基于RAP1信号通路探讨右归丸延缓膝骨关节炎的软骨退变

目的通过右归丸治疗膝骨关节炎(KOA)模型大鼠,观察大鼠关节软骨形态及检测右归丸对RAP1信号通路表达和大鼠血清中的炎性因子表达,探讨右归丸对RAP1信号通路的表达及防治KOA的作用机制,为治疗提供理论基础。方法72只SPF级SD大鼠(雌雄各半)随机数字表法分为假手术组12只和造模组60只。造模组采用改良Hulth法建立膝关节OA模型,假手术组接受假手术。将造模成功的大鼠分为模型组(n=11)、右归丸低剂量组(n=12)、右归丸中剂量组(n=12)、右归丸高剂量组(n=12)及塞来昔布组(n=12)。给药阶段模型组、假手术组给予0.9%氯化钠溶液;右归丸低剂量组为等效浓度的1/2为0.5 g/d、右归丸中剂量组等效浓度为1 g/d、右归丸高剂量组为等效浓度2倍为2 g/d,塞来昔布组配置成悬浮(等效浓度为0.0072 g/d)。驱赶7周后检测并比较各组大鼠软骨病理,血清TNF-α、IL-1β和IL-18含量,以及大鼠软骨组织中RAP1、RAF、MEK1/2、ERK1/2、CREB、MMP3、MMP13、ADAMTS、C-fos、C-myc和C-Jun的表达水平。结果各组大鼠软骨病理检测结果显示:假手术组大鼠软骨组织未见异常,模型组大鼠关节软骨部分区域出现明显缺损,右归丸低剂量组大鼠关节软骨表面磨损较模型组有所减轻,而中、高剂量组及塞来昔布组大鼠软骨表面可见侵蚀现象明显改善。右归丸对KOA大鼠血清中的IL-1β、TNF-α、IL-18含量与模型组相比,右归丸高、中、低剂量组和塞来昔布组在大鼠血清中表达显著降低,差异具有统计学意义。与软骨组织中RAP1-RAF-MEKl/2-ERKl/2-CREB信号通路活化水平检测结果显示:与假手术组比较,模型组大鼠软骨组织中RAP1、RAF、MEK1/2、ERK1/2、CREB、MMP3、MMP13、ADAMTS、C-fos、C-myc和C-Jun的表达水平均显著升高,差异有显著统计学意义(P<0.01)。结果提示,在KOA发生时,RAP1-RAF-MEKl/2-ERKl/2-CREB信号转导通路激活,介导软骨组织中炎症反应及细胞凋亡的发生,这与以往研究结果一致。右归丸干预后,软骨组织中RAP1、RAF、MEK1/2、ERK1/2、CREB、MMP3、MMP13、ADAMTS、C-fos、C-myc和C-Jun蛋白表达水平均显著降低,差异有显著统计学意义(P<0.01)。结论右归丸能够抑制KOA大鼠软骨组织中RAP1-RAF-MEKl/2-ERKl/2-CREB信号通路的活化,降低炎性因子表达,从而延缓软骨退变。

circRNA_079813调控ROR2和ERK1/2-MAPK信号通路对牙髓损伤大鼠成骨分化的影响

目的:探讨circRNA_079813对牙髓损伤模型大鼠成骨分化的作用及其机制。方法:将70只SD大鼠随机分为7组,即假手术组、牙髓损伤组、pcDNA3.1空载体(pcDNA-null)+牙髓损伤组、过表达circRNA_079813(pcDNA-circ)+牙髓损伤组、pcDNA-circ+siRNA-NC+牙髓损伤组、pcDNA-circ+siRNA-ROR2+牙髓损伤组、pcDNA-circ+PD98059(ERK1/2抑制剂)+牙髓损伤组,每组10只。术后3 d采用苏木精—伊红(HE)染色观察牙髓组织病理变化。检测各组碱性磷酸酶(ALP)活性,RTqPCR法检测circRNA_079813表达,western blotting法检测ROR2、磷酸化(p-)ERK1/2、骨涎蛋白(BSP)、骨钙蛋白(OCN)、ALP、牙本质涎磷蛋白(DSPP)和牙本质基质蛋白-1(DMP-1)蛋白表达。结果:与假手术组比较,牙髓损伤组牙髓组织有明显炎症浸润和损伤特征,circRNA_079813表达下调(P<0.05)。与pcDNA-null+牙髓损伤组比较,pcDNA-circ+牙髓损伤组circRNA_079813、ROR2、p-ERK1/2、BSP、ALP、OCN、DSPP、DMP-1表达水平及ALP活性均升高(均P<0.05)。沉默ROR2表达后,与pcDNA-circ+siRNA-NC+牙髓损伤组比较,pcDNA-circ+siRNA-ROR2+牙髓损伤组ROR2、p-ERK1/2、BSP、ALP、OCN、DSPP、DMP-1表达及ALP活性均下降(均P<0.05)。与pcDNA-circ+牙髓损伤组比较,pcDNA-circ+PD98059+牙髓损伤组pERK1/2、ALP、BSP、OCN、DSPP、DMP-1表达及ALP活性均下降(均P<0.05)。结论:circRNA_079813通过促进ROR2表达激活牙髓损伤大鼠ERK1/2-MAPK信号通路促进成骨分化。

