基于AQP4、Kir4.1及Ras/Raf-1/ERK信号通路和F-ERG探讨活血通络方对视网膜静脉阻塞大鼠视网膜功能的影响

目的观察视网膜分支静脉阻塞大鼠应用活血通络方后视网膜组织内AQP4、Kir4.1及Ras/Raf-1/ERK1/2的表达及电生理变化。方法将SD大鼠分为正常空白对照组、实验对照组、中药实验组。采用眼底视网膜激光机光凝视网膜分支静脉。实验对照组给予生理盐水2 ml每日灌胃1次,中药实验组给予活血通络方2 ml每日灌胃1次。应用电生理闪光ERG(F-ERG)观察造模前、造模后第3天、第6天的视网膜双极细胞功能变化。应用Westernblot方法,于造模后第6天,观察水通道蛋白4(Aquaporin-4,AQP4)、钾离子通道4.1(Kir4.1)及Ras/p-Raf-1/p-ERK1/2的表达情况。结果视网膜分支静脉阻塞发生后,F-ERG示大鼠视网膜功能下降,但中药实验组功能好于实验对照组;造模后AQP4、Kir4.1及Ras/p-Raf-1/p-ERK1/2表达增高,但中药实验组结果均低于实验对照组。结论活血通络方能够抑制AQP4、Kir4.1;Ras/Raf-1/ERK1/2信号通路的表达,有助于受损的视网膜功能恢复。

连翘脂素调节Ras/Raf/MEK/ERK信号通路对结直肠癌细胞恶性生物学行为的影响

目的 探究连翘脂素(PG)对结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡以及上皮间质转化的影响及机制。方法 培养HCT116结直肠癌细胞,采用10~200μmol/L的连翘脂素处理细胞,检测细胞存活率,筛选最佳实验浓度。将细胞分为对照组(Control组),连翘脂素低、中、高浓度组(PG-L组、PG-M组、PG-H组),连翘脂素高浓度+转染慢病毒阴性对照组(PG-H+NC组),连翘脂素高浓度+Ras慢病毒组(PG-H+Ras组)。平板克隆形成实验检测细胞增殖;划痕实验检测细胞迁移;Transwell小室法检测细胞侵袭;流式细胞术以及Hoechst33258染色法检测细胞凋亡;Western blot法检测上皮间质转化(EMT)标志蛋白E型钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)以及信号通路相关蛋白p-Raf、p-MEK、p-ERK表达;建立荷瘤小鼠模型评价连翘脂素对结直肠癌肿瘤生长的影响。结果 10~200μmol/L的连翘脂素处理HCT116结直肠癌细胞,可以显著抑制细胞存活率,经计算IC50值为(140.4±2.147)μmol/L,选择10、50、100μmol/L连翘脂素进行后续实验;与Control组比较,PG-L组、PG-M组、PG-H组HCT116细胞克隆形成率、划痕愈合率、细胞侵袭个数以及Vimentin、p-Raf、p-MEK、p-ERK表达显著降低,细胞凋亡率以及E-cadherin表达显著升高,且呈浓度依赖性(P<0.05);与PG-H+NC组比较,PG-H+Ras组HCT116细胞克隆形成率、划痕愈合率、细胞侵袭个数以及Vimentin、p-Raf、p-MEK、p-ERK表达显著升高,细胞凋亡率以及E-cadherin表达显著降低(P<0.05);连翘脂素可以显著抑制结直肠癌移植瘤的生长。结论 连翘脂素可以抑制结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡以及上皮间质转化,其作用机制可能与抑制Ras/Raf/MEK/ERK信号通路激活有关。

