制。方法该研究起止时间为2020年1月至2022年1月。磷酸盐缓冲液(PBS)处理为对照组,TGF-β处理为TGF-β组,TGF-β抗体处理为抗体组。检测三组RBE细胞的增殖水平。miRNA高通量测序检测三组RBE细胞的miRNA调控变化,并进行miRNA模拟物过表达筛选鉴定受TGF-β调控的影响RBE细胞增殖水平的关键miRNA。miRNA数据库(miRDB)在线分析miRNA的潜在底物,并通过小干扰RNA(siRNA)敲低筛选鉴定影响RBE细胞增殖水平的关键底物。结果相比于对照组,TGF-β组RBE细胞的增殖水平上升(1.62±0.07比2.35±0.09,P<0.05),抗体组RBE细胞的增殖水平下降(1.62±0.07比1.11±0.08,P<0.05)。过表达微RNA-196a-1-3p(miR-196a-1-3p)时,RBE细胞的增殖水平下降(P<0.05)。敲低Ras响应元件结合蛋白(RREB1)时,RBE细胞的增殖水平下降(P<0.05)。过表达miR-196a-1-3p后,RBE细胞中RREB1的信使RNA(mRNA)和蛋白水平下降(P<0.05)。敲低miR-196a-1-3p后,RBE细胞中RREB1与SMAD家族蛋白3(SMAD3)的相互作用增加。敲低SMAD3后,RBE细胞的增殖水平下降(P<0.05)。与仅敲低SMAD3相比,敲低SMAD3的同时过表达RREB1的RBE细胞的增殖水平无显著变化,并且同时敲低SMAD3和miR-196a-1-3p的RBE细胞的增殖水平无显著变化。结论TGF-β能够通过miR-196a-1-3p/RREB1/SMAD3轴促进RBE细胞增殖;miR-196a-1-3p和RREB1可作为潜在的治疗胆管癌的靶标,为针对该靶标的新药研发奠定了基础。

RasGRP1启动子区甲基化对脂多糖诱导人T淋巴细胞炎症的作用及机制

目的探讨RAS鸟苷酸释放蛋白1(RasGRP1)启动子区甲基化对脂多糖(LPS)诱导人T淋巴细胞炎症的作用及机制。方法人T淋巴细胞白血病细胞JurkatE6-1培养至对数生长期,分为对照(完全培养基,C)组、1 mg/L(低浓度)LPS(L1)组、10 mg/L(高浓度)LPS(L2)组及10μmol/L甲基化转移酶抑制剂5-Aza-2′-脱氧胞苷+10 mg/L LPS(LA)组,干预5 d,置于荧光显微镜下观察细胞形态变化;离心收集细胞、留取上清液,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和比色法检测各组细胞中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)浓度及乳酸脱氢酶(LDH)活性,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组细胞中RasGRP1、细胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2、TNF-α、IL-6、DNA甲基转移酶(DNMT)1、DNMT3a mRNA的表达,采用Western blotting法检测各组细胞RasGRP1、ERK1/2及p-ERK1/2蛋白的表达,采用甲基化特异性PCR(MSP)法和琼脂糖凝胶电泳检测RasGRP1启动子区甲基化状态。结果光学显微镜结果显示,C组JurkatE6-1细胞生长状态良好,L1组、L2组细胞数量明显减少,细胞形态趋于碎片化,死亡细胞逐渐增加,随LPS浓度增加而增加;LA组较L2组细胞数量及形态明显好转;与C组比较,L1组JurkatE6-1细胞炎症因子表达升高(P<0.05),细胞RasGRP1、p-ERK1/2表达升高(P<0.05),DNMT1和DNMT3a mRNA表达无差异(P>0.05),RasGRP1启动子区未检测到甲基化表达;与L1组比较,L2组细胞炎症因子表达升高(P<0.05),细胞RasGRP1、p-ERK1/2表达降低(P<0.05),DNMT1和DNMT3a mRNA表达升高(P<0.05),RasGRP1启动子区呈现高甲基化表达;与L2组比较,LA组细胞炎症因子表达降低(P<0.05),细胞RasGRP1、p-ERK1/2表达升高(P<0.05),DNMT1和DNMT3a mRNA表达降低(P<0.05),RasGRP1启动子区未检测到甲基化表达;各组间ERK1/2总量比较无差异(P>0.05)。结论抑制RasGRP1启动子区高甲基化可减轻LPS诱导的人T淋巴细胞炎症损伤,其机制可能是与调控下游ERK信号通路有关。

