Ras同源物基因家族成员B对肾透明细胞癌细胞生长及迁移能力的影响

目的研究干扰Ras同源物基因家族成员B(Ras homolog gene family member B,RhoB)表达后对肾透明细胞癌(renal clear cell carcinoma,RCCC)细胞生长及迁移能力的影响。方法检测RhoB在RCCC细胞中的蛋白表达水平,采用脂质体转染方法转染RhoB真核表达载体pcDNA3.0-Flag-RhoB和沉默RhoB的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)即si-RhoB序列及相应空载体和对照序列,应用Western Blot法检测转染后RhoB的蛋白表达情况,通过3-(4,5-二甲基吡啶-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sugophenyl)-2H-tetrazolium,MTS]法、平板克隆和Transwell小室细胞迁移实验检测细胞生长和细胞迁移能力的变化。结果 RhoB在RCCC细胞中表达降低。与转染空载体组比较,转染pcDNA3.0-Flag-RhoB重组质粒组RhoB的蛋白表达水平明显上调;与转染对照组比较,si-RhoB转染组RhoB的蛋白表达水平明显下调。在RCCC细胞786-O和Caki-1中,上调RhoB的表达后,在4、5、6 d经MTS法测定光密度值明显降低(P<0.05);在786-0细胞中上调RhoB表达后细胞克隆数明显减少;转染48 h后Transwell细胞迁移数明显减少(P<0.05)。而下调RhoB表达后,细胞生长和Transwell细胞迁移数没有明显变化。在相对高表达RhoB的正常人肾小管上皮细胞中下调RhoB表达后细胞生长和细胞迁移数明显增多。结论过表达RhoB后明显抑制RCCC细胞生长和迁移能力。

上海地区NRAS基因突变检测室间质量评价分析

目的通过开展神经母细胞瘤病毒癌基因RAS同源物(NRAS)基因突变检测室间质量评价(EQA)项目,评估上海地区实验室的检测能力及存在问题。方法选取含有特定NRAS基因突变位点的经甲醛溶液固定、石蜡包埋的细胞作为EQA标本,对其均匀性和稳定性进行评价。分别于2019年和2020年将标本随机编号后发至参评实验室,要求实验室在规定时间内检测并回报结果,上海市临床检验中心对结果进行评价分析。结果标本均匀性和稳定性均符合要求,2019年和2020年分别收到26份和24份有效回报结果,结果总体合格的实验室分别占84.62%、95.83%,结果完全正确的实验室分别占80.77%、79.17%;标本的整体符合率分别为93.08%、93.33%;在错误结果类型中,假阳性率分别为33.33%、25.00%,假阴性率分别为66.67%、75.00%。结论上海地区实验室NRAS基因突变检测能力整体较好,2020年实验室的检测能力较2019年有所提升;假阴性是主要错误类型,部分实验室检测能力尚有待提高;实验室通过参加EQA等方式加强实验室质量管理,可及时发现问题并持续改进以提高其检测能力。

人Ras同源物基因家族成员B真核表达载体的构建及对肾癌细胞786—0增殖和凋亡的影响

目的观察人Ras同源物基因家族成员B（RhoB）对肾癌细胞株786一O细胞增殖和凋亡的影响。方法构建pcDNA3．0-Flag—RhoB真核表达载体，脂质体转染法将其转入肾癌细胞786一O，利用Westernblot检测细胞中RhoB的表达。用MTS法和流式细胞仪检测RhoB对肾癌细胞增殖和凋亡效应的影响。结果真核表达载体pcDNA3．0-Flag-RhoB构建成功，脂质体转染后RhoB在786一O细胞中表达明显升高；在转染后48、72、96h，重组质粒组细胞的增殖速度明显低于空载体组和阴性对照组（P〈0．05）；转染重组质粒细胞凋亡率为（24．05±0．60）％，明显高于空载体组[（1．67±0．30）％]和阴性对照组[（1．22±0．50）％，P〈0．05]。结论RhoB对肾癌细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用。