WNK2通过抑制ERK1/2/ROS/SHP2信号通路延缓肝细胞癌的增殖和侵袭

目的探讨WNK2对肝细胞癌(hepatocellocellua carcinoma,HCC)中ERK1/2/ROS/SHP2信号通路的影响,并探讨其在HCC细胞增殖和迁移中的作用。方法将WNK2-mimic和sh-RNA WNK2以及相应的阴性对照转染HepG2细胞,采用BALB/c裸鼠皮下成瘤实验检测WNK2对肝细胞癌增殖能力的影响;采用Western Blot检测瘤组织中WNK2、p40、gp90、p-SHP2、p-AKT和p-ERK1/2的表达;使用SHP2抑制剂PHPS1进行处理之后,采用Western Blot检测HepG2细胞中WNK2、p40、gp90、p-SHP2、p-AKT和p-ERK1/2的表达;使用细胞划痕实验和Transwell检测HepG2细胞的迁移能力和侵袭能力;采用单克隆增殖实验和CCK-8检测HepG2细胞的增殖能力。结果与sh-NC组相比,sh-RNA WNK2组裸鼠的瘤体体积显著增大(P<0.01);而与NC-mimic组相比,WNK2-mimic组裸鼠的瘤体体积显著减小(P<0.01);Western Blot结果显示,与sh-NC组相比,sh-RNA WNK2组WNK2的表达显著降低(P<0.01),p40、gp90、p-SHP2、p-AKT和p-ERK1/2的表达显著升高(P<0.01);而与NC-mimic组相比,WNK2-mimic组WNK2的表达显著升高(P<0.01),p40、gp90、p-SHP2、p-AKT和p-ERK1/2的表达显著降低(P<0.01);在体外实验当中,相对于sh-NC组,sh-RNA WNK2组中WNK2的表达显著降低(P<0.01),p40、gp90、p-SHP2、p-AKT和p-ERK1/2的表达显著升高(P<0.01);相对于sh-NC+PHPS1组,sh-RNA WNK2+PHPS1组中WNK2的表达显著降低(P<0.01),而p40、gp90、p-SHP2、p-AKT和p-ERK1/2的表达则被逆转并且与sh-NC+PHPS1组不具有显著性差异(P>0.05);细胞划痕实验和Transwell结果显示,相对于sh-NC组,sh-RNA WNK2组HepG2细胞的迁移和侵袭能力显著升高(P<0.01);sh-NC+PHPS1组和sh-RNA WNK2+PHPS1组HepG2细胞的迁移和侵袭能力显著降低并且不具有显著性差异(P>0.05);单克隆增殖实验结果显示,相对于sh-NC组,sh-RNA WNK2组HepG2细胞的增殖能力显著升高(P<0.01),而sh-NC+PHPS1组和sh-RNA WNK2+PHPS1组HepG2细胞的增殖能力显著降低并且不具有显著性差异(P>0.05)。结论WNK2可以抑制ERK1/2/ROS/SHP2信号通路,从而抑制ERK1/2/AKT信号通路,延缓HCC的增殖和迁移。

ERK1/2信号通路基因3'UTR多态性与非小细胞肺癌的相关性

目的探究4个ERK1/2信号通路的基因3'UTR区域的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点(MAPK1基因中的rs9340,NRAS基因中的rs14804,KRAS基因中的rs712和rs7973450)与非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的相关性。方法纳入了478名NSCLC患者及480名健康对照者,利用TaqMan探针法对其进行基因分型检测,并分析上述4个SNP与NSCLC的相关性。结果rs9340位点的等位基因在对照组与非小细胞鳞状细胞癌组(squamous cell carcinoma,SCC)中分布频率的差异具有统计学意义(P=0.009),该结果表明rs9340位点的G等位基因可能是非小细胞肺鳞癌的保护性因素(OR=0.67,95%CI:0.50~0.91)。同时,在<50岁年龄组中,rs9340位点的等位基因在对照组和NSCLC组中的分布频率差异具有统计学意义(P=5.07×10^(-4)),该结果表明rs9340等位基因G可能是NSCLC的保护性因素(OR=0.46,95%CI:0.29~0.72)。结论MAPK1基因SNP位点rs9340可能与NSCLC的发生风险相关。

桑黄素通过抑制ERK1/2-p38信号通路介导对老年大鼠骨骼保护作用

【目的】探讨桑黄素(SSS)治疗对老年大鼠骨代谢及骨量影响,并阐明其可能的作用机制。【方法】10只3月龄年轻雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠和20只24月龄老年雌性SD大鼠随机分为3组,对照组(CON,10只年轻大鼠)、模型组(MOD,10只老年大鼠)和桑黄素组(SSS,10只老年大鼠)。在实验过程中,SSS组每日接受腹腔注射桑黄素(10 mg/kg)治疗。治疗为期12周,待治疗结束后使用Micro-CT、HE染色切片、血清学检测以及蛋白质印迹观察治疗效果以及可能的机制。【结果】治疗12周后,与MOD组相比,SSS组的大鼠骨小梁数量和密度得到明显的改善。SSS组左侧股骨BMD、Conn.D、Tb.N、Tb.Th和Tb.Sp较MOD组明显改善(P<0.05)。治疗12周时,SSS组CTX-1、骨钙素、TRACP-5b和PINP水平较MOD显著降低(P<0.05)。和MOD组比较,SSS组的大鼠ERK1/2-p38信号通路显著抑制,ERK1/2和p38水平显著降低,比较有统计学差异(P<0.05)。【结论】桑黄素通过抑制ERK1/2-p38信号通路和降低骨转换来介导对老年大鼠骨骼保护作用。