Hp、RASAL2、CDH1及TP53对胃癌前病变与早期胃癌的鉴别诊断价值

目的探讨幽门螺杆菌(Hp)、RAS蛋白激活样因子2(RASAL2)、钙黏蛋白1(CDH1)及肿瘤抑制基因P53(TP53)对胃癌前病变与早期胃癌的鉴别诊断价值。方法选取2021年6月至2023年6月收治的早期胃癌52例,根据1:1选例原则另选取同期胃癌前病变52例、胃炎52例,分别纳入胃癌组、癌前组、胃炎组。比较3组及不同病理特征的早期胃癌患者Hp、RASAL2、CDH1、TP53阳性表达率,比较胃癌组Hp阳性、阴性患者RASAL2、CDH1、TP53阳性表达率,采用Spearman相关分析探讨各指标阳性表达与早期胃癌患者部分病理特征的相关性,采用受试者工作特征(ROC)曲线分析联合检测对早期胃癌及胃癌前病变的鉴别诊断价值。结果3组Hp、CDH1、TP53阳性表达率胃癌组>癌前组>胃炎组,RASAL2阳性表达率胃癌组<癌前组<胃炎组,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。胃癌组Hp阳性患者CDH1、TP53阳性表达率高于Hp阴性患者,RASAL2阳性表达率低于Hp阴性患者(P<0.05,P<0.01);早期胃癌患者Hp、RASAL2、CDH1、TP53阳性表达率在肿瘤浸润深度及淋巴结转移方面比较差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。Hp、CDH1、TP53阳性表达与早期胃癌肿瘤浸润深度、淋巴结转移均呈正相关,RASAL2阳性表达与之呈负相关(P<0.01)。ROC曲线分析结果显示,Hp、RASAL2、CDH1、TP53联合诊断胃癌前病变的曲线下面积(AUC)为0.904(95%CI:0.846,0.945),联合诊断早期胃癌的AUC为0.894(95%CI:0.819,0.946)。结论Hp、CDH1、TP53在早期胃癌组织中阳性表达率较高,RASAL2阳性表达率较低,联合检测对胃癌前病变及早期胃癌具有一定鉴别诊断价值,可作为临床鉴别诊断胃癌前病变、早期胃癌的辅助指标。

瑞马唑仑调节EPAC1/RAP1信号通路对急性心肌梗死大鼠心肌损伤的影响

目的探讨瑞马唑仑调节环腺苷酸激活的交换蛋白1(EPAC1)/RAS相关蛋白1(RAP1)信号通路对急性心肌梗死(AMI)大鼠心肌损伤的影响。方法将大鼠按照随机数字表法分为假手术组、模型组、瑞马唑仑组、瑞马唑仑+8-CPT(EPAC1的激动剂)组,每组20只。除假手术组外,其余各组大鼠通过左前降支结扎法构建AMI大鼠模型;小动物超声仪检测心功能指标;HE染色检测心肌组织病理情况;化学比色法检测大鼠心肌组织超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平;JC-1染色法检测大鼠心肌细胞线粒体膜电位;TUNEL染色检测心肌细胞TUNEL阳性率;Western blot检测心肌组织EPAC1、RAP1、胱天蛋白酶3(Caspase-3)蛋白表达水平。结果与假手术组相比,模型组大鼠心肌组织结构被严重破坏且浸润大量炎性细胞;心功能指标左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD),心肌组织MDA水平,心肌细胞TUNEL阳性率,心肌组织EPAC1、RAP1、Caspase-3蛋白表达水平均明显升高;左心室射血分数(LVEF)、左心室短轴缩短率(LVFS),心肌组织SOD水平,心肌细胞线粒体膜电位明显降低(P<0.05)。与模型组相比,瑞马唑仑组大鼠心肌损伤缓解,炎性细胞浸润减轻,心功能指标LVEDD、LVESD,心肌组织MDA水平,心肌细胞TUNEL阳性率,心肌组织EPAC1、RAP1、Caspase-3蛋白表达水平均明显降低;LVEF、LVFS,心肌组织SOD水平,心肌细胞线粒体膜电位明显升高(P<0.05)。EPAC1的激动剂减弱了瑞马唑仑对AMI大鼠心肌损伤的缓解作用。结论瑞马唑仑可能通过抑制EPAC1/RAP1信号通路抑制心肌细胞凋亡,减轻AMI大鼠心肌损伤。

