采用X射线衍射解析人鸟嘌呤核苷酸解离刺激因子(RalGDS)Ras结合结构域的空间结构

Ras结合结构域(RBD)是鸟嘌呤核苷酸解离刺激因子(Ral GDS)家族成员C-端的高保守区,通过它连接Ras和Ras相关蛋白。利用Red Wings和SGC-1 screens相关的悬滴法设盘结晶,按体积比1∶1加蛋白液到含1∶100胞内蛋白酶Glu-C(w/w)的结晶溶液(2 mol/L(NH4)2SO4,0.2 mol/L Na Ac,0.1 mol/L HEPES,5%MPD,p H 7.5)中,晶体3天长成可组装大小。利用X-射线晶体衍射技术解析了人Ral GDS的Ras结合域(Ral GDS-RBD)的晶体结构,对比鼠和人Ral GDS-RBD,主要是Ras结合区的C-端不同。人Ral GDS-RBD通过Glu838和Glu840在Ral GDS和Ras蛋白间形成氢键,而在同一位点,鼠Ral GDS-RBD通过Asp820和Asp822形成氢键。人Ral GDS-RBD结构中含ββαββαβ-型三维结构的泛素样构象,一个单体的C-端残基与相邻单体的β折叠形成平行βββββ结构。

RASGRF1基因多态性与先天性白内障合并高度近视的关系

目的 探讨Ras特异性鸟嘌呤核苷酸释放因子(RASGRF1)基因多态性与先天性白内障(CC)合并高度近视的关系。方法 选取2020年4月至2022年3月该院的CC患儿186例为研究对象,根据是否合并高度近视分为两组,其中合并高度近视的105例患儿为A组,未合并高度近视的81例患儿为B组;另选取同期该院的体检健康者93例为对照组。比较CC患儿与体检健康者RASGRF1基因的单核苷酸多态性(SNP)分型与基因型频率,比较A、B两组RASGRF1基因的SNP分型与基因型频率及一般资料,采用Logistic回归分析RASGRF1基因rs8033417分型对CC合并高度近视患儿的独立作用。结果 CC患儿与体检健康者RASGRF1基因的SNP分型rs2870087、rs8033417、rs939658、rs4778879、rs12902831的基因型频率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。A组与B组RASGRF1基因的SNP分型rs8033417的基因型频率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。A组女性、年龄>12~14岁人数多于B组,眼轴长度、屈光度、黄斑区中心凹视网膜厚度大于B组,黄斑区上方、下方、鼻侧、颞侧视网膜厚度小于B组(P<0.05)。在未校正因素时,RASGRF1基因rs8033417分型为C/T-C/C的CC患儿发生高度近视的风险是T/T基因型患儿的0.476倍;在模型2、模型3中,RASGRF1基因rs8033417分型为C/T-C/C的CC患儿发生高度近视的风险分别是T/T基因型患儿的0.441倍、0.426倍(P<0.05)。结论 RASGRF1基因与CC密切相关,且其rs8033417分型是CC患儿发生高度近视的独立影响因素。当CC患儿RASGRF1基因rs8033417分型为C/T-C/C时,高度近视发生率较低。

Ras鸟苷酸释放蛋白家族的功能研究新进展

Ras鸟苷酸释放蛋白家族(Ras guanyl nucleotide releasing proteins,Ras GRPs)是鸟嘌呤核苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factors,GEFs)中的一员,由4种类型的蛋白质组成。Ras GRPs能通过交换鸟嘌呤核苷酸将Ras蛋白从无活性的GDP形式变成有活性的GTP形式,从而活化Ras。4种不同类型的Ras GRP蛋白拥有共同的分子结构。其结构包括一个由Ras交换中心和CDC25区域组成的催化中心,同时还拥有一对非典型的EF臂及C1端。异常表达的不同Ras GRP蛋白在不同的疾病发病过程中发挥作用。