基于Ras/Raf-1/ERK信号转导通路调控VEGF的表达探讨活血解毒方对糖尿病大鼠视网膜的影响

目的:观察活血解毒方对糖尿病大鼠视网膜血管形态的影响并探讨其可能的作用机制。方法:一次性腹腔注射链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ,65 mg/kg)诱导糖尿病大鼠模型,造模后随机分为模型组和活血解毒方组。另设正常对照组。药物干预12周后,应用视网膜消化铺片法观察视网膜血管形态;应用Western blot法检测视网膜VEGF蛋白的表达,应用Real-Time PCR法检测视网膜VEGF、Ras、Raf-1与ERK mRNA的表达。结果:模型组视网膜毛细血管面积密度及内皮细胞/周细胞比例与较正常组升高(P<0.001),VEGF蛋白及VEGF、Ras、ERKmRNA表达升高(P<0.05),Raf-1mRNA表达升高(P>0.05)。与模型组比较,活血解毒方组视网膜毛细血管面积密度和内皮细胞/周细胞比例降低(P<0.01和P<0.001),VEGF蛋白与VEGF、Ras、Raf-1、ERK mRNA表达下降(P<0.05)。结论:活血解毒方能明显抑制视网膜毛细血管和内皮细胞的增生,其机制可能是通过干预Ras/Raf-1/ERK信号转导通路,下调VEGF在视网膜中的表达,抑制血管新生,从而改善DR。

调补肺肾三法通过抑制ERK1/2信号通路改善COPD大鼠气道黏液高分泌

目的 探究调补肺肾三法对慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)稳定期大鼠气道黏液高分泌的影响及作用机制。方法 90只大鼠随机分为对照(Control)组、模型(COPD)组、补肺健脾(Bu-Fei Jian-Pi Formula, BJF)组、补肺益肾(Bu-Fei Yi-Shen Formula, BYF)组、益气滋肾(Yi-Qi Zi-Shen Formula, YZF)组、ERK1/2抑制剂(PD98059)组、补肺健脾联合抑制剂(BJF+PD98059)组、补肺益肾联合抑制剂(BYF+PD98059)组和益气滋肾联合抑制剂(YZF+PD98059)组。第1~8周采用香烟烟雾暴露联合细菌反复感染的方法建立COPD大鼠模型,9~16周Control组和COPD组给予生理盐水每只2 mL,BJF组、BYF组和YZF组分别给予对应的调补肺肾三方灌胃,第16周PD98059组、BJF+PD98059组、BYF+PD98059组和YZF+PD98059组给予PD98059腹腔注射7 d。16周结束后取材,检测大鼠肺功能、肺组织形态、肺组织水含量、BALF中炎性细胞计数和血清炎性因子水平。AB-PAS染色和免疫组化法分别检测杯状细胞比例和Muc5AC、Muc5B表达。PCR检测ERK1、ERK2、ENaC、CFTR、AQP5 mRNA表达。Western Blot测定肺组织中ERK1/2、P-ERK1/2蛋白表达。结果 与Control组相比,COPD组大鼠TV、MV、FVC、FEV_(0.1)及FEV_(0.1)/FVC均显著下降(P<0.01);肺病理显示肺泡紊乱,肺泡壁大量断裂,气管壁严重皱缩增厚,周围有大量炎性细胞浸润;肺组织水含量明显升高(P<0.01);BALF中巨噬细胞比例显著降低(P<0.01),中性粒细胞和淋巴细胞比例显著升高(P<0.01);血清炎性因子TNF-α、IL-1β水平显著增高(P<0.05,P<0.01);气道上皮杯状细胞比例和Muc5AC、Muc5B表达水平均显著升高(P<0.01);肺组织ERK1、ERK2、ENaC mRNA表达量均明显升高(P<0.01),CFTR和AQP5 mRNA的表达均明显降低(P<0.01);肺组织P-ERK1/2, ERK1/2表达明显升高(P<0.01);与COPD组相比,各治疗组能不同程度改善上述指标变化(P<0.05,P<0.01),调补肺肾三方联合PD98059组治疗效果优于单一治疗组(P<0.05,P<0.01)。结论 调补肺肾三法通过抑制ERK1/2信号通路改善COPD大鼠气道黏液高分泌。