基于Ras/Raf-1/ERK信号转导通路调控VEGF的表达探讨活血解毒方对糖尿病大鼠视网膜的影响

目的:观察活血解毒方对糖尿病大鼠视网膜血管形态的影响并探讨其可能的作用机制。方法:一次性腹腔注射链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ,65 mg/kg)诱导糖尿病大鼠模型,造模后随机分为模型组和活血解毒方组。另设正常对照组。药物干预12周后,应用视网膜消化铺片法观察视网膜血管形态;应用Western blot法检测视网膜VEGF蛋白的表达,应用Real-Time PCR法检测视网膜VEGF、Ras、Raf-1与ERK mRNA的表达。结果:模型组视网膜毛细血管面积密度及内皮细胞/周细胞比例与较正常组升高(P<0.001),VEGF蛋白及VEGF、Ras、ERKmRNA表达升高(P<0.05),Raf-1mRNA表达升高(P>0.05)。与模型组比较,活血解毒方组视网膜毛细血管面积密度和内皮细胞/周细胞比例降低(P<0.01和P<0.001),VEGF蛋白与VEGF、Ras、Raf-1、ERK mRNA表达下降(P<0.05)。结论:活血解毒方能明显抑制视网膜毛细血管和内皮细胞的增生,其机制可能是通过干预Ras/Raf-1/ERK信号转导通路,下调VEGF在视网膜中的表达,抑制血管新生,从而改善DR。

SF3B1敲减通过RAS等信号通路影响MDAMB-231乳腺癌细胞增殖、侵袭、迁移及凋亡

目的:检测剪接因子3B亚基1(SF3B1)基因敲减对人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、侵袭、迁移及凋亡等生物学行为的影响,并初步探讨其作用机制。方法:将SF3B1基因RNA干扰慢病毒载体(LV-SF3B1-RNAi)转染MDA-MB-231细胞,以敲减SF3B1基因。实验分为阴性对照组(转染空载体)和SF3B1敲减组(转染SF3B1-shRNA-1和SF3B1-shRNA-2)。采用qPCR和Western blot检测SF3B1的敲减效率;分别用MTT法和集落形成实验检测SF3B1敲减对细胞生长及集落形成能力的影响;Transwell小室法测定SF3B1敲减对细胞侵袭和迁移能力的影响;annexin V-APC单染法结合流式细胞术检测SF3B1敲减对细胞凋亡的影响;采用转录组测序检测SF3B1敲减后的差异表达基因及富集的信号通路。结果:MTT结果显示,SF3B1敲减组MDA-MB-231细胞的A值在96和120 h均显著低于阴性对照组(P<0.01);SF3B1敲减组的集落形成数显著低于阴性对照组(P<0.01),凋亡率显著高于阴性对照组(P<0.01),侵袭和迁移细胞数均显著低于阴性对照组(P<0.01);SF3B1敲减后差异表达基因富集的信号通路包括RAS信号通路、紧密连接、MAPK信号通路等。结论:在MDA-MB-231乳腺癌细胞中敲减SF3B1可能通过RAS等信号通路的异常抑制细胞增殖、迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。

老年非创伤性股骨头坏死组织中Rap1-PI3K/Akt信号通路表达特点及作用

目的探讨老年非创伤性股骨头坏死组织中Ras相关蛋白(Rap)1-磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路表达特点及作用。方法老年非创伤性股骨头坏死患者50例为非创伤性股骨头坏死组,同期老年创伤性股骨头坏死患者50例为创伤性股骨头坏死组。非创伤性股骨头坏死组取两个区域(坏死区、正常区)骨组织样本,创伤性股骨头坏死组取正常区域骨组织标本,进行苏木精-伊红(HE)和免疫组化染色,实时荧光定量PCR、Western印迹检测Rap1、血管内皮生长因子(VEGF)、PI3K、Akt mRNA和蛋白表达水平。结果HE染色显示,非创伤性股骨头坏死区域软骨细胞数量明显减少,软骨下骨小梁增厚、断裂,细胞核消失,出现软骨陷窝,周围新生毛细血管和纤维母细胞等肉芽组织长入坏死组织,出现肉芽组织增生。免疫组化染色显示,非创伤性股骨头坏死组组织坏死区域Rap1、VEGF、PI3K、Akt表达强度(■)弱于非创伤性股骨头坏死组组织正常区域(■)、创伤性股骨头坏死组组织正常区域(■)。非创伤性股骨头坏死组骨组织坏死区的Rap1、VEGF、PI3K、Akt mRNA和蛋白表达水平明显低于非创伤性股骨头坏死组骨组织正常区、创伤性股骨头坏死组骨组织正常区(P<0.05);两组骨组织正常区Rap1、VEGF、PI3K、Akt mRNA和蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论Rap1-PI3K/Akt信号通路激活受限造成血管内皮损伤,进而导致老年非创伤性股骨头坏死。

