Ras同源物基因家族成员B对肾透明细胞癌细胞生长及迁移能力的影响

目的研究干扰Ras同源物基因家族成员B(Ras homolog gene family member B,RhoB)表达后对肾透明细胞癌(renal clear cell carcinoma,RCCC)细胞生长及迁移能力的影响。方法检测RhoB在RCCC细胞中的蛋白表达水平,采用脂质体转染方法转染RhoB真核表达载体pcDNA3.0-Flag-RhoB和沉默RhoB的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)即si-RhoB序列及相应空载体和对照序列,应用Western Blot法检测转染后RhoB的蛋白表达情况,通过3-(4,5-二甲基吡啶-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sugophenyl)-2H-tetrazolium,MTS]法、平板克隆和Transwell小室细胞迁移实验检测细胞生长和细胞迁移能力的变化。结果 RhoB在RCCC细胞中表达降低。与转染空载体组比较,转染pcDNA3.0-Flag-RhoB重组质粒组RhoB的蛋白表达水平明显上调;与转染对照组比较,si-RhoB转染组RhoB的蛋白表达水平明显下调。在RCCC细胞786-O和Caki-1中,上调RhoB的表达后,在4、5、6 d经MTS法测定光密度值明显降低(P<0.05);在786-0细胞中上调RhoB表达后细胞克隆数明显减少;转染48 h后Transwell细胞迁移数明显减少(P<0.05)。而下调RhoB表达后,细胞生长和Transwell细胞迁移数没有明显变化。在相对高表达RhoB的正常人肾小管上皮细胞中下调RhoB表达后细胞生长和细胞迁移数明显增多。结论过表达RhoB后明显抑制RCCC细胞生长和迁移能力。

银杏叶提取物对糖尿病肾病模型小鼠肾脏炎症的抑制作用及机制

目的探讨银杏叶提取物(GBE)抑制糖尿病肾病(DN)模型小鼠肾脏炎症的作用及其可能机制。方法以高脂高糖喂养KK/Ay小鼠建立DN模型,并分为模型组、阳性对照组[二甲双胍200 mg/(kg·d)]和GBE低、高剂量组[100、200 mg/(kg·d)],每组6只;另取普通饲料喂养的C57BL/6J小鼠6只,作为对照组。各药物组小鼠灌胃相应药液,对照组和模型组小鼠灌胃等体积生理盐水,每天1次,连续8周。检测小鼠的体重、空腹血糖、24 h摄食量、24 h尿量和血清单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、白细胞介素12(IL-12)、IL-10、晚期糖基化终末产物(AGEs)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)水平,计算其双侧肾脏质量与体重的比值,观察其肾皮质的病理损伤和纤维化改变,并检测其肾皮质中巨噬细胞极化标志蛋白[M1型:诱导型一氧化氮合酶(iNOS);M2型:精氨酸酶1(Arg-1)]和AGEs-晚期糖基化终末产物受体(RAGE)/Ras同源基因家族成员A(RhoA/)/Rho相关螺旋卷曲蛋白激酶(ROCK)信号通路相关蛋白的表达情况。结果与模型组比较,GBE低、高剂量组小鼠肾皮质增生、空泡、炎症细胞浸润、肾皮质纤维化等症状均有所好转;其体重、血清IL-10水平、肾皮质中Arg-1蛋白的表达水平均显著高于模型组(P<0.01);空腹血糖和24 h摄食量、尿量,血清MCP-1、IL-12、BUN、Scr、AGEs水平,双侧肾脏质量与体重的比值,肾损伤评分和肾间质纤维化比例,肾皮质中iNOS、RAGE、RhoA、ROCK1(GBE低剂量组除外)蛋白的表达水平均显著低于模型组(P<0.01)。结论GBE可改善DN模型小鼠的肾损伤,并减轻其炎症反应,其机制可能与抑制AGEs-RAGE/RhoA/ROCK信号通路、调节巨噬细胞极化有关。