温肺降浊方对血管性痴呆模型大鼠ERK1/2信号通路相关蛋白的影响

目的:观察温肺降浊方对血管性痴呆(VaD)模型大鼠细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)信号通路的影响,探讨其治疗VaD可能的相关作用机制。方法:将雄性SD大鼠随机分为假手术组和模型组(等体积0.9%氯化钠溶液灌胃),温肺降浊方低、中、高剂量组(1.5、3、6 ml剂量灌胃)。观察造模后大鼠水迷宫评分和HE病理变化,免疫组化、RT-qPCR和Western blot检测海马组织中ERK1/2、钙蛋白酶(Calpain)、Bcl-2关联死亡启动子重组蛋白(Bad)、B淋巴细胞瘤-xl(Bcl-xl)蛋白和mRNA表达情况。结果:与假手术组相比,模型组和温肺降浊方各剂量组大鼠逃避潜伏期延长、穿越平台次数缩短(P<0.05),海马组织形态稀疏、水肿及核缩小;海马组织ERK1/2、Calpain、Bad蛋白和mRNA表达升高(P<0.05),Bcl-xl蛋白和mRNA表达下降(P<0.05)。与模型组比较,温肺降浊方高剂量组大鼠逃避潜伏期缩短、穿越平台次数增加(P<0.05),海马组织形态逐渐紧密、水肿减少,数量增多;海马组织ERK1/2、Calpain、Bad蛋白和mRNA表达下降(P<0.05),Bcl-xl蛋白和mRNA表达升高(P<0.05)。结论:血管性痴呆可能与大鼠海马中的ERK1/2、Calpain、Bad蛋白升高及Bcl-xl蛋白降低有关,温肺降浊方可以抑制VaD大鼠海马中的ERK1/2通路激活,减少神经细胞凋亡,延缓疾病进展,改善血管性痴呆大鼠的学习记忆能力。

POSTN通过ERK1/2信号通路诱导肺动脉平滑肌细胞增殖

目的探索骨膜蛋白(periostin,POSTN)诱导肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cell,PASMC)增殖在缺氧诱导肺动脉高压(hypoxia-induced pulmonary hypertension,HPH)发病中的作用及其机制。方法取自雄性大鼠的原代PASMC暴露于缺氧环境模拟HPH,将细胞分为常氧组、缺氧组、缺氧+对照腺病毒转染组(Ad-shNC组)、缺氧+POSTN沉默腺病毒转染组(Ad-shPOSTN组)、POSTN组、POSTN+U0126组。采用α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)评估PASMC的纯度,CCK-8法检测细胞活力,Western blot法检测PASMC中POSTN、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、骨形态发生蛋白Ⅱ型受体(bone morphogenetic protein typeⅡreceptor,BMPR2)、磷酸化的细胞外信号调节激酶1/2(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2,p-ERK1/2)及细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)的蛋白表达水平。结果与常氧组比较,缺氧促进PASMC增殖和POSTN蛋白表达,抑制BMPR2蛋白表达。下调POSTN表达可抑制缺氧诱导的PASMC增殖,恢复BMPR2蛋白表达水平。此外,POSTN明显增加p-ERK1/2或ERK1/2的蛋白表达水平,增加PASMC增殖,而这些效应可被U0126阻断。结论在HPH病理机制中,POSTN促进PASMC增殖,其潜在的机制可能与调节BMPR2表达和活化ERK1/2信号通路有关。

Ras信号通路参与调控细胞凋亡作用的研究进展

细胞凋亡是由体内和体外因素触发的预先存在的细胞死亡过程引起的主动细胞死亡,通过清除老化、受损细胞来维持内部环境的稳定。细胞凋亡在生理和病理状态下均发挥重要作用,并受到细胞内多条信号通路的调节,影响细胞内物质的表达。目前已知Ras信号通路不仅广泛参与调控细胞生长增殖、分化和凋亡等多个生理病理过程,并具有促进细胞发生自噬性死亡的作用,然而,其参与调节细胞凋亡的具体机制尚未完全阐明。文章从细胞凋亡的分子机制出发,重点从线粒体凋亡途径、死亡受体凋亡途径、内质网应激凋亡途径相关凋亡途径,以及Ras信号通路在细胞凋亡调控中的研究进展进行综述。

TNF-α通过ERK1/2-Runx2信号通路调控SHED成骨分化能力的实验研究

目的:探讨肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)对人脱落乳牙牙髓干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHED)骨分化能力的影响,分析ERK1/2-Runx2信号通路在该调控过程中的变化。方法:从6~8岁健康儿童正常乳恒牙替换即将脱落的乳切牙中分离和培养SHED,取第三代细胞,分为对照组(成骨诱导剂培养)、观察组(成骨诱导剂和TNF-α共培养)和激动剂组(成骨诱导剂、TNF-α和ERK通路激动剂共培养)。采用茜素红染色评价成骨分化功能,采用Western印迹检测SHED细胞中Osterix、OPN、ERK1/2、pERK1/2和Runx2的蛋白表达水平,应用qRT-PCR检测Osterix、OPN、ERK1/2、pERK1/2和Runx2 mRNA的表达。采用SPSS 26.0软件包对数据进行统计学分析。结果:3组细胞成骨分化能力比较结果显示,3组细胞中均可见红棕色矿化结节。3组组间相比,对照组矿化结节最多,激动剂组次之,观察组最少。与对照组相比,观察组和激动剂组的Osterix、OPN蛋白和mRNA表达水平显著下降,而激动剂组Osterix、OPN蛋白和mRNA表达水平显著高于观察组;3组细胞的ERK1/2蛋白和mRNA表达水平无显著差异,而观察组和激动剂组pERK1/2和Runx2的蛋白和mRNA表达水平显著高于对照组,激动剂组的蛋白及mRNA表达水平显著高于观察组。结论:TNF-α对SHED成骨分化具有抑制作用,该作用可能与抑制ERK1/2-Runx2信号通路有关。

