RAS信号途径参与干扰素-α抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖

目的探讨RAS信号途径在干扰素-α(IFN-α)抑制大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖中的作用。方法应用转染IFI204 siRNA和/或IFN-α瞬时干预体外培养的大鼠VSMCs,以非特异性siRNA转染组为对照组,用MTT法测定细胞活力,流式细胞仪分析细胞周期,RT-PCR法和Western blot分别检测P204 mRNA、P204和Ras蛋白的表达及RAF与ERK的磷酸化水平。结果与对照组比较,IFN-α组P204 mRNA和蛋白表达上调(P<0.01),细胞活力和细胞周期G1/S转换下调(P<0.01),伴RAS蛋白表达减少(P<0.01),RAF及ERK磷酸化水平下降(P<0.01);转染IFI204 siRNA后再加IFN-α干预,P204 mRNA及蛋白表达下调(P<0.01),而G0/G1期细胞增多,S期细胞减少(P<0.01),且RAS蛋白表达和RAF及ERK磷酸化水平亦下调(P<0.01)。结论 RAS信号途径参与IFN-α抑制大鼠VSMCs增殖。

干扰素α通过P204和RAS信号途径诱导大鼠血管平滑肌细胞凋亡

目的观察干扰素-α(IFN-α)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)凋亡的影响,并探讨其部分机制。方法将VSMCs分为A、B、C 3组,A组转染非特异性siRNA,B组予IFN-α干预后转染非特异性siRNA,C组予IFN-α干预后转染IFN诱导蛋白204基因(IFI204)siRNA,均培养至48 h收集细胞。反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测IFN诱导蛋白204(P204)mRNA表达,Western blot检测P204、RAS蛋白表达及RAF/ERK磷酸化变化,流式细胞仪Annexin-V FITC/PI法检测细胞凋亡。结果与A组比较,B组P204 mRNA和蛋白表达上调(P<0.05),细胞凋亡增多(P<0.05),伴RAS蛋白表达减少(P<0.05),RAF/ERK磷酸化水平下降(P<0.05);C组P204 mRNA及蛋白表达下调(P<0.05),细胞凋亡减少(P<0.05),RAS蛋白表达增多和RAF/ERK磷酸化水平上调(P<0.05)。结论 P204及RAS信号途径参与IFN-α诱导大鼠VSMCs凋亡过程的调控。

Mfn2基因抑制Ras-PI3K-Akt信号途径并诱导大鼠血管平滑肌细胞凋亡

目的应用腺病毒介导的转基因技术,研究过表达线粒体融合素基因-2(mitofusin-2,Mfn2)对WKY大鼠主动脉血管平滑肌细胞(rVSMCs)凋亡的影响并探讨其相关的信号通路。方法体外培养rVSMCs,感染含有Mfn2基因的腺病毒载体(Adv-Mfn2-GFP)。通过免疫组化染色显示细胞凋亡的形态学特征;采用琼脂糖凝胶电泳,Cell DeathELISA观察过表达Mfn2基因对细胞凋亡的影响;用Western blot检测感染Mfn2基因后不同时间点的磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)和磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)水平的变化。结果rVSMCs感染Adv-Mfn2-GFP后能有效表达出相应蛋白;过表达Mfn2基因能明显促进rVSMCs凋亡,并抑制ET-1诱导的Akt活化和ERK活化,此作用显示出时间依赖性,且Akt活化受到的抑制更明显。结论过表达Mfn2基因能明显促进WKY大鼠主动脉血管平滑肌细胞凋亡,其分子机制是抑制Ras信号途径的活化,分子作用靶点可能是Ras-PI3K-Akt信号通路。

PGE2/PGE2-R介导的RAS/ERK及PI3K/AKT信号途径与子宫肌瘤发病机制的研究

目的探讨前列腺素E2(PGE2)/前列腺素E2受体(PGE2-R)介导的RAS/ERK及PI3K/AKT信号途径与子宫肌瘤发病机制的关联。方法收集30例子宫肌瘤和其邻近正常的平滑肌组织,Real-time PCR检测样本PGE2-R(EP1)表达,Western blot检测PGE2和PGE2-R(EP1)的表达;培养子宫肌瘤原代细胞,分别加入PGE2-R(EP1)抑制剂sc-51322或激动剂17-PT-PGE2,分为原代细胞组、原代+sc-51322组和原代+17-PT-PGE2组;采用CCK8检测细胞增殖;RT-PCR检测增殖细胞核抗原(PCNA)、转化生长因子β(TGF-β)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)的表达;Western blot检测PGE2、PGE2-R(EP1)、PCNA、TGF-β、IGF-1、蛋白激酶B(AKT)、p-AKT、细胞外信号调节激酶(ERK)1/2、p-ERK1/2的表达。结果子宫肌瘤的PGE2-R(EP1)的mRNA表达量显著高于平滑肌组织(P<0.01)。子宫肌瘤组织PGE2和PGE2-R(EP1)的蛋白表达量亦显著高于正常平滑肌组织(P<0.01)。在培养72 h后,与原代细胞组比较,原代+sc-51322组细胞增殖受到显著抑制(P<0.01),而原代+17-PT-PGE2组中细胞的增殖活性显著增加(P<0.01)。原代+sc-51322组中细胞PCNA、TGF-β、IGF-1 mRNA表达量显著低于原代细胞组,原代+17-PT-PGE2组中细胞PCNA、TGF-β、IGF-1 mRNA表达量显著高于原代细胞组。原代+sc-51322组中的细胞PGE2、PGE2-R(EP1)、PCNA、TGF-β、IGF-1、p-AKT和p-ERK1/2蛋白表达量显著低于原代细胞组,原代+17-PT-PGE2组PGE2、PGE2-R(EP1)、PCNA、TGF-β、IGF-1、p-AKT和p-ERK1/2蛋白表达量显著高于原代细胞组(P<0.01)。结论 PGE2和PGE2-R(EP1)通过介导的RAS/ERK及PI3K/AKT信号途径来参与调控子宫肌瘤发病。

干扰素诱导蛋白16 siRNA对干扰素α诱导的人血管内皮细胞凋亡的影响

目的:探讨干扰素诱导蛋白16(IFI16)siRNA对干扰素-α(IFN-α)诱导的人血管内皮细胞(HVECs)凋亡的影响及其机制。方法:应用转染IFN-α和(或)IFI16siRNA瞬时干预体外培养的HVECs,分别设空白组为阴性对照组,IFN-α加非特异性siRNA转染组为对照组,RT-PCR法检测IFI16mRNA表达,流式细胞仪Annexin-V FITC/PI法检测细胞凋亡,Western blotting检测蛋白表达及细胞增殖信号通路相关蛋白磷酸化水平。结果:与阴性对照组比较,对照组及IFN-α组IFI16mRNA和蛋白表达上调,细胞凋亡增多,伴RAS蛋白表达减少,RAF、ERK磷酸化水平下降(P<0.01);IFN-α加IFI16siRNA组IFI16mRNA及蛋白表达下调,细胞凋亡减少,RAS蛋白表达增多,RAF及ERK磷酸化水平升高(P<0.01)。与对照组比较,IFN-α加IFI16siRNA组IFI16mRNA和蛋白表达减少,细胞凋亡减少,伴Ras蛋白表达增多,RAF、ERK磷酸化水平上调(P<0.01);而IFN-α组上述指标差异无统计学意义。在上述过程中,P38及AKT蛋白磷酸化水平无明显变化。结论:RAS信号途径参与IFI16siRNA抑制IFN-α诱导的HVECs凋亡。