2型糖尿病合并结直肠癌患者癌组织中Ras ERK1/2蛋白表达及意义

目的:研究目的通过检测2型糖尿病合并结直肠癌中Ras-ERK1/2信号表达水平,分析它们与淋巴结转移的关系及其与生存状况的相关性。方法:选择石家庄市人民医院2019年3月到2021年1月期间行结肠癌手术治疗患者59例,按是否同时伴发糖尿病,分为糖尿病组(n=29)和非糖尿病组(n=30)。通过免疫组织化学方法检测两组患者手术切除的癌组织中Ras、ERK1/2蛋白的表达水平。运用Log-rank法分析不同表达情况下淋巴结转移的差异。所有患者随访36个月,统计并比较两组间患者的生存情况,采用spearman相关性分析法分析Ras、ERK1/2表达与生存期相关性。结果:Ras、ERK1/2在结直肠癌组和结直肠癌合并2型糖尿病中均有表达,且主要集中在癌细胞浆中;与非糖尿病组相比,结直肠癌合并2型糖尿病组中Ras、ERK1/2阳性表达率显著升高(P<0.05);结直肠癌合并2型糖尿病组患者淋巴结转移率较单纯结直肠癌组明显升高(P<0.05);与Ras、ERK1/2阴性表达组相比,Ras、ERK1/2阳性表达组患者的淋巴结转移率明显升高(P<0.05)。经spearman相关性分析结果显示,结直肠癌患者Ras、ERK1/2蛋白表达与中位生存时间呈负相关(P<0.05)。结论:Ras-ERK1/2蛋白阳性表达与淋巴结转移正相关,与患者生存期呈负相关,可将其作为早期诊断结直肠癌、判断预后的重要靶点。

结肠癌组织RASGRF1蛋白表达与基因甲基化状态变化及其临床意义

目的探讨结肠癌组织Ras蛋白特异性鸟苷酸释放因子1(RASGRF1)蛋白表达与基因甲基化状态变化及其临床意义。方法取手术切除的结肠癌组织及其配对的癌旁正常组织各81例份,采用免疫组化法检测RASGRF1蛋白表达,采用甲基化特异性PCR法检测RASGRF1基因甲基化状态。分析RASGRF1蛋白表达与基因甲基化状态以及二者与患者临床病理特征的关系。结果结肠癌组织RASGRF1蛋白阳性表达率明显低于癌旁正常组织(χ^2=51.995,P<0.01),RASGRF1基因甲基化阳性率明显高于癌旁正常组织(χ^2=44.100,P<0.01)。结肠癌组织RASGRF1蛋白阳性表达与RASGRF1基因甲基化阳性呈负相关关系(ρ=-0.486,P<0.05)。结肠癌组织RASGRF1蛋白阳性表达与肿瘤TNM分期、淋巴结转移有关(P均<0.05),与患者性别、年龄、肿瘤直径、组织分化程度无关(P均>0.05);结肠癌组织RASGRF1基因甲基化阳性与肿瘤TNM分期、淋巴结转移有关(P均<0.05),与患者性别、年龄、肿瘤直径、组织分化程度无关(P均>0.05)。结论结肠癌组织RASGRF1蛋白低表达、RASGRF1基因甲基化异常升高,二者呈负相关关系,且均与肿瘤TNM分期和淋巴结转移有关。

RASAL1基因在胃癌组织中的表达及其临床意义

目的:探讨Ras蛋白激活物类似物-1(RASAL1)基因在胃癌组织中的表达情况及临床意义.方法:应用免疫组织化学SP法分别检测50例正常组织、50例低级别上皮内瘤变组织、50例高级别上皮内瘤变组织+早期胃癌组织及50例进展期胃癌组织中RASAL1基因的表达,并结合其临床病理资料进行综合分析.结果:RASAL1基因在正常组、低级别上皮内瘤变组、高级别上皮内瘤变+早期胃癌组及进展期胃癌组的阳性率分别为94.0%(47/50)、70.0%(35/50)、42.0%(21/50)及18.0%(9/50),各组之间的差异有统计学意义(均P<0.05);各组RASAL1基因的表达与性别、年龄、生长部位等均无相关性;高级别上皮内瘤变组织+早期胃癌组和进展期胃癌组中RASAL1基因的表达与肿瘤大小、分化程度、浸润深度及淋巴结转移有相关性(均P<0.05).结论:RASAL1基因的低表达与胃癌的发生及进展有密切关系,检测胃癌组织中RASAL1的表达可反映肿瘤大小、分化程度、浸润深度及有无淋巴结转移.