食欲素A对脑外伤昏迷大鼠前额叶皮质Ras鸟嘌呤释放因子-1表达的影响

目的研究食欲素A(Orexin-A)对脑外伤昏迷大鼠的促醒作用及其对脑外伤后昏迷大鼠前额叶皮质中Ras鸟嘌呤释放因子-1(RasGRF1)蛋白表达的影响。方法将60只Sprague-Dawley大鼠随机分为5组:正常对照组、模型组、Orexin-A低剂量组、Orexin-A中剂量组和Orexin-A高剂量组,每组12只。采用自由落体撞击法建立脑外伤昏迷模型。应用立体定位注射技术,对正常对照组和模型组大鼠注射人工脑脊液,Orexin-A低剂量组、中、高剂量组大鼠分别注射不同浓度Orexin-A,观察行为学变化并使用western-blotting与免疫组织化学技术检测各组大鼠前额叶皮质中RasGRF1蛋白的表达量。结果正常对照组12只大鼠无昏迷,模型组0只苏醒,低剂量组4只苏醒,中剂量组中有8只大鼠苏醒,高剂量组2只苏醒;前额叶RasGRF1表达水平由低到高依次是:正常对照组<模型组<高剂量组<低剂量组<中剂量组(P<0.05)。结论 Orexin-A可显著改善脑外伤后大鼠的昏迷状态,其效果与浓度有关,作用机制可能与前额叶皮质区RasGRF1蛋白表达水平上调有关。

RASGRF1和PGAM1在胃癌组织中的表达及与临床病理特征和预后的关系

目的:探讨Ras蛋白特异性鸟苷酸释放因子1(RASGRF1)和磷酸甘油酸变位酶1(PGAM1)在胃癌组织中的表达及其与患者临床病理特征和预后的关系。方法:选取2014年2月-2016年10月于本院行手术治疗的85例胃癌患者为研究对象,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测胃癌组织和对应的癌旁组织中RASGRF1和PGAM1的mRNA表达,免疫组织化学法检测RASGRF1和PGAM1蛋白表达,分析RASGRF1和PGAM1蛋白表达与患者临床病理特征的关系。Kaplan-Meier法分析RASGRF1和PGAM1蛋白表达与患者预后的关系。Cox比例风险模型分析影响胃癌患者预后的多因素。结果:与癌旁组织比较,胃癌组织中RASGRF1的mRNA和蛋白阳性表达率均显著降低(P<0.05),PGAM1的mRNA和蛋白阳性表达率均显著升高(P<0.05)。胃癌组织中RASGRF1和PGAM1的蛋白表达均与肿瘤分化程度、TNM分期和淋巴结转移相关(P<0.05),而与患者年龄、性别和肿瘤直径无关(P>0.05)。Kaplan-Meier生存分析显示,胃癌组织中RASGRF1阳性表达的患者3年生存率显著高于阴性表达患者(P<0.05),PGAM1阳性表达的患者3年生存率显著低于阴性表达患者(P<0.05)。Cox分析结果显示,RASGRF1和PGAM1均是影响胃癌患者预后的独立因素(P<0.05)。结论:胃癌组织中RASGRF1呈低表达,PGAM1呈高表达,二者均可能参与胃癌的发生发展,有望成为胃癌诊断和预后判断的生物标志物。

首发精神分裂症患者血清RasGRP1与炎症因子水平和症状严重程度的关系

目的探讨首发精神分裂症(FES)患者血清Ras蛋白特异鸟嘌呤核苷酸释放因子1(RasGRP1)水平与炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平和精神症状严重程度的关系。方法选取48例FES患者(FES组)和30例健康人(对照组),采用酶联免疫吸附试验检测血清RasGRP1、IL-1β、IL-6、TNF-α水平,采用阳性与阴性症状量表(PANSS)评估精神症状严重程度。绘制ROC曲线,分析血清指标对FES的诊断价值。Pearson法分析FES患者血清RasGRP1水平与IL-1β、IL-6、TNF-α水平及PANSS评分的相关性。结果FES组血清RasGRP1、IL-1β、IL-6和TNF-α水平均高于对照组(P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,RasGRP1诊断FES的AUC高于IL-1β、IL-6和TNF-α(0.788 vs.0.614、0.695和0.547)(P<0.05)。FES患者血清RasGRP1水平与IL-1β、IL-6、TNF-α水平均呈正相关(r=0.587、0.701、0.412,P<0.05)。FES患者血清RasGRP1水平与PANSS阳性症状评分、阴性症状评分、总分均呈正相关(r=0.589、0.673、0.704,P<0.05)。结论FES患者血清RasGRP1水平升高,与IL-1β、IL-6、TNF-α水平呈正相关,并且与精神症状严重程度有关。