沉默Ras同源物家族成员C对唾液腺腺样囊性癌增殖、侵袭和迁移的影响

目的探讨沉默Ras同源物家族成员C(RhoC)对唾液腺腺样囊性癌(SACC)增殖、凋亡、侵袭、迁移和上皮-间充质转化(EMT)的影响及其分子机制。方法选择2019年1月1日—2024年3月1日于青岛市市立医院手术切除的SACC病灶和正常唾液腺组织各27例,通过蛋白免疫印迹(Western blot)和免疫组织化学法检测RhoC的表达水平。针对RhoC基因序列设计3条小干扰RNA(siRNA),转染至SACC-LM和SACC-83细胞系中并评估转染效率。通过Western blot比较RhoC、Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶1(ROCK1)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)、扭曲家族bHLH转录因子1(TWIST1)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)的蛋白表达水平。CCK-8实验、流式细胞术、Transwell侵袭实验、伤口愈合实验分别检测各组细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移能力的差异。生物信息学方法预测RhoC可能的上游微小RNA(miRNA)及其在SACC中的表达情况,双荧光素酶报告基因实验验证二者的结合位点。结果RhoC在SACC中的表达显著上升(P<0.05)。沉默RhoC后,实验组ROCK1、p-p38MAPK、TWIST1、N-cadherin、Vimentin的表达显著下降,E-cadherin的表达显著上升(P<0.05);p38MAPK的表达无明显差异(P>0.05);细胞增殖、侵袭和迁移能力显著下降,凋亡率显著上升(P<0.05)。miR-138-5p在SACC中低表达,miR-138-5p micmic可以显著下调转染RhoC野生型质粒后293T细胞的荧光素酶活性(P<0.05)。结论RhoC在SACC中高表达,沉默RhoC可能靶向下游ROCK1/p38MAPK/TWIST1信号通路从而抑制SACC的增殖、侵袭、迁移和EMT,同时促进其凋亡。miR-138-5p在SACC中低表达,是RhoC潜在的上游基因,二者可能存在结合位点。

人Ras同源物基因家族成员B真核表达载体的构建及对肾癌细胞786—0增殖和凋亡的影响

目的观察人Ras同源物基因家族成员B（RhoB）对肾癌细胞株786一O细胞增殖和凋亡的影响。方法构建pcDNA3．0-Flag—RhoB真核表达载体，脂质体转染法将其转入肾癌细胞786一O，利用Westernblot检测细胞中RhoB的表达。用MTS法和流式细胞仪检测RhoB对肾癌细胞增殖和凋亡效应的影响。结果真核表达载体pcDNA3．0-Flag-RhoB构建成功，脂质体转染后RhoB在786一O细胞中表达明显升高；在转染后48、72、96h，重组质粒组细胞的增殖速度明显低于空载体组和阴性对照组（P〈0．05）；转染重组质粒细胞凋亡率为（24．05±0．60）％，明显高于空载体组[（1．67±0．30）％]和阴性对照组[（1．22±0．50）％，P〈0．05]。结论RhoB对肾癌细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用。

四君子汤含药血清通过抑制RhoA/Rac1/Cdc42通路影响卵巢癌细胞的上皮间质转化

目的探索四君子汤含药血清对卵巢癌细胞增殖迁移、侵袭及上皮间质化的影响,并初步研究其作用机理。方法体外培养人卵巢癌细胞(SKOV3)和人卵巢上皮细胞,随机分为空白对照组、舒尼替尼组、四君子汤Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组。噻唑蓝法检测各组SKOV3细胞和人卵巢上皮细胞增殖变化情况;划痕实验和侵袭(transwell)实验检测各组SKOV3细胞迁移和侵袭能力;蛋白免疫印迹分析法检测各组SKOV3细胞上皮型钙粘蛋白(Ecadherin)、神经性钙黏附蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、Ras同源基因家族成员A(RhoA)、Ras相关的C3肉毒素底物1(Rac1)和细胞分裂周期蛋白42(Cdc42)蛋白表达情况;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测各组SKOV3细胞RhoA、Rac1和Cdc42 mRNA表达变化。结果各组人卵巢上皮细胞存活率差异无统计学意义(P>0.05)。与空白对照组相比,舒尼替尼组SKOV3细胞存活率、划痕愈合率、侵袭数量、N-cadherin、Vimentin蛋白、RhoA、Rac1、Cdc42 mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.05),E-cadherin蛋白表达显著升高(P<0.05)。四君子汤Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组SKOV3细胞存活率、划痕愈合率、侵袭数量、N-cadherin、Vimentin蛋白、RhoA、Rac1、Cdc42 mRNA和蛋白表达依次降低(P<0.05),E-cadherin蛋白表达依次升高(P<0.05),呈剂量依赖性。四君子汤Ⅲ组上述指标和舒尼替尼组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论四君子汤含药血清能够抑制人卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭和上皮间质化,可能与RhoA/Rac1/Cdc42信号通路激活受阻相关。