HB-EGF对HSC-T6细胞Ras/ERK通路的激活及对MMP-2、TIMP-1表达的影响

目的观察肝素结合性表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)激活肝星状细胞(HSC)过程中Ras/ERK信号通路的变化和对金属基质蛋白酶(MMP)及其抑制物的影响。方法传代培养HSC-T6细胞,分空白对照组、HB-EGF处理组(20,40,80ng/mL),采用QRT-PCR法检测MMP-2、金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)及表皮生长因子受体(EGFR)mRNA的表达,并确定HB-EGF刺激HSC-T6Ras/ERK通路(ERK1、ERK2、P38MAPK)活化的最佳浓度及最佳时间,检测该通路活化情况。结果 QRT-PCR检测提示,MMP-2的表达随HB-EGF干预时间的延长增加,TIMP-1的表达随干预时间的延长递减;40ng/mL HB-EGF培养HSC-T6 48h后,EGFR mRNA的表达较空白对照组明显上调(P<0.05);选择40ng/mL HB-EGF培养48h为最佳刺激时间与浓度,该处理组ERK1mRNA的表达较空白对照组明显上调(P<0.05),但ERK2、P38MAPK的变化无统计学意义;Western-blot检测提示该处理组ERK1蛋白的表达较空白对照组上调(P<0.05)。结论HB-EGF可影响HSC-T6的MMP-2、TIMP-1的表达;HB-EGF通过促进HSC-T6表达EGFR、ERK1,有效激活细胞内Ras/ERK信号通路。

肿瘤相关基因RASAL1在结肠癌中的表达及临床意义

目的:探讨Ras三磷酸鸟苷酶激活样蛋白(RASAL1)及基因在人结肠癌中的表达及其与临床病理参数间的关系.方法:收集2009-04/2010-05经手术切除的结肠腺癌标本50例作为研究组,相应正常组织为对照组,做成蜡块标本;其中20例另取其癌组织、癌旁组织及正常组织的新鲜标本;用免疫组织化学染色观察50例蜡块标本RASAL1蛋白的表达;用RT-PCR检测20例新鲜标本RASAL1 mRNA的表达,并分析其与临床病理参数的关系.结果:RASAL1蛋白主要在细胞质中表达;RASAL1蛋白在结肠癌中的阳性表达率明显低于癌旁组织及正常组织[46%(23/50)vs85%(17/20),96%(48/50),均P<0.05];RASAL1 mRNA在结肠癌中的阳性表达率较癌旁组织及正常组织明显减低[50%(10/20)vs90%(18/20),95%(19/20),均P<0.05],RASAL1蛋白与mRNA的表达呈明显正相关(r=0.686,P<0.01),与肿瘤的分化程度(P<0.05)、侵袭深度(P<0.01)、淋巴结转移(P<0.05)、TNM分期(P<0.05)呈负相关.结论:RASAL1在结肠腺癌组织中低表达,且与分化程度及进展阶段负相关;RASAL1有可能成为结肠癌治疗的一个新靶点.

RASAL1基因启动子甲基化及RAS活性与结肠癌临床病理的关系

目的:检测RASAL1(ras GTPase-activatinglike protein 1)基因甲基化率及RAS活性在人结肠癌组织中的表达,探讨其与临床病理资料间的关系.方法:以40例结肠癌标本为研究对象,相应的正常组织标本为对照.甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)检测RASAL1启动子CpG岛甲基化状态,免疫共沉淀法检测RAS活性,分析肿瘤组织中RASAL1基因甲基化率及RAS活性与临床病理参数间的关系.结果:40例肿瘤组织中有26例检测出RASAL1基因甲基化(26/40,67.5%),对照组40例中有12例出现甲基化(12/40,30%),肿瘤组织甲基化率明显高于正常组织(P=0.0017).肿瘤组织中RAS活性的中位数为1.07,正常组织中RAS活性的中位数为0.52,P<0.001,差异有统计学意义.结肠癌组织中RASAL1基因的甲基化率、RAS活性与患者肿瘤分化程度、侵袭深度、淋巴结转移、TNM分期有统计学差异(均P<0.05).结论:RASAL1甲基化状态与RAS活性增加有关,可能在结肠癌的发生发展中起重要作用.抑制RASAL1甲基化及RAS活性,可能成为治疗结肠癌的新靶点.