ERK1/2信号通路阻断剂PD98059对慢性高原病患者骨髓有核红细胞中Ras、BRaf、MEK、ERK1/2表达的影响

目的:探讨ERK1/2信号通路阻断剂PD98059对Ras、B型丝/苏氨酸蛋白激酶(BRaf)、丝裂原活化蛋白激酶(MEK)、细胞信号调节激酶1/2(ERK1/2)表达的影响,以期为慢性高原病(chronic mountain sickness,CMS)的基础研究和临床治疗探讨新的途径。方法:选取CMS患者16例,取骨髓液分离单个核细胞,以CD71与CD235a抗体磁珠分选阳性细胞,将细胞分为5组:空白对照组、DMSO溶剂组及PD98059 5、10和20μmol/L组。在低氧条件下培养72 h,应用ELISA法测定培养骨髓有核红细胞上清液中Ras-GTP水平,RT-PCR法测定骨髓有核红细胞中BRaf、MEK、ERK1/2 mRNA的表达,Western blot方法检测骨髓有核红细胞中p-BRaf、p-MEK、pERK1/2蛋白表达。结果:PD98059对各组Ras-GTP的水平无明显影响(P=0.798)。溶剂组与空白对照组相比,BRaf、MEK mRNA的表达水平差异无统计学意义(P=0.826、P=0.298)。与PD98059 20 mol/L比较,其余4组ERK1/2 mRNA的表达水平差异有统计学意义(P=0.001、P=0.002)。溶剂组与空白对照组相比,p-BRaf、p-MEK蛋白的表达差异无统计学意义(P=0.370、P=0.351)。与PD98059 20 mol/L比较,其余4组p-ERK1/2蛋白水平差异有统计学意义(P<0.001、P<0.007)。结论:PD98059能下调骨髓有核红细胞ERK1/2 mRNA及p-ERK1/2蛋白的表达。Ras/Raf/MEK/ERK 1/2通路是调控CMS骨髓有核红细胞的主要信号传导途径,可能参与了慢性高原病的发病过程。

Ras信号通路在HIV-1 Tat诱导ZO-1及脑啡肽酶破坏的作用

目的探讨Ras信号传导通路在人类免疫缺陷病毒-1型反式转录激活因子(HIV-1 transactivator of transcription,HIV-1 Tat)诱导血脑屏障(BBB)中紧密连接蛋白Zonula Occludens(ZO)-1及脑啡肽酶(Neprilysin,NEP)破坏的作用。方法以不同浓度Ras信号传导通路抑制剂法尼基硫代水杨酸(farnesylthiosalicylic acid,FTS)刺激培养好的人脑微血管内皮细胞(human cerebral microvascular endothelium cells,HBEC-5i),并设立对照组,观察其对细胞活力的影响。分别予以HIV-1 Tat、FTS刺激细胞,以蛋白免疫印迹法及实时反转录聚合酶链式反应(realtime reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)检测HIV-1 Tat诱导的紧密连接蛋白ZO-1及NEP(脑内降解β淀粉样蛋白Amyloid-beta,Aβ的限速酶)的蛋白和mRNA表达的变化。结果 FTS在20μmol/L(0.35±0.06)以下时对HBEC-5i活力无明显影响(P>0.05),HIV-1 Tat能抑制HBEC-5i的ZO-1、NEP蛋白(0.53±0.07,P<0.01;0.40±0.04,P<0.05)与mRNA(0.42±0.10,P<0.05;0.31±0.09,P<0.05)的表达。用FTS阻断Ras信号通路后可显著增加ZO-1、NEP蛋白(1.20±0.22,P<0.01;0.58±0.03,P<0.05)及mRNA(1.10±0.19,P<0.05;0.97±0.38,P<0.05)的表达。结论 HIV-1 Tat可促进紧密连接蛋白ZO-1蛋白和mRNA下调而导致血脑屏障破坏,同时诱导脑内脑啡肽酶NEP蛋白和mRNA下调,可能导致Aβ在脑内沉积增加。阻断Ras信号传导通路可抑制HIV-1 Tat诱导的ZO-1和NEP破坏,可能减少Aβ在脑内的沉积。