miR-101对结直肠癌细胞放疗敏感性的影响及机制探讨

目的观察miR-101对结直肠癌细胞放疗敏感性的影响,并探讨其分子机制。方法取结直肠癌细胞株SW620、SW480,稳定过表达miR-101细胞株SW620(miR101-SW620)及其阴性对照GV209-SW620,瞬时沉默miR-101表达细胞株SW480(SW480-miR101)及其阴性对照SW480-NC,采用Western blotting法检测细胞中miR-101靶基因Ras相关的C3肉毒素底物1(Rac1)及其下游关键蛋白细胞分裂周期蛋白42(Cdc42)、人Ras同源基因家族成员A(Rho A)。取SW620、GV209-SW620、miR101-SW620细胞,分别给予0、2、4、6、8 Gy射线处理24 h;Western blotting法检测DNA损伤标志性蛋白γ-H2AX、细胞凋亡标志蛋白Caspase-3判断细胞放疗敏感性变化,同时检测细胞Rac1、Cdc42、Rho A蛋白。结果与SW620、GV209-SW620细胞比较,miR101-SW620细胞Rac1、Cdc42、Rho A蛋白表达降低(P均﹤0.05);与SW480、SW480-NC细胞比较,SW480-miR101细胞Rac1、Cdc42、Rho A蛋白表达均增高(P均﹤0.05)。随着照射剂量增加,结直肠癌细胞γ-H2AX、Caspase-3表达均增高,而Rac1、Rho A、Cdc42蛋白表达均降低(P均﹤0.05);与同等照射剂量下SW620、GV209-SW620细胞比较,miR101-SW620细胞γ-H2AX、Caspase-3蛋白表达均增高,而Rac1、Rho A、Cdc42蛋白表达均降低(P均﹤0.05)。结论 miR-101可能通过调控Rac1/Cdc42/Rho A信号通路增强结直肠癌细胞对放疗的敏感性。

左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症模型大鼠海马齿状回神经元树突及Wnt5a/RhoA信号通路的影响