胃癌组织中RASGRF1基因甲基化及蛋白表达与其临床意义

目的:探讨胃癌组织中Ras蛋白特异性鸟苷酸释放因子1(RASGRF1)基因甲基化及蛋白表达以及临床意义。方法:收集80例胃癌病人病历资料,采用免疫组织化学法检测80例胃癌组织和相应癌旁组织中RASGRF1蛋白表达情况,采用甲基化特异性PCR检测RASGRF1基因甲基化状态,分析胃癌组织中RASGRF1基因甲基化及蛋白表达的相关性,并观察胃癌组织中RASGRF1基因甲基化状态及蛋白表达情况与病人临床病理参数的关系。结果:胃癌组织和相应癌旁组织中RASGRF1蛋白表达与基因甲基化表达情况差异均有统计学意义(P<0.05);Spearman相关分析结果显示,胃癌组织中RASGRF1蛋白表达与基因甲基化呈负相关关系(P<0.01);胃癌组织中RASGRF1蛋白表达与性别、年龄、肿瘤直径、组织学分化程度、发生远处转移无关(P>0.05),与肿瘤分期有关(P<0.05);胃癌组织中RASGRF1基因甲基化与性别、年龄、肿瘤直径、组织学分化程度无关(P>0.05),与肿瘤分期、发生远处转移有关(P<0.05和P<0.01)。结论:胃癌组织中RASGRF1基因甲基化和蛋白表达二者呈负相关关系,RASGRF1基因甲基化及蛋白表达与肿瘤分期、发生远处转移有一定关系。

骨肉瘤组织中RASSF1A基因启动子区甲基化状态观察及意义

目的观察骨肉瘤组织中Ras相关区域家族1A(RASSF1A)基因启动子区域的甲基化状态,并探讨其临床意义。方法应用甲基化特异性PCR(MSP)技术检测30例骨肉瘤组织及瘤旁组织中RASSF1A基因启动子区域的甲基化状态。结果骨肉瘤组织中RASSF1A基因启动子区域发生甲基化14例(46.7%),瘤旁组织中4例(13.3%),两者比较,P<0.05。RASSF1A基因启动子区甲基化与骨肉瘤患者的性别、年龄及血清碱性磷酸酶水平有关(P均<0.05)。结论骨肉瘤组织中RASSF1A基因启动子区甲基化发生率高,其可能在骨肉瘤的发生发展中发挥重要作用。

皮肤鳞状细胞癌组织中miR-21、miR-31、Ras GTP酶激活蛋白1表达与人乳头瘤病毒的相关性研究

目的:测定皮肤鳞状细胞癌(CSCC)组织中人乳头瘤病毒(HPV)、miR-21及miR-31的表达量,分析HPV感染与miRNA之间的相关性,并探讨miR-31可能的致癌机制。方法:采用HPV DNA检测试剂盒和巢式聚合酶链式反应(PCR)检测CSCC组和正常对照组中HPV表达情况,实时荧光定量PCR分别测定HPV阳性和阴性CSCC组织中miR-21及miR-31的表达量,免疫组化检测CSCC组织中Ras GTP酶激活蛋白(RASA)1表达水平。结果:CSCC组织中HPV检出率为18.29%(15/82)。miR-21和miR-31在CSCC组织中相对表达量分别为0.2750±0.2280和0.0130±0.0220,均高于正常对照组(0.0110±0.0190、0.0002±0.0002),差异均有统计学意义(P均<0.05);RASA1蛋白在CSCC组织中表达明显减少(P<0.05)。在HPV阴性组织中RASA1蛋白表达与miR-31水平呈负相关(r=-0.588,P<0.05)。结论:HPV可能在CSCC发展早期起一定作用;miR-31可能是HPV相关性miRNA;高表达的miR-31可能通过下调RASA1促进细胞增殖,参与CSCC的发生及发展。