C3G/Rap1和Dock180/Rac1信号通路在卵巢癌浸润中的作用

目的探讨鸟嘌呤核苷酸交换因子C3G/Rap1酶和鸟嘌呤核苷酸交换因子Dock180/Rac1酶信号通路在卵巢癌浸润中的可能作用。方法 Western blot检测Dock180沉默的卵巢癌细胞SKOV3中C3G的表达,验证上皮性卵巢癌组织中Dock180与C3G的表达相关性;免疫组化比较卵巢癌组织中Dock180与C3G的表达趋势;免疫荧光观察SKOV3中Dock180与C3G及它们各自的下游蛋白Rac1/Rap1的定位。结果 Dock180基因沉默的细胞中C3G表达明显增强(P<0.05);Dock180与C3G在卵巢癌组织中的表达呈现相反趋势(P<0.05);C3G/Dock180均主要分布于细胞质,下游效应蛋白Rap1/Rac1在细胞膜和细胞质都有表达,但Rap1以细胞质为主,而Rac1可以伸展至细胞膜及细胞膜皱褶。结论卵巢癌细胞和组织中C3G与Dock180表达呈相反趋势,下游蛋白Rap1与Rac1在细胞内的定位分布差异,可能与C3G/Rap1和Dock180/Rac1信号通路在卵巢肿瘤浸润中的不同作用有关。

重组信号分子GRF的PH结构域抑制蛋白激酶C活性

目的 鉴定表达 guanine- nucleotide- releasing factor(GRF)的 pleckstrin homology(PH)结构域与谷胱甘肽转移酶 (GST)融合蛋白的可溶性 ,并进一步检测该重组蛋白与蛋白激酶 C(PKC)的结合及对 PKC活性的影响 .方法 将表达GRF的 PH结构域与 GST融合蛋白的菌体经超声裂解 ,上清中的融合蛋白用琼脂糖珠锚定纯化 .Western blot检测融合蛋白与 PKC的结合 ,以 PKC活性检测试剂盒测定结合后PKC的活性变化 .结果 获得信号分子 GRF的 PH结构域 -GST融合蛋白的可溶性表达 .Western blot结果表明 ,GRF的 PH结构域可在体外与 PKC结合 .PKC活性实验显示 ,GRF的 PH结构域抑制 PKC活性 .结论 GRF的 PH结构域可在体外与 PKC结合并对

鲜红斑痣相关基因及激酶的研究进展

鲜红斑痣是一种体细胞基因突变疾病,这种突变可改变正常血管内皮细胞的功能,导致血管畸形。在大部分鲜红斑痣/Sturge-Weber综合征患者中存在鸟嘌呤核苷酸结合蛋白q多肽(GNAQ)基因体细胞突变位点,且突变与部分临床表现密切相关。推测GNAQ基因突变可作为早期鲜红斑痣的预测因子指导早期干预治疗。RAS p21蛋白激活因子1(RASA1)的体细胞“二次突变”与鲜红斑痣伴发综合征毛细血管-动静脉畸形的发病有关。基因突变引起下游通路中的促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)等蛋白激酶活化,参与鲜红斑痣发生的不同阶段。深入研究鲜红斑痣相关GNAQ基因、RASA1基因和MAPK、PI3K等可为其早期诊断及分子治疗提供理论依据。