目的探讨左归降糖解郁方治疗糖尿病并发抑郁症的可能作用机制。方法60只大鼠随机分为正常组、模型组、无翅型MMTV整合位点家族成员5a(Wnt5a)激动剂组、左归降糖解郁方组、左归降糖解郁方+Wnt5a抑制剂组,每组12只。除正常组外,其余各组大鼠采用高脂饲料饲养、链脲佐菌素注射和慢性温和不可预知应激联用法建立糖尿病并发抑郁症大鼠模型。造模成功后Wnt5a激动剂组大鼠给予双侧海马立体定位注射Wnt5a激动剂Foxy-5各5μl,连续7天;左归降糖解郁方组给予左归降糖解郁方20.52 g/(kg·d)灌胃;左归降糖解郁方+Wnt5a抑制剂组进行灌胃给药和双侧海马立体定位注射Wnt5a抑制剂Box5,给药剂量和注射方法同上。正常组和模型组给予10 ml/(kg·d)生理盐水灌胃。各组灌胃均连续4周。干预结束后采用强迫游泳实验(不动时间)和旷场实验(活动次数)评价大鼠的抑郁样行为;检测大鼠的血糖和胰岛素含量,并计算胰岛素抵抗指数;采用高尔基染色观察大鼠海马齿状回神经元的树突形态;采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)注射及免疫荧光检测齿状回神经元增殖水平;采用RT-qPCR和Western blot法检测齿状回Wnt5a、Ras同源物基因组成员A(RhoA)和Rho同源物相关卷曲螺旋蛋白激酶1(ROCK1)mRNA和蛋白表达。结果与正常组比较,模型组大鼠血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数均显著升高,不动时间显著延长,活动次数显著减少,海马齿状回中Brdu积分光密度值和Wnt5a、RhoA、ROCK1蛋白及mRNA表达均显著降低(P<0.05或P<0.01);大鼠海马齿状回神经元可见树突分支明显减少或断裂,长度缩短。与模型组比较,左归降糖解郁方组和左归降糖解郁方+Wnt5a抑制剂组大鼠血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数显著降低(P<0.05或P<0.01);Wnt5a激动剂组和左归降糖解郁方组大鼠不动时间显著缩短、活动次数显著增加、Brdu积分光密度值显著升高,Wnt5a、RhoA、ROCK1蛋白及mRNA表达均升高(P<0.05或P<0.01),海马齿状回神经元的树突分支数量显著增加、长度延长,树突的复杂性增加。与Wnt5a激动剂组比较,左归降糖解郁方组大鼠血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数显著降低,不动时间显著延长,活动次数显著减少,Brdu积分光密度值显著降低;除左归降糖解郁方组Wnt5a mRNA外,左归降糖解郁方组和左归降糖解郁方+Wnt5a抑制剂组Wnt5a、RhoA、ROCK1蛋白及mRNA表达均降低(P<0.05或P<0.01)。与左归降糖解郁方组比较,左归降糖解郁方+Wnt5a抑制剂组Wnt5a、RhoA、ROCK1蛋白及mRNA表达均降低(P<0.05或P<0.01)。结论左归降糖解郁方可改善糖尿病并发抑郁症模型大鼠的高血糖和抑郁样行为,其抗抑郁作用可能与激活海马Wnt5a/RhoA信号,促进齿状回神经元树突生长有关。

RhoA/ROCK/ERK-MAPK通路在高磷环境调节内皮细胞凋亡的机制

目的研究高磷环境下内皮细胞凋亡的可能调控机制和信号通路。方法人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)在正常磷(1.0 mmol/L)、高磷(3.0 mmol/L)、正常磷+辛伐他汀(simvastatin,SV,1.0 mmol/L+SV)及高磷+SV(3.0 mmol/L+SV)培养基中培养24 h,Western Blot评价Ras同源物基因家族成员A(Ras homolog gene family,member A,RhoA),Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1/2(rho-associated coiled coil forming protein kinase 1/2,ROCK1/2),细胞外信号调控激酶-丝裂原活化蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase-mitogen activated protein kinase,ERK-MAPK)、磷酸化细胞外信号调控激酶-丝裂原活化蛋白激酶(phosphorylated-ERK-MAPK,p-ERK-MAPK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38-Mitogen Activated Protein Kinase,p38-MAPK)、磷酸化p38-丝裂原活化蛋白激酶(phosphorylated-p38-MAPK,p-p38-MAPK)、以及精氨酸酶1(arginase1,ARG1)和一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,NOS)蛋白的表达,比色法和膜联蛋白V/碘化丙啶双染法(Annexin V-FITC/propidium iodide,Annexin V-FITC/PI)检测ARG活性和细胞凋亡率。结果高磷组RhoA,ROCK1/2,p-ERK MAPK,ARG1表达均上调,ARG活性升高,NOS表达下调,细胞凋亡增加;RhoA抑制剂SV能抑制高磷环境下p-ERK MAPK的活化和ARG1的表达,降低ARG1活性,促进NOS表达,减少内皮细胞凋亡。结论高磷环境HUVECs可通过RhoA/ROCK途径激活p-ERK MAPK的表达,增加ARG活性,抑制NOS表达,引起内皮细胞凋亡;SV可以通过抑制RhoA/ROCK/ERK-MAPK通路,改善内皮细胞凋亡。