化浊解毒方对慢性萎缩性胃炎大鼠Hippo信号通路相关蛋白RASSF1A、SAV1、MST2表达的影响

目的观察化浊解毒方对慢性萎缩性胃炎(CAG)大鼠Hippo信号通路哺乳动物不育系20样激酶2(MST2)、RAS相关区域家族亚型A(RASSF1A)、含WW结构域的人同源重组蛋白1(SAV1)表达的影响,探讨其可能的作用机制。方法采用联合造模法制备CAG大鼠模型,成模大鼠随机分为模型组、维酶素组和化浊解毒方高、中、低剂量组,每组10只,同时设正常组10只。正常组和模型组给予蒸馏水灌胃,维酶素组给予维酶素混悬液灌胃,化浊解毒方高、中、低剂量组给予相应剂量药液灌胃,连续12周。HE染色观察大鼠胃黏膜组织病理变化,RT-qPCR和Western blot分别检测大鼠胃黏膜组织RASSF1A、SAV1、MST2 mRNA和蛋白的表达。结果与正常组比较,模型组大鼠胃黏膜组织RASSF1A、SAV1、MST2 mRNA和蛋白表达明显降低(P<0.05);与模型组比较,化浊解毒方高、中剂量组和维酶素组大鼠胃黏膜组织RASSF1A、SAV1、MST2 mRNA和蛋白表达均明显升高(P<0.05),其中化浊解毒方高剂量组升高最明显。结论化浊解毒方具有干预CAG大鼠和延缓癌变进展的作用,其机制可能与上调模型大鼠抑癌基因RASSF1A、SAV1、MST2的表达相关。

基于AQP4、Kir4.1及Ras/Raf-1/ERK信号通路和F-ERG探讨活血通络方对视网膜静脉阻塞大鼠视网膜功能的影响

目的观察视网膜分支静脉阻塞大鼠应用活血通络方后视网膜组织内AQP4、Kir4.1及Ras/Raf-1/ERK1/2的表达及电生理变化。方法将SD大鼠分为正常空白对照组、实验对照组、中药实验组。采用眼底视网膜激光机光凝视网膜分支静脉。实验对照组给予生理盐水2 ml每日灌胃1次,中药实验组给予活血通络方2 ml每日灌胃1次。应用电生理闪光ERG(F-ERG)观察造模前、造模后第3天、第6天的视网膜双极细胞功能变化。应用Westernblot方法,于造模后第6天,观察水通道蛋白4(Aquaporin-4,AQP4)、钾离子通道4.1(Kir4.1)及Ras/p-Raf-1/p-ERK1/2的表达情况。结果视网膜分支静脉阻塞发生后,F-ERG示大鼠视网膜功能下降,但中药实验组功能好于实验对照组;造模后AQP4、Kir4.1及Ras/p-Raf-1/p-ERK1/2表达增高,但中药实验组结果均低于实验对照组。结论活血通络方能够抑制AQP4、Kir4.1;Ras/Raf-1/ERK1/2信号通路的表达,有助于受损的视网膜功能恢复。

吉祥草中甾体皂苷RCE-4对人宫颈癌Caski细胞Ras/Erk和p16/cyclinD1/CDK4通路的影响

目的:研究吉祥草中甾体皂苷RCE-4影响Ras/Erk和p16/cyclin D1/CDK4信号通路促进Caski细胞凋亡的作用机制。方法:体外培养人宫颈癌Caski细胞株,用RCE-4作为处理因素,MTT法检测细胞增殖活力;流式细胞术检测细胞周期分布;Real-time PCR检测p16、cyclin D1和CDK4m RNA表达水平;Western blot检测Ras/Erk信号通路总蛋白和磷酸化蛋白表达水平。结果:RCE-4呈剂量依赖性抑制Caski细胞增殖,其作用24 h的IC50值为12.33μmol/L;升高G0/G1期细胞比例,降低S期细胞比例;抑制Ras、p-Raf、p-Mek1/2和p-Erk1/2蛋白表达,降低p-Raf/Raf、p-Mek1/2/Mek1/2和p-Erk1/2/Erk1/2比值,上调p16的m RNA表达,下调cyclin D1和CDK4的m RNA表达。结论:RCE-4可抑制Caski细胞的增殖,诱导细胞在G0/G1期阻滞,其诱导作用与其抑制Ras/Erk和p16/cyclin D1/CDK4信号通路激活有关。