RAS蛋白激酶类似物-1和细胞外信号调节激酶在胃癌中的表达及其临床意义

目的:研究观察胃癌及癌旁组织中Ras蛋白激酶类似物-1(Ras protein activator like 1,RASAL1)和细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)的表达情况,并分析其与胃癌临床病理特征的关系.方法:采用免疫组织化学方法检测60例胃癌组织及其对应癌旁组织中RASAL1、ERK以及磷酸化ERK(p-ERK)的表达水平,并结合胃癌临床病理资料进行分析.结果:RASAL1在胃癌组织中呈弱表达或者无表达,而在癌旁组织中呈强阳性表达,两组间表达差异有统计学意义(秩均数分别为35.84和85.16,P<0.001).ERK在胃癌和癌旁组织中表达无明显差异(秩均数分别为60.68和60.33,P>0.05).p-ERK在胃癌组织中的水平明显高于癌旁组织中的水平,两组间表达差异有统计学意义(秩均数分别为84.93和36.07,P<0.001),且RASAL1的表达下降、p-ERK的过度表达与肿瘤大小、分期、浸润深度、分化程度及淋巴结转移明显相关(均P<0.05).结论:RASAL1低表达和p-ERK过度表达可能与胃癌的发生、发展有关,而RASAL1可能通过调控ERK的活化,使之成为p-ERK,促进胃癌发生及进展.

慢病毒介导Ras-GRF1调控肝癌干细胞干性维持与自我更新能力的机制

目的:探究Ras蛋白特异性的鸟苷酸释放因子1(Ras protein specific guanylate releasing factor 1,Ras-GRF1)在肝癌干细胞(cancer stem cells,CSC)生物学特性及自我更新中的作用,并初步探究其作用机制。方法:实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测人正常肝细胞系(HL-7702)和不同肝癌细胞系(Huh7、HepG2、Hep3B、CLC4、CLCl3、SMMC-7721)中Ras-GRF1表达水平;流式细胞术分选出肝癌干细胞,利用Ras-GRF1-pCMV6-GFP重组慢病毒感染肝癌干细胞,MTT法、EdU染色和平板克隆形成实验检测过表达Ras-GRF1对肝癌干细胞增殖能力的影响;Transwell小室实验检测过表达Ras-GRF1后肝癌干细胞迁移与侵袭变化;成球实验检测过表达Ras-GRF1后肝癌干细胞的自我更新能力;蛋白免疫印迹(Western blot)检测肿瘤干细胞中Hippo信号通路关键蛋白大肿瘤抑制因子(large tumor suppressor,LATS)、Yes协同蛋白(Yes cooperative protein,YAP)和哺乳动物STE20样蛋白激酶(mammalian STE20-like protein kinase,MST)的蛋白及磷酸化表达水平。结果:不同肝癌细胞中Ras-GRF1 mRNA表达量较人正常肝细胞中显著降低(P<0.05);分离到的肝癌干细胞在感染Ras-GRF1-pC MV6-GFP重组慢病毒后,细胞中RasGRF1 mRNA表达量显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);在两种肝癌干细胞HepG 2-CSC和SMMC-7721-CSC中,相较于空白对照组,Ras-GRF1-pC MV6组细胞增殖活性显著降低,EdU阳性染色数目和细胞克隆形成数目均显著减少,细胞迁移与侵袭数目也均显著减少,细胞成球能力明显降低,p-LATS/LATS、pYAP/YAP及p-MST/MST蛋白表达显著增加,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:通过慢病毒介导Ras-GRF1在肝癌干细胞中过表达后,能够抑制肝癌干细胞的增殖、迁移与侵袭,降低自我更新能力,其机制可能与调控Hippo信号通路相关。

缺氧肾小管上皮细胞Rab7/Caveolin-1/MMP-2轴失调促进肾纤维化

目的:研究肾纤维化晚期Ras相关GTP结合蛋白7(Ras-related GTP binding protein 7,Rab7)可否通过小窝蛋白-1(Caveolin-1)的介导调节基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)的活性,从而对肾纤维化产生影响。方法:通过单侧输尿管结扎(unilateral ureteral obstruction, UUO)法构建C57BL/6小鼠肾纤维化模型,检测肾纤维化组织中缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)、Rab7和Caveolin-1的表达以及MMP-2的活性。利用肾小管上皮细胞株(HK-2)进行体外实验,构建HK-2 Rab7-shRNA细胞,将HK-2和HK-2 Rab7-shRNA细胞分别进行常氧和缺氧培养,并检测各组中HIF-1α、Rab7、Caveolin-1的表达和MMP-2的活性,以及纤维化相关指标I型胶原(Collagen-1)、波形蛋白(Vimentin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)的表达。结果:利用小鼠UUO模型发现,相较正常肾脏组织,肾纤维化组织中Rab7和Caveolin-1的表达均上调,而MMP-2的活性反而下降。进一步体外实验显示,在HK-2细胞中Rab7下调后可通过抑制Caveolin-1的表达进而提高MMP-2的活性,并会使Collagen-1、Vimentin和α-SMA等反映纤维化的指标表达下调。结论:Rab7与MMP-2的活性密切相关;Rab7对MMP-2活性的调节通过Caveolin-1介导;当Rab7表达受抑后,可促进肾纤维化的缓解。