益气活血方调控cAMP/Epac1/Rap1信号改善冠心病气虚血瘀证大鼠的验证

目的:基于环磷酸腺苷(cAMP)/环磷酸腺苷调节鸟嘌呤核苷酸交换因子1(Epac1)/Ras-同源蛋白1(Rap1)信号通路探讨益气活血方对冠心病气虚血瘀证大鼠的心肌保护机制。方法:88只SPF级雄性SD大鼠,按随机数字表分为假手术组(n=12)和实验组(n=76),实验组大鼠采用限制饮食及力竭性游泳复合冠状动脉左前降支(LAD)结扎术构建冠心病气虚血瘀证模型,采集大鼠心电图,将造模成功后的实验组大鼠随机分为模型组、益气活血方低、中、高剂量组(4.28、8.55、17.1 g·kg^(-1))、西药组(单硝酸异山梨酯片,3.6 mg·kg^(-1)),连续给药4周;假手术组及模型组灌胃等体积双蒸水。末次给药后24 h取材,行心脏超声检测左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD),左室短轴缩短率(FS)、射血分数(EF),腹主动脉采血行血液流变学测定,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血浆cAMP水平;留取心肌组织进行苏木素-伊红(HE)染色、马松(Masson)染色观察心肌病理损伤情况,透射电镜观察心肌组织超微结构改变;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测心肌Epac1、Rap1GTP酶激活蛋白(Rap1GAP)及Rap1 mRNA表达,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测心肌Epac1、Rap1GAP及Rap1蛋白表达。结果:与假手术组比较,模型组大鼠的LVEDD、LVESD显著增加(P<0.01),EF及FS比率显著下降(P<0.01),表现出心功能减退的“心气虚”症状;全血黏度及血浆黏度显著升高(P<0.01),cAMP含量显著升高(P<0.01),心肌组织胶原纤维显著增生(P<0.01),心肌超微结构受损严重,表现出“血瘀”的病理改变;Real-time PCR结果显示模型组大鼠Epac1及Rap1 mRNA显著降低(P<0.01),Rap1GAP mRNA显著增加(P<0.01);Western blot显示Epac1蛋白表达显著降低(P<0.01),Rap1GAP蛋白表达明显增加(P<0.05);与模型组比较,益气活血方能改善冠心病气虚血瘀证大鼠心功能、降低血液黏度、降低血浆cAMP含量、减少胶原纤维增生,改善心肌超微结构损伤,以高剂量组作用效果最佳。益气活血方高剂量组能显著增加Epac1 mRNA及蛋白表达(P<0.01),显著增加Rap1 mRNA表达(P<0.01),明显降低Rap1GAP mRNA及Rap1GAP/Rap1蛋白表达(P<0.05,P<0.01)。结论:益气活血方可改善冠心病气虚血瘀证大鼠心功能、降低血液黏度与血浆cAMP含量、改善心肌损伤、减少胶原纤维增生,其心肌保护机制可能与调节cAMP/Epac1/Rap1信号通路有关。

稳定表达RAS鸟苷酸释放因子2肺癌细胞株的建立

目的构建带有GFP标签的RAS鸟苷酸释放因子2(RAS guanine nucleotide releasing factor 2,RASGRF2)真核表达质粒,并建立稳定表达RASGRF2的肺癌细胞株。方法用SgfⅠ和NotⅠ双酶切RASGRF2-pCMV6-Myc-DDK质粒,回收RASGRF2基因片段,亚克隆入pCMV6-GFP载体中,构建重组表达质粒RASGRF2-pCMV6-GFP,转染肿瘤细胞H1299,倒置荧光显微镜下观察RASGRF2蛋白的定位。经G418筛选并建立稳定表达RASGRF2的细胞株,RT-PCR及Western blot法检测RASGRF2的表达。结果经双酶切及测序证实RASGRF2基因成功克隆至真核表达载体pCMV6-GFP中;重组RASGRF2-GFP蛋白在H1299细胞中主要在胞质中表达;经RT-PCR及Western blot证实,RASGRF2在H1299细胞中稳定表达。结论成功建立了稳定表达RASGRF2基因的肺癌细胞株,为进一步研究RASGRF2基因的功能奠定了基础。