大鼠增殖抑制基因通过Ras-Raf-MEK-ERK信号通路抑制C6胶质瘤细胞增殖

目的探讨Ras-Raf-MEK-ERK通路在大鼠增殖抑制基因(r HSG)抑制C6大鼠胶质瘤细胞增殖中的作用。方法用r HSG过表达腺病毒载体(Adv-r HSG-GFP)转染C6细胞后,流式细胞仪分析腺病毒转染效率;Western blot检测r HSG蛋白表达变化;流式细胞仪分析细胞周期;qRT-PCR检测H-ras、N-ras、K-ras、Erk1、Erk2基因mRNA表达变化;Western blot检测H-ras、N-ras、K-ras、p-Erk1/2、Erk1/2、p-Rb、Rb蛋白表达变化。结果腺病毒载体能高效的转染C6细胞并表达GFP蛋白,Adv-r HSG-GFP组r HSG蛋白表达显著高于未转染组(PBS)和AdvGFP组,C6细胞被阻滞于G0/G1期(P<0.01);经IGF-1刺激后,Adv-r HSG-GFP组细胞H-ras、N-ras、K-ras、Erk1、Erk2基因的mRNA和蛋白表达水平与PBS组和Adv-GFP组无明显差异(P>0.05);Adv-r HSG-GFP组细胞过表达r HSG能显著抑制IGF-1诱导的Erk1/2的活化,p-Erk1/2蛋白表达量显著低于其余两组(P<0.01);同时其p-Rb蛋白的表达量显著低于其余两组(P<0.01),而Rb蛋白表达量3组无明显差异(P>0.05)。结论 r HSG可能通过抑制Ras-Raf-MEK-ERK信号通路的激活抗C6恶性胶质瘤细胞增殖。

益气活血汤对急性心肌梗死模型大鼠Ras、ERKl、p-ERKl和C-Raf-1表达的影响

目的探讨益气活血汤对急性心肌梗死(AMI)模型大鼠缺血心肌Ras、ERKl(extracellularsignal regulated kinasel)、p-ERKl(phosphor-ERKl)和C-Raf-1蛋白表达的影响。方法将Wistar大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、倍他乐克组和益气活血汤大、小剂量组(下称大、小剂量组)。采用大鼠冠状动脉左前降支结扎构造急性心肌梗死(AMI)的心肌缺血模型。通过免疫组化法检测缺血心肌的Ras、ERKl、p-ERKl及C-Raf-1的蛋白表达。结果模型组Ras、ERKl、p-ERKl及CRaf-1的蛋白表达均高于空白组、假手术组,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。Ras、C-Raf-1蛋白表达:小剂量组与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05);大剂量组及倍他乐克组与模型组比较均有增高(P<0.05或P<0.01)。ERK1、p-ERK1蛋白表达:大、小剂量及倍他乐克组与模型组比较均有增高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。四个因子在大剂量组的表达均较小剂量组增多更明显(P<0.05)。结论益气活血汤可能是通过提高Ras通路相关蛋白表达来促进缺血后心肌的血管生成,抑制心肌缺血的损伤。

类风湿性关节炎患者外周血单个核细胞MALAT1表达降低、 hsa-miR155-3p表达增加并参与Notch信号通路调节

目的观察类风湿性关节炎(RA)患者长链非编码RNA(lncRNA)转移相关肺腺癌转录本1(MALAT1)、hsa-miR155-3p表达及其与Notch信号通路关系,探讨RA可能发病机制。方法采取RA患者(RA组)、健康对照者(NC组)外周血,采用高通量基因测序筛选差异表达的lncRNA和mRNA。利用反转录PCR检测筛选的lncRNA MALAT1和hsa-miR155-3p及Notch信号通路受体配体表达。结果通过lncRNA测序分析发现,共有9158条差异表达的lncRNA。基因本体(GO)功能分类注释得出差异表达的mRNA参与免疫炎症反应、细胞转录调节等。通过通路(pathway)分析显示差异表达的mRNA与免疫炎症、应激、Notch通路等功能基因变化有关。经顺式(Cis)和反式(Trans)预测,Jagged1/2、Delta1/2、Notch1/2可能与RA发生密切相关。与NC组相比,RA组MALAT1降低,hsa-miR155-3p明显升高;Notch通路配体Delta1、Delta2、Jagged1、Jagged2及受体Notch1、Notch2表达升高。相关性分析显示,hsa-miR155-3p与MALAT1呈负相关,hsa-miR155-3p与Notch通路Delta1、Jagged1呈正相关,MALAT1与Jagged2呈负相关。结论RA患者lncRNA MALAT1降低、hsa-miR155-3p增加,共同调节Notch信号通路变化。