利多卡因调节RhoA/ROCK信号通路对缺血性脑卒中大鼠的神经保护作用

目的探讨利多卡因调节RhoA/ROCK信号通路对缺血性脑卒中(IS)大鼠神经保护作用。方法通过线栓法建立模型IS大鼠,随机分为模型组、利多卡因低(利多卡因-L,5 mg/kg)、中(利多卡因-M,10 mg/kg)、高剂量(利多卡因-H,20 mg/kg)组以及利多卡因-H+溶血磷脂酸(LPA)(20 mg/kg利多卡因+50μmoL/L LPA)组,以仅分离但不插尼龙线的大鼠为假手术组;干预结束后,对大鼠进行神经功能评分、脑梗死体积、脑含水量测定;分离脑组织,观察神经元变化、神经细胞凋亡以及RhoA、ROCK蛋白表达。结果与假手术组相比,模型组大鼠Zea-Longa评分(3.28±0.33、0.14±0.02)、脑梗死体积(38.09±3.81、0.00±0.00)、含水量(84.11±2.39、62.95±0.65)、神经细胞凋亡率(39.51±3.96、5.14±0.52)、RhoA(1.16±0.12、0.24±0.03)、ROCK蛋白(2.15±0.22、0.77±0.08)表达增加(P<0.05);与模型组相比,利多卡因组大鼠Zea-Longa评分(2.37±0.24、1.52±0.16、0.87±0.09)、脑梗死体积(27.42±2.76、16.64±1.68、8.22±0.83)、含水量(75.24±1.46、68.34±1.02、63.15±0.86)、神经细胞凋亡率(27.08±2.71、18.84±1.89、9.47±0.95)、RhoA(0.78±0.08、0.52±0.06、0.26±0.03)、ROCK蛋白(1.66±0.17、1.24±0.13、0.86±0.09)表达显著降低,组间差异有统计学意义(P<0.05);LPA逆转了利多卡因-H对IS大鼠的保护作用。结论利多卡因通过抑制RhoA/ROCK信号通路对IS大鼠发挥神经保护作用。

针康法对局灶性脑梗死大鼠神经功能缺损及梗死灶周边区RhoA、ROCK-Ⅱ蛋白表达的影响

目的:探讨针康法对局灶性脑梗死大鼠神经功能缺损及梗死灶周边区Rho A、ROCK-II蛋白表达的影响。方法:将90只清洁级SD雄性大鼠随机分为5组,即假手术组、模型组、针刺组、康复组及针康组,各组于3天、7天、14天时间点再分成3个亚组(n=6)。采用改良的Zea Longa线栓法制备局灶性脑梗死大鼠模型。假手术组与模型组大鼠不予任何治疗,针刺组给予头穴丛刺治疗,康复组给予运动康复训练,针康组给予头穴丛刺结合运动康复训练。术后3天、7天、14天采用改良大鼠神经功能缺损评分(m NSS)评估各组大鼠神经功能,免疫组化法检测大鼠梗死灶周边区Rho A、ROCK-Ⅱ蛋白的表达。结果:术后7天、14天,与模型组比较,各干预组大鼠神经功能缺损评分均明显降低(P<0.05);与针刺组、康复组比较,针康组大鼠评分有所降低(P<0.05)。术后各时间点,与模型组比较,各干预组梗死灶周边区Rho A、ROCK-Ⅱ阳性细胞数均明显减少(P<0.05);与针刺组、康复组比较,针康组大鼠梗死灶周边区Rho A、ROCK-Ⅱ阳性细胞数目有所减少(P<0.05)。结论:头穴丛刺疗法、运动康复训练、针康法均能有效改善局灶性脑梗死大鼠神经功能缺损,下调梗死灶周边区Rho A、ROCK-Ⅱ蛋白表达,且针康法优于单纯头穴丛刺或运动康复训练。