高糖、高脂对2型糖尿病单个核细胞内信号蛋白RasGRP4表达的影响

目的探讨高糖、高脂对2型糖尿病(T2DM)患者外周血单个核细胞(PBMCs)中Ras鸟苷酸释放蛋白4(RasGRP4)表达水平的影响。方法纳入2016年8月至2017年2月于天津医科大学朱宪彝纪念医院住院的T2DM患者120例(T2DM组)和年龄、性别相匹配的健康志愿者50例(NC组),采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测受试者PBMCs中RasGRP4及其变异体mRNA的表达情况。采用双变量相关分析和多元线性回归分析糖尿病病程及主要临床指标与RasGRP4及其变异体mRNA表达水平之间的关系。采用不同浓度葡萄糖(低糖:5.5 mmol/L,高糖:12.5 mmol/L和25 mmol/L)、不同浓度的棕榈酸(低脂:0.2 mmol/L,高脂:0.5 mmol/L)及高糖高脂(25 mmol/L葡萄糖+0.5 mmol/L棕榈酸)分别处理人单核细胞系(THP-1)细胞6、12和24 h,采用RT-qPCR技术检测RasGRP4及其变异体mRNA的水平,采用蛋白质免疫印迹技术(Western blot)检测RasGRP4蛋白表达情况。结果与NC组相比,T2DM组PBMCs中RasGRP4 mRNA及其变异体a、b、c、d、f和g的mRNA水平均升高(t=4.308、5.432、5.654、5.931、4.018、3.958、5.073,均P<0.05),而变异体e的mRNA水平下降(t=-3.821,P<0.05)。双变量相关分析显示T2DM组RasGRP4 mRNA水平与病程、血清甘油三酯(TG)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、糖化血红蛋白A1c(HbA1c)呈正相关(r=0.973、0.237、0.472、0.245,均P<0.05);多元线性回归分析显示T2DM病程和HbA1c是主要影响因素。高糖、高脂可促进THP-1细胞表达RasGRP4,且高糖、高脂同时干预对RasGRP4表达的影响具有明显的协同促进作用。结论T2DM患者PBMCs内信号蛋白RasGRP4高表达且出现变异体,慢性高血糖、高血脂可能是激活RasGRP4及其变异体产生的重要因素。

信号蛋白RasGRP4对自然杀伤细胞干扰素-γ分泌的调控作用

目的 探讨Ras鸟苷酸释放蛋白4(RasGRP4)是否直接参与自然杀伤细胞(NK细胞)调控干扰素-γ的分泌.方法 以RasGRP4基因敲除小鼠和C57BL/6野生型小鼠为研究对象,共24只.根据随机数字法随机分为C57 BL/6+生理盐水组、C57BL/6+脂多糖组、RasGRP4-/-+生理盐水组、RasGRP4-/-+脂多糖组,每组6只小鼠.采用流式细胞术微球阵列法分析两种小鼠在脂多糖免疫激活状态下血清干扰素-γ等免疫炎性因子水平;采用流式细胞术探讨RasGRP4基因敲除对小鼠外周血和脾细胞中主要干扰素-γ分泌细胞(NK细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞)比例的影响,以及在脂多糖激活2.5h时干扰素-γ+NK细胞、干扰素-γ+CD4+T细胞、干扰素-γ+CD8+T细胞的比例;分别提纯两种小鼠的NK细胞,比较其在脂多糖体外激活下干扰素-γ分泌能力.结果 与C57BI/6+生理盐水组和RasGRP4-/-+生理盐水组相比,C57BL/6+脂多糖组和RasGRP4-/-+脂多糖组白细胞介素(IL)-12p70、IL-10、肿瘤坏死因子-α、单核细胞趋化蛋白-1、IL-6、干扰素-γ较脂多糖激活前均显著升高(t =2.823 7~6.310 3,P均<0.01).RasGRP4-/-+脂多糖组血清中干扰素-γ水平约是C57BL/6+脂多糖组的20%(t=5.546 1,P<0.01);尽管C57BL/6+生理盐水组和RasGRP4-/-+生理盐水组外周血、脾细胞中NK细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞的比例差异均无统计学意义(P均>0.05),但在脂多糖激活状态下,RasGRP4-/-+脂多糖组外周血干扰素-γ+的NK1.1细胞比例仅为C57BL/6+脂多糖组的30%(t=8.011 2,P<0.01);而脾脏细胞中干扰素-γ+NK1.1的比例约为C57BL/6+脂多糖组的50%(t=4.429 2,P<0.01).在体外实验中,RasGRP4-/-来源的NK细胞在脂多糖刺激下细胞上清中干扰素-γ的水平为C57BL/6来源的30%(t=5.522 8,P<0.01).结论 RasGRP4在NK细胞分泌干扰素-γ的过程中起重要调控作用.