基于ERK1/2-GSK3β-NFκB信号通路探究芪黄苁蓉通便散贴敷对肾衰竭大鼠肠道菌群及肾功能的影响

目的 研究基于细胞外信号调节激酶(ERK)1/2-糖原合成酶激酶(GSK)3β-核因子(NF)κB信号通路探究芪黄苁蓉通便散贴敷对肾衰竭大鼠肠道菌群及肾功能的影响。方法 40只SD大鼠随机抽取10只作为健康组进行对照,剩余建立慢性肾衰竭(CRF)模型,建模成功后分为模型组、治疗组(芪黄苁蓉通便散贴)、药物对照组(复元四红散)各10只。运用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肾功能、氧化应激相关指标水平,苏木素-伊红(HE)、Masson染色观察肾组织病理形态学,采集粪便检测肠道细菌种类及数量,Western印迹检测ERK1/2-GSK3β-NFκB通路相关蛋白。结果 与健康组相比,模型组尿素氮、血肌酐、尿酸、丙二醛、肠球菌、肠杆菌、ERK1/2、p-ERK1/2、GSK3β、p-GSK3β、NFκBp65、p-NFκBp65、单核细胞趋化蛋白-1、细胞间黏附分子-1升高,超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、双歧杆菌、乳酸杆菌水平显著降低(P<0.05);与模型组相比,治疗组与药物对照组均有所改善,且以治疗组效果显著(P<0.05)。健康组肾组织结构正常;模型组肾小球变形,肾小管扩张,大量炎性细胞浸润;与模型组相比,治疗组与药物对照组均有所改善。Masson染色显示,健康组结构正常;模型组出现肾组织肾小管发生变性、萎缩、破坏及再生等病理改变,间质中单核与淋巴细胞浸润及胶原纤维表达最多;治疗组与药物对照组肾小管、间质的病理改变得到有效改善,蓝色胶原纤维沉积也呈下降趋势。结论 芪黄苁蓉通便散贴可能是通过抑制ERK1-2-GSK3β-NF-κB通路的激活,改善CRF大鼠肠道菌群及肾功能。

甘草苷对妊娠糖尿病大鼠胰岛素抵抗及Ras/Raf-1/ERK信号通路的影响

目的探讨甘草苷对妊娠糖尿病(GDM)大鼠胰岛素抵抗及Ras/Raf-1/ERK信号通路的影响。方法以尾静脉注射链脲佐霉素的方法诱导复制GDM大鼠模型,随机分为模型组、甘草苷低剂量(10 mg/kg)组、甘草苷中剂量(20 mg/kg)组、甘草苷高剂量(40 mg/kg)组、二甲双胍(24.2 mg/kg)组,每组12只,另取12只孕鼠尾静脉注射等剂量生理盐水,设为对照组,分组给药后,测量各组孕鼠空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)与高密度脂蛋白(HDL-C)水平,算出胰岛素抵抗指数(IRI);测量各组孕鼠与其妊娠20 d时胎鼠体重;PAS染色检测各组孕鼠肝糖原合成情况;酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组孕鼠血清炎性细胞因子IL-1β、IL-18及TNF-α水平;蛋白免疫印迹法检测各组孕鼠肝组织Ras/Raf-1/ERK通路蛋白(Ras、p-Raf-1/Raf-1、p-ERK1/2/ERK1/2)表达。结果与对照组比较,模型组孕鼠肝糖原合成显著减少,FINS、FBG、IRI、TG、TC、HDL-C、孕鼠与胎鼠体重、血清IL-1β水平、血清IL-18水平及血清TNF-α水平、肝组织Ras蛋白表达、p-Raf-1/Raf-1及p-ERK1/2/ERK1/2显著升高(P<0.05);与模型组比较,各给药组孕鼠肝糖原合成增多,FINS、FBG、IRI、TG、TC、HDL-C、孕鼠与胎鼠体重、血清IL-1β水平、血清IL-18水平及血清TNF-α水平、肝组织Ras蛋白表达、p-Raf-1/Raf-1及p-ERK1/2/ERK1/2降低,且甘草苷低、中、高剂量组之间呈剂量依赖性(P<0.05);甘草苷高剂量组与二甲双胍组比较,大鼠各指标无明显差异(P>0.05)。结论甘草苷可抑制炎症发生发展,减轻GDM大鼠胰岛素抵抗,改善其肝脏糖脂代谢,减轻母婴体重异常增重症状,可能是通过抑制Ras/Raf-1/ERK信号激活实现的。