Aβ诱导的认知障碍大鼠海马RGMa和RhoA表达的研究

目的:探讨Aβ诱导的认知障碍大鼠海马内反义导向分子(Repulsiveguidancemolecule,RGMa)及Ras基因同源物A(RashomologousA,RhoA)表达情况。方法:20只SD大鼠被随机分为认知障碍模型组(10只),生理盐水对照组(10只),建立Aβ1-40致认知障碍大鼠模型,Morris水迷宫检测大鼠认知功能,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测RGMa和RhoAmRNA的表达,免疫组织化学方法检测RGMa蛋白的表达。结果:与对照组相比较,模型组大鼠显示学习、记忆能力明显下降(P<0.01),海马RGMamRNA表达下调(P<0.05),RGMa蛋白表达也降低(P<0.05),而RhoAmRNA表达显著增高(P<0.01)。结论:Morris水迷宫检测显示大鼠认知功能障碍,RGMa表达降低及RhoAmRNA表达上调可能参与了Aβ1-40致认知功能障碍大鼠海马神经元变性病理过程。

温针灸对大鼠脊髓损伤节段神经再生抑制因子RhoA、RockⅡ表达的影响

目的:观察温针灸对大鼠脊髓损伤(SCI)节段神经再生抑制因子Ras同源物基因A(RhoA)、Rho蛋白激酶Ⅱ(RockⅡ)表达的影响,探讨温针灸治疗脊髓损伤的作用机制。方法:将40只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、温针灸组和法舒地尔组,每组10只。假手术组仅去掉椎板,其余三组均以半切法建立SCI模型。假手术组、模型组术后不进行干预,温针灸组造模成功后予温针灸干预,法舒地尔组腹腔注射盐酸法舒地尔抑制剂。HE染色和尼氏染色观察组织形态学变化,免疫组化观察RhoA、RockⅡ蛋白表达,RT-qPCR检测RhoA、RockⅡmRNA表达。结果:假手术组脊髓神经细胞分布均匀、灰质白质分界清楚,尼氏细胞结构完整、数量分布集中、尼氏小体形态正常、着色均匀。模型组组织结构极度紊乱,细胞水肿、炎性浸润明显,尼氏细胞结构模糊、尼氏小体为异常的小颗粒状,着色不均。温针灸组和法舒地尔组均可逆转上述现象,改善组织水肿、增加神经元数量,促进尼氏细胞和尼氏小体组织形态的恢复。干预7、14 d,模型组RhoA、RockⅡ表达均高于假手术组同时间节点(P<0.05);干预7、14 d,温针灸组、法舒地尔组RhoA、RockⅡ表达低于模型组同时间节点,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:温针灸可促进SCI组织形态恢复、提高损伤神经再生能力,其作用机制可能与下调脊髓受损节段神经再生抑制因子RhoA、RockⅡ的表达有关。

RhoA/ROCK/ERK-MAPK通路在高磷环境调节内皮细胞凋亡的机制

目的研究高磷环境下内皮细胞凋亡的可能调控机制和信号通路。方法人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)在正常磷(1.0 mmol/L)、高磷(3.0 mmol/L)、正常磷+辛伐他汀(simvastatin,SV,1.0 mmol/L+SV)及高磷+SV(3.0 mmol/L+SV)培养基中培养24 h,Western Blot评价Ras同源物基因家族成员A(Ras homolog gene family,member A,RhoA),Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1/2(rho-associated coiled coil forming protein kinase 1/2,ROCK1/2),细胞外信号调控激酶-丝裂原活化蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase-mitogen activated protein kinase,ERK-MAPK)、磷酸化细胞外信号调控激酶-丝裂原活化蛋白激酶(phosphorylated-ERK-MAPK,p-ERK-MAPK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38-Mitogen Activated Protein Kinase,p38-MAPK)、磷酸化p38-丝裂原活化蛋白激酶(phosphorylated-p38-MAPK,p-p38-MAPK)、以及精氨酸酶1(arginase1,ARG1)和一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,NOS)蛋白的表达,比色法和膜联蛋白V/碘化丙啶双染法(Annexin V-FITC/propidium iodide,Annexin V-FITC/PI)检测ARG活性和细胞凋亡率。结果高磷组RhoA,ROCK1/2,p-ERK MAPK,ARG1表达均上调,ARG活性升高,NOS表达下调,细胞凋亡增加;RhoA抑制剂SV能抑制高磷环境下p-ERK MAPK的活化和ARG1的表达,降低ARG1活性,促进NOS表达,减少内皮细胞凋亡。结论高磷环境HUVECs可通过RhoA/ROCK途径激活p-ERK MAPK的表达,增加ARG活性,抑制NOS表达,引起内皮细胞凋亡;SV可以通过抑制RhoA/ROCK/ERK-MAPK通路,改善内皮细胞凋亡。