Ras鸟苷酸释放蛋白1、垂体同源框1、消皮素D在皮肤黑色素瘤中的表达及相关性研究

目的探讨Ras鸟苷酸释放蛋白1(RASGRP1)、垂体同源框1(PITX1)、消皮素D(GSDMD)在皮肤黑色素瘤中的表达及诊断价值。方法选取2013年1月至2019年12月在该院诊治的72例皮肤黑色素瘤患者为研究组,对其癌组织、癌旁组织标本进行免疫组化染色,同时选取同期在该院进行整形手术的皮肤正常者40例为对照组。对待测标本中RASGRP1、PITX1、GSDMD表达进行检测,对比、分析RASGRP1、PITX1、GSDMD在不同临床特征皮肤黑色素瘤中的表达,探讨三者间的相关性及对皮肤黑色素瘤的诊断价值。结果与对照组比较,研究组癌组织中RASGRP1、PITX1表达降低,GSDMD表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。RASGRP1、PITX1、GSDMD的表达与皮肤黑色素瘤患者性别、年龄无关(P>0.05),与肿瘤最大径、浸润深度、分化程度、淋巴结转移、其他部位转移、预后情况、临床分期有关(P<0.05),且肿瘤最大径≥2 cm、ClarkⅢ~Ⅴ期、低分化、淋巴结转移、其他部位转移、预后不良、Ⅳ期皮肤黑色素瘤患者RASGRP1、PITX1表达较低,GSDMD表达较高(P<0.05)。Pearson相关分析显示,RASGRP1与PITX1呈正相关(r=0.523,P=0.001),RASGRP1与GSDMD呈负相关(r=-0.612,P=0.001),PITX1与GSDMD呈负相关(r=-0.569,P=0.001)。RASGRP1、PITX1、GSDMD联合检测对皮肤黑色素瘤的诊断价值优于单项检测(P<0.05)。结论RASGRP1、PITX1在皮肤黑色素瘤组织中低表达,GSDMD呈高表达,RASGRP1、PITX1、GSDMD可作为皮肤黑色素瘤的检测指标。

HPVE2/E6、CDCP1、RASSF2A甲基化水平与局部免疫、HR-HPV持续感染的关系

目的探讨人乳头瘤病毒(HPV)E2/E6、含CUB结构域蛋白1(CDCP1)、RAS相关结构域蛋白2A基因(RASSF2A)甲基化水平与宫颈病变级别、局部免疫的关联性。方法选取2018年1月至2020年6月海口市妇幼保健院诊治的158例高危型HPV(HR-HPV)感染患者作为研究对象。比较不同宫颈病变级别患者HPVE2/E6、CDCP1、RASSF2A甲基化水平,并给予重组人干扰素治疗,根据治疗效果分为转阴组(n=132)、持续感染组(n=26),比较两组HPVE2/E6、CDCP1mRNA、RASSF2AmRNA、局部免疫功能水平及其相关性,探讨HR-HPV持续感染影响因素,评估上述指标预测HR-HPV持续感染的效能。结果高级别宫颈上皮内病变(HSIL)患者CDCP1阳性率、RASSF2AmRNA、CDCP1mRNA高于无宫颈上皮内病变(NSIL)、低级别宫颈上皮内病变(LSIL)患者,HPVE2/E6、RASSF2AmRNA低于NSIL、LSIL患者(P<0.05)。HPVE2/E6、RASSF2AmRNA与CD4^(+)呈正相关,与CD8^(+)呈负相关;CDCP1mRNA与CD4^(+)呈负相关,与CD8^(+)呈正相关(P<0.05);HPVE2/E6、CDCP1mRNA、RASSF2AmRNA是HR-HPV持续感染的重要影响因素(P<0.05);HPVE2/E6+CDCP1mRNA+RASSF2AmRNA预测HR-HPV持续感染的AUC最大,为0.887。结论HPVE2/E6、CDCP1、RASSF2A甲基化水平与宫颈病变级别、局部免疫密切相关,联合应用对临床预测HR-HPV持续感染、评估宫颈病变级别、预防宫颈癌变发生具有较高的临床应用价值。