大鼠增殖抑制基因通过Ras-Raf-MEK-ERK信号通路抑制C6胶质瘤细胞增殖

目的探讨Ras-Raf-MEK-ERK通路在大鼠增殖抑制基因(r HSG)抑制C6大鼠胶质瘤细胞增殖中的作用。方法用r HSG过表达腺病毒载体(Adv-r HSG-GFP)转染C6细胞后,流式细胞仪分析腺病毒转染效率;Western blot检测r HSG蛋白表达变化;流式细胞仪分析细胞周期;qRT-PCR检测H-ras、N-ras、K-ras、Erk1、Erk2基因mRNA表达变化;Western blot检测H-ras、N-ras、K-ras、p-Erk1/2、Erk1/2、p-Rb、Rb蛋白表达变化。结果腺病毒载体能高效的转染C6细胞并表达GFP蛋白,Adv-r HSG-GFP组r HSG蛋白表达显著高于未转染组(PBS)和AdvGFP组,C6细胞被阻滞于G0/G1期(P<0.01);经IGF-1刺激后,Adv-r HSG-GFP组细胞H-ras、N-ras、K-ras、Erk1、Erk2基因的mRNA和蛋白表达水平与PBS组和Adv-GFP组无明显差异(P>0.05);Adv-r HSG-GFP组细胞过表达r HSG能显著抑制IGF-1诱导的Erk1/2的活化,p-Erk1/2蛋白表达量显著低于其余两组(P<0.01);同时其p-Rb蛋白的表达量显著低于其余两组(P<0.01),而Rb蛋白表达量3组无明显差异(P>0.05)。结论 r HSG可能通过抑制Ras-Raf-MEK-ERK信号通路的激活抗C6恶性胶质瘤细胞增殖。

mTOR抑制剂联合熊去氧胆酸对肝癌大鼠抑制、免疫逃逸及Ras/ERK信号通路的影响

目的探究mTOR抑制剂联合熊去氧胆酸(UDCA)对肝癌大鼠抑制、免疫逃逸及Ras/ERK信号通路的影响。方法SPF级SD雄性大鼠60只,10只作为正常(NO)组,50只腹腔注射二乙基亚硝铵进行肝癌建模。建模成功后,取40只大鼠随机分为模型(MO)组,mTOR抑制剂(MI)组,UDCA(UD)组,mTOR抑制剂联合UDCA(UN)组,每组10只。MI组灌胃mTOR抑制剂西罗莫司2 mg/kg,UD组灌胃UDCA 30 mg/kg,UN组灌胃mTOR抑制剂西罗莫司2 mg/kg及30 mg/kg UDCA,NO组、MO组灌胃同体积0.9%NaCl溶液。观察大鼠肿瘤生长情况、肝组织病理形态,ELISA法检测免疫逃逸相关因子,免疫印迹法检测Ras/ERK信号通路相关蛋白表达。结果与NO组相比,MO组体重显著降低(P<0.05),肝重、肝脏系数显著升高(P<0.05);与MO组相比,MI组体重明显升高(P<0.05),肝重、肝脏系数显著降低(P<0.05);与MI组相比,UD组体重、肝重、肝脏系数无明显差异(P>0.05);与UD组相比,UN组体重明显升高(P<0.05),肝重、肝脏系数显著降低(P<0.05)。与MO组相比,MI组抑瘤曲线明显升高(P<0.05);与MI组相比,UD组抑瘤曲线无明显差异(P>0.05);与UD组相比,UN组抑瘤曲线明显升高(P<0.05)。NO组肝组织及肝小叶结构清晰完整,肝细胞分界清晰且呈放射状排列,未见增生坏死细胞及炎性细胞,MO组肝组织肝索结构不清,肝细胞排列紊乱且细胞肿胀,可见癌巢及大量炎性细胞浸润。与MO组比较,MI组、UD组、UN组病理结构明显改善,炎性细胞及癌细胞明减少。与NO组比较,MO组大鼠血清IL-4、IL-10、TGF-β1含量显著升高(P<0.05);与MO组比较,MI组、UD组、UN组大鼠血清IL-4、IL-10、TGF-β1含量显著降低(P<0.05),且UD组与MI组相比基本无差异(P>0.05),UN组比UD组降低显著(P<0.05)。NO组、MO组、MI组、UD组、UN组Ras蛋白表达分别为1.16±0.11、2.26±0.29、1.51±0.17、1.55±0.18、1.19±0.14,p-ERK蛋白表达分别为1.05±0.10、2.94±0.28、1.66±0.14、1.68±0.16、1.14±0.11;与NO组比较,MO组大鼠肝组织Ras、p-ERK蛋白表达显著升高(P<0.05);与MO组比较,MI组、UD组、UN组大鼠肝组织Ras、p-ERK蛋白表达显著降低(P<0.05),且UD组与MI组相比基本无差异(P>0.05),UN组比UD组降低显著(P<0.05)。结论mTOR抑制剂联合UDCA可显著抑制肝癌大鼠肿瘤生长,抑制免疫逃逸及Ras/ERK信号通路激活。