左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症模型大鼠海马齿状回神经元树突及Wnt5a/RhoA信号通路的影响

目的探讨左归降糖解郁方治疗糖尿病并发抑郁症的可能作用机制。方法60只大鼠随机分为正常组、模型组、无翅型MMTV整合位点家族成员5a(Wnt5a)激动剂组、左归降糖解郁方组、左归降糖解郁方+Wnt5a抑制剂组,每组12只。除正常组外,其余各组大鼠采用高脂饲料饲养、链脲佐菌素注射和慢性温和不可预知应激联用法建立糖尿病并发抑郁症大鼠模型。造模成功后Wnt5a激动剂组大鼠给予双侧海马立体定位注射Wnt5a激动剂Foxy-5各5μl,连续7天;左归降糖解郁方组给予左归降糖解郁方20.52 g/(kg·d)灌胃;左归降糖解郁方+Wnt5a抑制剂组进行灌胃给药和双侧海马立体定位注射Wnt5a抑制剂Box5,给药剂量和注射方法同上。正常组和模型组给予10 ml/(kg·d)生理盐水灌胃。各组灌胃均连续4周。干预结束后采用强迫游泳实验(不动时间)和旷场实验(活动次数)评价大鼠的抑郁样行为;检测大鼠的血糖和胰岛素含量,并计算胰岛素抵抗指数;采用高尔基染色观察大鼠海马齿状回神经元的树突形态;采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)注射及免疫荧光检测齿状回神经元增殖水平;采用RT-qPCR和Western blot法检测齿状回Wnt5a、Ras同源物基因组成员A(RhoA)和Rho同源物相关卷曲螺旋蛋白激酶1(ROCK1)mRNA和蛋白表达。结果与正常组比较,模型组大鼠血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数均显著升高,不动时间显著延长,活动次数显著减少,海马齿状回中Brdu积分光密度值和Wnt5a、RhoA、ROCK1蛋白及mRNA表达均显著降低(P<0.05或P<0.01);大鼠海马齿状回神经元可见树突分支明显减少或断裂,长度缩短。与模型组比较,左归降糖解郁方组和左归降糖解郁方+Wnt5a抑制剂组大鼠血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数显著降低(P<0.05或P<0.01);Wnt5a激动剂组和左归降糖解郁方组大鼠不动时间显著缩短、活动次数显著增加、Brdu积分光密度值显著升高,Wnt5a、RhoA、ROCK1蛋白及mRNA表达均升高(P<0.05或P<0.01),海马齿状回神经元的树突分支数量显著增加、长度延长,树突的复杂性增加。与Wnt5a激动剂组比较,左归降糖解郁方组大鼠血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数显著降低,不动时间显著延长,活动次数显著减少,Brdu积分光密度值显著降低;除左归降糖解郁方组Wnt5a mRNA外,左归降糖解郁方组和左归降糖解郁方+Wnt5a抑制剂组Wnt5a、RhoA、ROCK1蛋白及mRNA表达均降低(P<0.05或P<0.01)。与左归降糖解郁方组比较,左归降糖解郁方+Wnt5a抑制剂组Wnt5a、RhoA、ROCK1蛋白及mRNA表达均降低(P<0.05或P<0.01)。结论左归降糖解郁方可改善糖尿病并发抑郁症模型大鼠的高血糖和抑郁样行为,其抗抑郁作用可能与激活海马Wnt5a/RhoA信号,促进齿状回神经元树突生长有关。