RASSF1A基因在人乳腺癌细胞株MCF-7中的表达及对细胞增殖凋亡、体内成瘤能力的影响观察

目的观察Ras相关区域家族1异构体A(RASSF1A)基因在人乳腺癌细胞株MCF-7中的表达及对细胞增殖、凋亡、体内成瘤能力的影响,并探讨其作用的可能机制。方法取MCF-7细胞,分别感染RASSF1A过表达慢病毒oe-RASSF1A和空白载体慢病毒vector,记为oe-RASSF1A组和vector组。两组细胞继续培养72 h,采用qRT-PCR法检测两组细胞中的RASSF1A mRNA。两组细胞在培养24、48、72、96 h时,采用MTS法观察两组细胞增殖能力(以OD值表示细胞增殖能力)。两组细胞继续培养72 h,采用流式细胞仪测算各细胞周期比例。两组细胞继续培养72 h,采用流式细胞仪测算细胞凋亡率。两组细胞继续培养72 h,取1×10~7个细胞重悬于100μL PBS中,分别注射入10只4周龄雌性裸鼠右侧腋下,常规饲养4周后处死,解剖瘤体并称重,以瘤体重表示体内成瘤能力。两组细胞继续培养72 h,采用Western Blotting法检测两组细胞中的RASSF1A、磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)、磷酸化PI3K(pPI3K)、蛋白激酶B(AKT)和磷酸化AKT(pAKT)蛋白。结果oe-RASSF1A组细胞中RASSF1A mRNA相对表达量为13.25±3.20,vector组为1.00±0.03,两组相比,P<0.05。oe-RASSF1A组细胞在培养24、48、72、96 h时的OD值分别为0.36±0.02、0.53±0.06、0.74±0.13、0.91±0.07,vector组分别为0.35±0.03、0.62±0.14、0.95±0.08、1.34±0.21,在培养72、96 h时两组的OD值相比,P均<0.05。oe-RASSF1A组细胞处于G0/G1期、S期、G2/M期的比例分别为60.02%±3.21%、18.30%±2.31%、22.11%±1.03%,vector组分别为63.67%±4.16%、21.04%±2.65%、15.32%±2.52%,oe-RASSF1A组细胞处于G2/M期的比例与vector组相比,P<0.05。oe-RASSF1A组细胞凋亡率为24.38%±5.80%,vector组为4.25%±0.92%,两组相比,P<0.05。注射oe-RASSF1A组细胞的裸鼠成瘤的瘤体重为(63.29±14.03)mg,注射vector组细胞的裸鼠成瘤的瘤体重为(104.58±17.52)mg,两组相比,P<0.05。oe-RASSF1A组细胞RASSF1A、PI3K、pPI3K、AKT、pAKT蛋白相对表达量分别为8.67±1.32、0.86±0.21、0.26±0.15、0.91±0.11、0.30±0.07,vector组分别为1.05±0.04、1.00±0.00、1.01±0.01、1.04±0.04、1.00±0.00,两组细胞RASSF1A、pPI3K、pAKT蛋白相对表达量相比,P均<0.05。结论感染RASSF1A过表达慢病毒oe-RASSF1A的MCF-7细胞RASSF1A mRNA升高;过表达RASSF1A可抑制MCF-7细胞增殖、诱导细胞周期阻滞在G2/M期、促进细胞凋亡、抑制细胞体内成瘤能力,其机制可能与RASSF1A抑制PI3K/AKT信号通路有关。

基于肉瘤基因信号通路探讨槲皮素对乳腺癌MCF-7细胞的作用机制

目的:探讨槲皮素通过RAS/RAF/MEK1信号通路对乳腺癌MCF-7细胞的作用机制。方法:将乳腺癌MCF-7细胞分为空白对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、极高剂量组,采用CCK-8细胞活力检测法测定不同组别的MCF-7细胞24 h、48 h、72 h的细胞活性;采用流式细胞术检测不同组别MCF-7细胞的凋亡率;采用蛋白质印迹法检测不同组别MEK1、RAS、YAP蛋白的表达;采用免疫荧光染色观察雌激素受体、孕激素受体染色情况。结果:与空白对照组比较,低剂量组、中剂量组、高剂量组及极高剂量组的MCF-7细胞活力均出现下降,呈浓度依赖,不具有时间依赖性,差异有统计学意义(P<0.05);乳腺癌细胞MCF-7的晚期凋亡率明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);低剂量组、中剂量组和极高剂量组MCF-7细胞的MEK1、RAS、YAP蛋白的表达出现不同程度下降,差异有统计学意义(P<0.05);低剂量组、中剂量组、高剂量组及极高剂量组的MCF-7细胞中雌激素受体、孕激素受体表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:槲皮素具有针对乳腺癌MCF-7细胞的抗肿瘤作用,且具有浓度依赖性,其机制可能与对RAS/RAF/MEK1信号通路的抑制有关。