重组人转化生长因子-β1对大鼠正畸牙移动模型成骨细胞分化及ERK/MAPK信号通路的影响

目的:探讨重组人转化生长因子-β1(rhTGF-β1)对大鼠正畸牙移动模型细胞外信号调节激酶(ERK)/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路及成骨细胞分化的影响。方法:将SD大鼠随机分为:对照组、模型组、rhTGF-β1低剂量组、rhTGF-β1中剂量组、rhTGF-β1高剂量组。模型组、rhTGF-β1低、中、高剂量组建立大鼠正畸牙移动模型,各组从造模第1天开始给药,rhTGF-β1(低、中、高)剂量组于双侧上颌第一磨牙近中牙龈黏膜下分别注射1.25、2.5、5 ng/mL的rhTGF-β1溶液0.1 mL,对照组注射0.1 mL生理盐水,每2 d给药1次,持续14 d。游标卡尺测量大鼠上颌第一磨牙移动距离;苏木精-伊红染色观察大鼠牙周及牙槽骨组织病理形态;酶联免疫吸附法检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、骨保护素(OPG)、核因子κB受体活化因子配体(RANKL)水平;Western blot检测大鼠牙周及牙槽骨组织成骨相关蛋白[骨钙素(OCN)、骨桥蛋白(OPN)、Runt相关转录因子2(Runx2)]和ERK/MAPK通路相关蛋白表达。结果:与对照组相比,模型组大鼠牙张力侧牙周组织膜纤维拉伸变长,组织间隙变宽,基质增生,成骨细胞数量大量减少近乎消失,呈现病理损伤,上颌第一磨牙移动距离、血清TNF-α、IL-6、RANKL、牙周及牙槽骨组织p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38 MAPK/p38 MAPK蛋白表达水平明显升高,血清OPG、牙周及牙槽骨组织OCN、OPN、Runx2蛋白表达水平明显降低(P<0.05);与模型组相比,rhTGF-β1低、中、高剂量组大鼠牙张力侧牙周及牙槽骨组织病理损伤逐步减轻,血清TNF-α、IL-6、RANKL、牙周及牙槽骨组织p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38 MAPK/p38 MAPK蛋白表达水平依次降低,上颌第一磨牙移动距离、血清OPG、牙周及牙槽骨组织OCN、OPN、Runx2蛋白表达水平依次升高(P<0.05),且各组之间呈剂量依赖性。结论:rhTGF-β1可减轻大鼠正畸牙移动模型炎症反应,促使成骨分化,加速正畸牙移动,可能与抑制ERK/MAPK信号通路激活有关。

枳葛口服液通过Syk/Ras/ERK信号通路防治酒精性肝损伤机制研究

目的:基于Syk/Ras/ERK信号通路观察枳葛口服液含药血清对酒精性肝损伤大鼠BRL3A肝细胞炎症反应的影响,探讨枳葛口服液防治酒精性肝损伤的相关机制。方法:将正常大鼠BRL3A肝细胞接种于6孔板,贴壁后分为正常对照组、模型组(2.5%乙醇处理)、阳性对照组(美他多辛含药血清加2.5%乙醇)和不同浓度枳葛口服液含药血清(2.5%、5%、10%枳葛口服液含药血清加2.5%乙醇)干预组,24h后酶标法检测各组细胞上清液中GGT(γ-谷氨酰转肽酶)、LDH(乳酸脱氢酶)含量;RT-PCR法测定各组细胞内Syk、Ras、MEK1/2、ERK1/2、c-Fos mRNA表达情况。结果:与正常对照组比较,模型组细胞上清液中GGT、LDH含量显著升高(P<0.01);Syk、Ras、MEK1/2、ERK1/2、c-Fos mRNA表达显著升高(P<0.01)。与模型组比较,各干预组以上指标均呈现不同程度的好转,其中10%枳葛口服液含药血清及阳性对照组作用最显著(P<0.01),二者之间未见明显差异(P>0.05)。结论:一定浓度的枳葛口服液含药血清对大鼠肝细胞酒精性肝损伤具有防治作用,其机制可能与抑制Syk/Ras/ERK信号通路活化,从而减轻肝脏炎症相关。