隔药饼灸对动脉粥样硬化易损斑块模型兔腹主动脉RhoA/Rock信号通路的影响

目的探讨隔药饼灸稳定动脉粥样硬化(AS)易损斑块的可能作用机制。方法将50只新西兰兔随机分为空白组8只,模型组9只,直接灸组9只,隔药饼灸组7只,阿托伐他汀钙组9只,抑制剂组8只。除空白组外,其余各组通过"高脂饲养喂养+腹主动脉球囊损伤术+基因转染+触发斑块破裂"制作AS易损斑块兔模型。空白组、模型组不予操作;阿托伐他汀钙组给予阿托伐他汀钙片1.96 mg/(kg·d)喂养;抑制剂组予盐酸法舒地尔10 mg/(kg·d)沿耳缘静脉缓慢注射;直接灸组及隔药饼灸组分别直接灸及隔药饼灸,穴选Ⅰ组("巨阙"及双侧"天枢""丰隆")或Ⅱ组(双侧"心俞""肝俞""脾俞"),每日一组交替使用,每穴连续灸3壮。各组干预时间均为8周。13周实验结束后采用ELISA法测定血清胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL),并计算HDL/LDL;HE染色观察腹主动脉斑块组织结构,测量血管内膜厚度、内膜-中膜厚度(IMT);免疫组化法观察腹主动脉Ras同源物基因组成员A(RhoA)、Ras同源物相关卷曲螺旋蛋白激酶(Rock)、Toll样受体4(TLR4)、核因子κB(NF-κB)的抗原活性。结果与空白组比较,模型组实验兔血清TC、TG、LDL含量显著升高,HDL含量及HDL/LDL值显著降低,腹主动脉血管内膜厚度及IMT显著增加,腹主动脉中RhoA、RocK、TLR4、NF-κB灰度值显著升高(Ρ<0.01)。与模型组比较,直接灸组、隔药饼灸组、阿托伐他汀钙组TC、TG、LDL明显降低,HDL含量及HDL/LDL值明显升高,内膜厚度、IMT、RhoA、RocK、TLR4、NF-κB灰度值明显下降(P<0.05或P<0.01)。与直接灸组比较,隔药饼灸组与阿托伐他汀钙组NF-κB灰度值降低(Ρ<0.05)。结论隔药饼灸可能通过抑制RhoA/RocK信号通路下调TLR4、NF-κB表达,从而保护血管内皮功能、稳定AS易损斑块。

夹脊电针对急性脊髓损伤大鼠脊髓组织微环境Rho-ROCK Ⅱ通路相关因子的影响

目的:观察夹脊电针对脊髓损伤大鼠神经细胞轴突再生相关抑制因子重组人Ras同源物基因家族成员A(RhoA)、Rho蛋白激酶Ⅱ(ROCKⅡ)、肌球蛋白轻链(MLC)蛋白的影响,探讨夹脊电针治疗急性脊髓损伤(ASCI)的作用机制。方法:雌性Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组、夹脊电针组、抑制剂组,每组12只。采用脊髓打击法制备大鼠ASCI模型。夹脊电针组于模型制备成功后3h进行夹脊电针治疗,每日1次,每次30 min,连续治疗14d、28d;抑制剂组于造模成功后立即给予腹腔注射盐酸法舒地尔(10mg/kg),每日1次,连续治疗14d、28d。采用BBB评分法评估大鼠后肢运动功能变化,免疫组化法检测各组大鼠脊髓组织中RhoA、ROCKⅡ、MLC蛋白的表达情况。结果:BBB评分结果显示:与假手术组比较,造模后14d、28d模型组大鼠运动功能评分显著降低(P<0.05);与模型组比较,造模后14d、28d夹脊电针组、抑制剂组大鼠运动功能评分均显著升高(P<0.05);夹脊电针组、抑制剂组造模后28d大鼠肢体运动功能评分较造模后14d显著升高(P<0.05)。免疫组化结果显示:与假手术组比较,造模后14d、28d模型组大鼠脊髓组织RhoA、ROCKⅡ、MLC阳性细胞数增加(P<0.05);与模型组相比,造模后14d、28d夹脊电针组、抑制剂组大鼠脊髓组织RhoA、ROCKⅡ、MLC阳性细胞数显著降低(P<0.05);夹脊电针组、抑制剂组造模后28d大鼠脊髓组织RhoA、ROCKⅡ、MLC阳性细胞数较造模后14d显著降低(P<0.05)。结论:夹脊电针能够显著改善ASCI大鼠肢体运动功能,其作用机制可能与抑制大鼠脊髓损伤组织微环境Rho-ROCKⅡ信号通路RhoA、ROCKⅡ、MLC抑制因子表达有关。