电针早期干预对肌萎缩侧索硬化症小鼠大脑皮层TDP-43及HMGB1/RhoA信号通路的影响

目的:观察电针早期干预对肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)小鼠大脑皮层TARDNA结合蛋白43(TARDNA binding protein,TDP-43)及HMGB1/RhoA信号通路表达的影响,探究电针早期干预改善ALS小鼠运动功能的潜在机制。方法:符合SOD1G93A基因表型小鼠按随机数字表法分为模型组(SOD1G93A)、针刺干预组(electroacupuncture,EA)、利鲁唑组(Riluzole),同窝SOD1G93A阴性小鼠为空白对照组(control),每组15只。电针组针刺干预百会穴、双侧天柱穴、双侧天枢穴,5次/7d,7d为一个疗程,共治疗4个疗程。利鲁唑组予利鲁唑30mg/(kg·d)灌胃治疗,1次/d,5次/周,持续2周。采用后肢功能神经学评分和转棒疲劳实验评估各组小鼠运动功能,免疫荧光法观察大脑皮层TDP-43阳性细胞率;Western Blot法检测大脑皮质离子钙结合接头分子1(Iba-1)、HMGB1、RhoA蛋白相对表达量;Elisa法检测血清TNF-α及MCP-1的含量;透射电镜观察大脑皮层神经元形态变化。结果:与对照组比较,模型组转棒潜伏期时间减少和神经学评分增高(P<0.01),血清MCP-1、TNF-α含量和大脑皮层Iba-1、HMGB1、RhoA蛋白表达以及TDP-43阳性细胞率均升高(P<0.01)。与模型组比较,电针组和利鲁唑组转棒潜伏期时间增加和神经学评分降低(P<0.01,P<0.05),血清MCP-1、TNF-α含量和大脑皮质Iba-1、HMGB1、RhoA蛋白表达以及TDP-43阳性细胞率均降低(P<0.01,P<0.05)。电镜结果显示,对照组小鼠皮层神经元细胞结构正常,模型组小鼠神经细胞有明显病理变化,电针组和利鲁唑组神经细胞损伤减轻,结构较完整,可见部分正常细胞器。结论:电针干预可改善ALS模型小鼠的运动功能,其机制可能与抑制HMGB1/RhoA信号通路进而减轻小胶质细胞诱导的神经炎症有关,并推测其对于减少ALS病理底物TDP-43的沉积具有正相关作用。

RASGRF1和PGAM1在胃癌组织中的表达及与临床病理特征和预后的关系

目的:探讨Ras蛋白特异性鸟苷酸释放因子1(RASGRF1)和磷酸甘油酸变位酶1(PGAM1)在胃癌组织中的表达及其与患者临床病理特征和预后的关系。方法:选取2014年2月-2016年10月于本院行手术治疗的85例胃癌患者为研究对象,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测胃癌组织和对应的癌旁组织中RASGRF1和PGAM1的mRNA表达,免疫组织化学法检测RASGRF1和PGAM1蛋白表达,分析RASGRF1和PGAM1蛋白表达与患者临床病理特征的关系。Kaplan-Meier法分析RASGRF1和PGAM1蛋白表达与患者预后的关系。Cox比例风险模型分析影响胃癌患者预后的多因素。结果:与癌旁组织比较,胃癌组织中RASGRF1的mRNA和蛋白阳性表达率均显著降低(P<0.05),PGAM1的mRNA和蛋白阳性表达率均显著升高(P<0.05)。胃癌组织中RASGRF1和PGAM1的蛋白表达均与肿瘤分化程度、TNM分期和淋巴结转移相关(P<0.05),而与患者年龄、性别和肿瘤直径无关(P>0.05)。Kaplan-Meier生存分析显示,胃癌组织中RASGRF1阳性表达的患者3年生存率显著高于阴性表达患者(P<0.05),PGAM1阳性表达的患者3年生存率显著低于阴性表达患者(P<0.05)。Cox分析结果显示,RASGRF1和PGAM1均是影响胃癌患者预后的独立因素(P<0.05)。结论:胃癌组织中RASGRF1呈低表达,PGAM1呈高表达,二者均可能参与胃癌的发生发展,有望成为胃癌诊断和预后判断的生物标志物。