ERK1/2信号通路与肿瘤关系的研究进展

胞外信号调节激酶(ERK)可以将细胞信号从受体传导至细胞核,是负责细胞外刺激的经典丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路。相关研究表明ERK通路的激活与许多肿瘤的发生发展密切相关,许多作用于ERK通路上游的抑制剂都表现出抗肿瘤活性。ERK1和ERK2是MAPK/ERK通路最重要的分子,因具有同质性,统称为ERK1/2。ERK1/2可以磷酸化多种底物,参与细胞的增殖、分化、迁移、侵袭、凋亡、癌性转化等重要过程。本文就ERK1/2信号通路及其与肿瘤增殖、凋亡和迁移侵袭的相关性进行综述,以期更好的指导肿瘤治疗。

ERK1/2信号通路阻断剂PD98059对慢性高原病患者骨髓有核红细胞中Ras、BRaf、MEK、ERK1/2表达的影响

目的:探讨ERK1/2信号通路阻断剂PD98059对Ras、B型丝/苏氨酸蛋白激酶(BRaf)、丝裂原活化蛋白激酶(MEK)、细胞信号调节激酶1/2(ERK1/2)表达的影响,以期为慢性高原病(chronic mountain sickness,CMS)的基础研究和临床治疗探讨新的途径。方法:选取CMS患者16例,取骨髓液分离单个核细胞,以CD71与CD235a抗体磁珠分选阳性细胞,将细胞分为5组:空白对照组、DMSO溶剂组及PD98059 5、10和20μmol/L组。在低氧条件下培养72 h,应用ELISA法测定培养骨髓有核红细胞上清液中Ras-GTP水平,RT-PCR法测定骨髓有核红细胞中BRaf、MEK、ERK1/2 mRNA的表达,Western blot方法检测骨髓有核红细胞中p-BRaf、p-MEK、pERK1/2蛋白表达。结果:PD98059对各组Ras-GTP的水平无明显影响(P=0.798)。溶剂组与空白对照组相比,BRaf、MEK mRNA的表达水平差异无统计学意义(P=0.826、P=0.298)。与PD98059 20 mol/L比较,其余4组ERK1/2 mRNA的表达水平差异有统计学意义(P=0.001、P=0.002)。溶剂组与空白对照组相比,p-BRaf、p-MEK蛋白的表达差异无统计学意义(P=0.370、P=0.351)。与PD98059 20 mol/L比较,其余4组p-ERK1/2蛋白水平差异有统计学意义(P<0.001、P<0.007)。结论:PD98059能下调骨髓有核红细胞ERK1/2 mRNA及p-ERK1/2蛋白的表达。Ras/Raf/MEK/ERK 1/2通路是调控CMS骨髓有核红细胞的主要信号传导途径,可能参与了慢性高原病的发病过程。

circRNA_079813调控ROR2和ERK1/2-MAPK信号通路对牙髓损伤大鼠成骨分化的影响

目的:探讨circRNA_079813对牙髓损伤模型大鼠成骨分化的作用及其机制。方法:将70只SD大鼠随机分为7组,即假手术组、牙髓损伤组、pcDNA3.1空载体(pcDNA-null)+牙髓损伤组、过表达circRNA_079813(pcDNA-circ)+牙髓损伤组、pcDNA-circ+siRNA-NC+牙髓损伤组、pcDNA-circ+siRNA-ROR2+牙髓损伤组、pcDNA-circ+PD98059(ERK1/2抑制剂)+牙髓损伤组,每组10只。术后3 d采用苏木精—伊红(HE)染色观察牙髓组织病理变化。检测各组碱性磷酸酶(ALP)活性,RTqPCR法检测circRNA_079813表达,western blotting法检测ROR2、磷酸化(p-)ERK1/2、骨涎蛋白(BSP)、骨钙蛋白(OCN)、ALP、牙本质涎磷蛋白(DSPP)和牙本质基质蛋白-1(DMP-1)蛋白表达。结果:与假手术组比较,牙髓损伤组牙髓组织有明显炎症浸润和损伤特征,circRNA_079813表达下调(P<0.05)。与pcDNA-null+牙髓损伤组比较,pcDNA-circ+牙髓损伤组circRNA_079813、ROR2、p-ERK1/2、BSP、ALP、OCN、DSPP、DMP-1表达水平及ALP活性均升高(均P<0.05)。沉默ROR2表达后,与pcDNA-circ+siRNA-NC+牙髓损伤组比较,pcDNA-circ+siRNA-ROR2+牙髓损伤组ROR2、p-ERK1/2、BSP、ALP、OCN、DSPP、DMP-1表达及ALP活性均下降(均P<0.05)。与pcDNA-circ+牙髓损伤组比较,pcDNA-circ+PD98059+牙髓损伤组pERK1/2、ALP、BSP、OCN、DSPP、DMP-1表达及ALP活性均下降(均P<0.05)。结论:circRNA_079813通过促进ROR2表达激活牙髓损伤大鼠ERK1/2-MAPK信号通路促进成骨分化。