虎杖苷调节cAMP/EPAC1/RAP1信号通路对子宫内膜癌细胞恶性生物学行为的影响

目的 探讨虎杖苷调节环磷酸腺苷(cAMP)/环磷酸腺苷结合蛋白1(EPAC1)/Ras相关蛋白1(RAP1)信号通路对子宫内膜癌细胞恶性生物学行为的影响。方法 研究时间为2022年8月-2023年8月。以子宫内膜癌Ishikawa细胞为研究对象,分为空白组、虎杖苷-L组(25μmol/L虎杖苷)、虎杖苷-M组(50μmol/L虎杖苷)、虎杖苷-H组(100μmol/L虎杖苷)、Forskolin组(cAMP激活剂,100μmol/L Forskolin)以及虎杖苷-H+Forskolin组(100μmol/L虎杖苷+100μmol/L Forskolin)。分别以克隆形成实验、Transwell实验、划痕实验、TUNEL法、CCK-8法、Western Blot检测细胞克隆数、侵袭、迁移、凋亡、增殖及EPAC1、RAP1、凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表达。采用ELISA法检测细胞培养基中cAMP水平。结果 与空白组相比,Forskolin组细胞克隆数[(195.66±19.62)个]、侵袭数[(281.52±28.22)个]、迁移率[(82.61±8.31)%]、增殖率[(125.64±12.59)%]、cAMP水平[(1 385.54±138.56)pmol/ml]、EPAC1(1.56±0.16)、RAP1(2.11±0.22)、MMP-9(1.88±0.19)表达显著增加,凋亡率[(5.47±0.56)%]、Cleaved Caspase-3(0.26±0.03)表达均降低(均P<0.05),虎杖苷-L组、虎杖苷-M组、虎杖苷-H组细胞克隆数[(105.34±10.57)个、(65.34±6.58)个、(42.27±4.25)个]、侵袭数[(185.72±18.66)个、(145.47±14.58)个、(112.59±11.29)个]、迁移率[(40.21±4.06)%、(31.12±3.12)%、(21.34±2.15)%]、增殖率[(68.37±6.86)%、(48.67±4.88)%、(35.24±3.55)%]、cAMP水平、EPAC1、RAP1、MMP-9表达显著降低,凋亡率[(19.85±1.99)%、(27.34±2.77)%、(36.44±3.66)%]、Cleaved Caspase-3表达均增加(均P<0.05)。与Forskolin组相比,虎杖苷-H+Forskolin组细胞克隆数、侵袭数、迁移率、增殖率、cAMP水平、EPAC1、RAP1、MMP-9表达均显著降低,凋亡率、Cleaved Caspase-3表达均显著增加(均P<0.05)。与虎杖苷-H组相比,虎杖苷-H+Forskolin组细胞克隆数、侵袭数、迁移率、cAMP水平、EPAC1、RAP1、MMP-9表达均显著增加,凋亡率、增殖率、Cleaved Caspase-3表达均显著降低(均P<0.05)。结论 虎杖苷可抑制子宫内膜癌细胞恶性生物学行为发展,可能与抑制cAMP/EPAC1/RAP1信号通路有关。

丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶信号通路在穿心莲内酯治疗心肌缺血/再灌注损伤大鼠中的分子机制

目的:从丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK1/2)信号通路研究穿心莲内酯(AG)对心肌缺血/再灌注损伤(MI/RI)大鼠的分子机制,为AG能够安全地用于MI/RI的预防提供参考。方法:雄性SPF级SD大鼠60只,购入后先全部予适应性喂养2周,后将其随机分为假手术组、模型组、银杏内酯B干预组,AG治疗组(低、中和高三个剂量组),每组10只,分组后于次日给予每个组别相应药物干预14 d,14 d后采用经典法构建MI/RI模型(心肌缺血30 min,再灌注120 min),随后采集血液检测乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和肌钙蛋白I(cTnI)含量,同时采集心肌,检测心肌组织病理学、心肌Ca^(2+)-Mg^(2+)-ATP活力、Na^(+)-K^(+)-ATP活力、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)含量,最后采用免疫印迹法检测心肌丝裂原活化蛋白激酶p38(p38-MAPK)和细胞外调节蛋白激酶(p-ERK1/2)蛋白表达特点。结果:组织病理学表现为假手术组心肌细胞排列整齐、细胞呈长纤维状,模型组心肌纤维则出现明显且大量的断裂,与模型组相比,各治疗组均有不同程度好转;与假手术组比较,模型组大鼠血清LDH、CK-MB、cTnI、心肌MDA和心肌p38-MAPK蛋白表达均明显升高(P<0.05)、心肌SOD、Ca^(2+)-Mg^(2+)-ATP、Na^(+)-K^(+)-ATP、心肌p-ERK1/2蛋白表达均明显降低(P<0.05);与模型组相比,银杏内酯B组和AG低、中和高剂量组血清LDH、CK-MB、cTnI、心肌MDA以及心肌p38-MAPK蛋白表达均明显降低(P<0.05),心肌SOD、Ca^(2+)-Mg^(2+)-ATP、Na^(+)-K^(+)-ATP和心肌p-ERK1/2蛋白表达均明显升高(P<0.05)。结论:AG预防给药,能够有效的保护MI/RI大鼠心肌及心功能,其作用机制可能与AG能够调节MAPK/ERK1/2信号通路有关。