夹脊电针对急性脊髓损伤大鼠脊髓组织微环境Rho-ROCK Ⅱ通路相关因子的影响

目的:观察夹脊电针对脊髓损伤大鼠神经细胞轴突再生相关抑制因子重组人Ras同源物基因家族成员A(RhoA)、Rho蛋白激酶Ⅱ(ROCKⅡ)、肌球蛋白轻链(MLC)蛋白的影响,探讨夹脊电针治疗急性脊髓损伤(ASCI)的作用机制。方法:雌性Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组、夹脊电针组、抑制剂组,每组12只。采用脊髓打击法制备大鼠ASCI模型。夹脊电针组于模型制备成功后3h进行夹脊电针治疗,每日1次,每次30 min,连续治疗14d、28d;抑制剂组于造模成功后立即给予腹腔注射盐酸法舒地尔(10mg/kg),每日1次,连续治疗14d、28d。采用BBB评分法评估大鼠后肢运动功能变化,免疫组化法检测各组大鼠脊髓组织中RhoA、ROCKⅡ、MLC蛋白的表达情况。结果:BBB评分结果显示:与假手术组比较,造模后14d、28d模型组大鼠运动功能评分显著降低(P<0.05);与模型组比较,造模后14d、28d夹脊电针组、抑制剂组大鼠运动功能评分均显著升高(P<0.05);夹脊电针组、抑制剂组造模后28d大鼠肢体运动功能评分较造模后14d显著升高(P<0.05)。免疫组化结果显示:与假手术组比较,造模后14d、28d模型组大鼠脊髓组织RhoA、ROCKⅡ、MLC阳性细胞数增加(P<0.05);与模型组相比,造模后14d、28d夹脊电针组、抑制剂组大鼠脊髓组织RhoA、ROCKⅡ、MLC阳性细胞数显著降低(P<0.05);夹脊电针组、抑制剂组造模后28d大鼠脊髓组织RhoA、ROCKⅡ、MLC阳性细胞数较造模后14d显著降低(P<0.05)。结论:夹脊电针能够显著改善ASCI大鼠肢体运动功能,其作用机制可能与抑制大鼠脊髓损伤组织微环境Rho-ROCKⅡ信号通路RhoA、ROCKⅡ、MLC抑制因子表达有关。

隔药饼灸对动脉粥样硬化易损斑块模型兔腹主动脉RhoA/Rock信号通路的影响

目的探讨隔药饼灸稳定动脉粥样硬化(AS)易损斑块的可能作用机制。方法将50只新西兰兔随机分为空白组8只,模型组9只,直接灸组9只,隔药饼灸组7只,阿托伐他汀钙组9只,抑制剂组8只。除空白组外,其余各组通过"高脂饲养喂养+腹主动脉球囊损伤术+基因转染+触发斑块破裂"制作AS易损斑块兔模型。空白组、模型组不予操作;阿托伐他汀钙组给予阿托伐他汀钙片1.96 mg/(kg·d)喂养;抑制剂组予盐酸法舒地尔10 mg/(kg·d)沿耳缘静脉缓慢注射;直接灸组及隔药饼灸组分别直接灸及隔药饼灸,穴选Ⅰ组("巨阙"及双侧"天枢""丰隆")或Ⅱ组(双侧"心俞""肝俞""脾俞"),每日一组交替使用,每穴连续灸3壮。各组干预时间均为8周。13周实验结束后采用ELISA法测定血清胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL),并计算HDL/LDL;HE染色观察腹主动脉斑块组织结构,测量血管内膜厚度、内膜-中膜厚度(IMT);免疫组化法观察腹主动脉Ras同源物基因组成员A(RhoA)、Ras同源物相关卷曲螺旋蛋白激酶(Rock)、Toll样受体4(TLR4)、核因子κB(NF-κB)的抗原活性。结果与空白组比较,模型组实验兔血清TC、TG、LDL含量显著升高,HDL含量及HDL/LDL值显著降低,腹主动脉血管内膜厚度及IMT显著增加,腹主动脉中RhoA、RocK、TLR4、NF-κB灰度值显著升高(Ρ<0.01)。与模型组比较,直接灸组、隔药饼灸组、阿托伐他汀钙组TC、TG、LDL明显降低,HDL含量及HDL/LDL值明显升高,内膜厚度、IMT、RhoA、RocK、TLR4、NF-κB灰度值明显下降(P<0.05或P<0.01)。与直接灸组比较,隔药饼灸组与阿托伐他汀钙组NF-κB灰度值降低(Ρ<0.05)。结论隔药饼灸可能通过抑制RhoA/RocK信号通路下调TLR4、NF-κB表达,从而保护血管内皮功能、稳定AS易损斑块。