PTPIP51、p-Raf-1及ERK1/2在口腔鳞状细胞癌中的表达

目的探讨PTPIP51和p-Raf-1及ERK1/2在口腔鳞状细胞癌中的表达及对口腔鳞癌侵袭、转移的影响。方法收集32例口腔鳞状细胞癌及其配对癌旁正常口腔黏膜组织。用免疫荧光组织化学染色激光共聚焦显微镜检测PTPIP51与p-Raf-1蛋白在组织切片内表达及定位;PBS冲洗后对标本进行苏木精-伊红染色,普通光镜对比观察组织结构及细胞形态,同时用免疫组织化学方法(SP法)检测PTPIP51蛋白在组织和细胞内的定位;Rea-ltime PCR检测PT-PIP51与ERK1/2基因mRNA在肿瘤组织及癌旁正常口腔黏膜组织的表达情况。结果 PTPIP51与p-Raf-1蛋白在癌巢周围增殖旺盛的肿瘤细胞、间质免疫细胞及部分脉管壁内皮细胞表达阳性且2种蛋白在细胞中共定位表达。同时发现PTPIP51与ERK1/2基因mRNA在口腔鳞癌组织表达高于配对癌旁正常口腔黏膜组织,差异具有统计学意义(P<0.05);ERK1/2及PTPIP51基因mRNA表达呈正相关(r=0.641,P<0.05);两者的表达水平与患者的性别、年龄,病理分级无关,与肿瘤的TNM分级及有无淋巴结转移有关(P<0.05)。结论 PTPIP51与Raf-1可能通过Ras/Raf/MEK/ERK信号通路参与口腔鳞状细胞癌的发生、发展过程,且2种蛋白与肿瘤的侵袭、转移有密切关系。

白芍总苷调节RhoA/ROCK1信号通路对大鼠肝缺血再灌注损伤的影响

目的 探讨白芍总苷通过调节Ras同源基因家族成员A/Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶1(RhoA/ROCK1)信号通路对大鼠肝缺血再灌注损伤的影响。方法 通过阻断肝动脉和门静脉1 h建立肝缺血再灌注损伤大鼠模型,设假手术组、模型组、白芍总苷(100 mg/kg)组、白芍总苷+Rhosin(100 mg/kg+40 mg/kg)组和白芍总苷+LPA(100 mg/kg+1 mg/kg)组,每组8只。连续治疗6周后,检测各组大鼠血清肝功能指标[丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBiL)];HE、TUNEL染色法观察肝组织病理改变和细胞凋亡,并计算肝损伤评分和凋亡指数(AI);分光光度法检测肝组织中氧化应激指标[超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量],ELISA检测炎症因子[白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)]含量;通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western blotting)法检测肝组织中RhoA、ROCK1、核因子-κB p65(NF-κB p65)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活化型半胱氨酸蛋白酶-3(C-Caspase-3)m RNA和蛋白表达。结果 与模型组比较,白芍总苷组和白芍总苷+Rhosin组血清ALT、AST、TBiL水平显著降低(P<0.05);肝组织病理改变和细胞凋亡状况均明显改善,肝损伤评分和细胞AI均显著降低(P<0.05);SOD、CAT活性显著升高,MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α含量显著降低(P<0.05);RhoA、ROCK1、NF-κB p65、Bax、C-Caspase-3m RNA和蛋白表达均显著降低,Bcl-2m RNA和蛋白表达均显著升高(P<0.05)。与白芍总苷组相比,Rhosin可显著增强白芍总苷对模型大鼠肝功能、肝组织病变、细胞凋亡、氧化应激、炎症及RhoA/ROCK1信号通路相关m RNA和蛋白表达的作用;LPA则显著逆转了上述调控作用。结论 白芍总苷可能通过抑制RhoA/ROCK1信号通路,减轻氧化应激、炎症和细胞凋亡,从而对大鼠肝缺血再灌注损伤起到一定的保护作用。

Rac1b与恶性肿瘤关系的研究进展

Ras相关C3肉毒梭菌毒素1b(Rac1b)是Ras相关C3肉毒梭菌毒素1(Rac1)的一种剪接变异体,游走循环于GTP结合和GDP结合状态之间。Rac1b具有较低的GTP酶活性,且不能与GDP黏附,这就导致Rac1b活性的GTP结合状态居于主导地位,细胞的各项生命活动处于持续激活状态,从而引起细胞恶性转化。目前已有大量研究证实,Rac1b与肿瘤的失控增殖、迁移、侵袭等恶性生物学行为密切相关。