大片吸虫Ras家族蛋白基因的克隆表达及免疫反应性研究

Ras家族相关蛋白是多种信号转导途径的关键组成蛋白，在寄生虫的生长发育过程中发挥着重要作用，但犬片吸虫的Ras家族蛋白基因（FgRap1）尚未见报道。本研究旨在对FgRapl进行克隆、表达、序列分析及免疫反应性评价。根据肝片吸虫的基因组及转录组数据．设计肝片吸虫Ras家族蛋白基因引物．以大片吸虫总RNA为模板，通过RT—PCR获得Fg尺apl基因；对其进行生物信息学分析及鉴定；然后构建pET—SUMO-FgRap1重组表达栽体，在大肠杆菌Transetta（DE3）感受态细胞中进行诱导表达；对纯化的目的蛋白进行SDS—PAGE和Western—blot分析。结果表明．大片吸虫FgRapi基因大小为648bp，编码215个氨基酸残基。生物信息学分析表明，该蛋白含有9个亲水区，但无跨膜区，有6个α螺旋、8个口折叠、2个较长的口转角、1个较长的无规则卷曲和8个主要的线性B细胞抗原表位。FgRapl蛋白为包涵体表达，用大片吸虫排泄分泌抗原免疫家兔的阳性血清进行Western—blot分析，表明其具有良好的免疫反应性。本研究首次克隆并鉴定了大片吸虫Ras家族蛋白基因，表达的重组蛋白具有良好的免疫反应性，该蛋白是潜在的大片吸虫诊断候选抗原。

麦冬皂苷B调节Rho A/ROCK1信号通路对胃荷瘤大鼠肿瘤生长的抑制作用

目的 探讨麦冬皂苷B(ophiopogonin B,OP-B)对胃荷瘤大鼠肿瘤生长的影响及其作用机制。方法 将66只体质量为180~200 g的6周龄SPF级SD大鼠(雌雄各半)按随机数字表法分为模型组,OP-B低、中、高剂量组,激活剂组,每组10只。采用原位移植Walker-256肿瘤组织建立胃荷瘤模型,OP-B低、中、高剂量组大鼠分别灌胃17.5、35、70 mg/kg的OP-B并腹腔注射等量生理盐水,激活剂组灌胃70 mg/kg的OP-B并腹腔注射1 mg/kg的Rho A/ROCK1信号通路激活剂溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA),模型组灌胃和腹腔注射等量的生理盐水;记录移植瘤质量及体积,计算抑瘤率;苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色观察肿瘤组织形态;原位末端转移酶标记技术(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling, TUNEL)染色检测肿瘤组织细胞凋亡;免疫组织化学染色检测肿瘤组织细胞核增殖抗原67(proliferating cell nuclear antigen, Ki-67)、切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Cleaved Caspase-3)表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)法检测Ras同源基因家族蛋白A(Ras homologous gene family member A,Rho A)、Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶1(Rho-associated coiled-coil forming protein kinase1,ROCK1)的表达;Western blot检测Rho A、ROCK1蛋白表达。结果 与模型组比较,OP-B低、中、高剂量组肿瘤质量和体积、Ki-67阳性率及Rho A、ROCK1 mRNA和蛋白表达显著降低,抑瘤率、肿瘤细胞凋亡率、Cleaved Caspase-3阳性率显著升高(P<0.05);与OP-B高剂量组比较,激活剂组肿瘤质量和体积、Ki-67阳性率及Rho A、ROCK1 mRNA和蛋白表达显著升高,抑瘤率、肿瘤细胞凋亡率、Cleaved Caspase-3阳性率显著降低(P<0.05)。结论 OP-B可能通过抑制Rho A/ROCK1信号通路的激活,抑制胃荷瘤大鼠肿瘤生长。

山茱萸环烯醚萜苷对延缓大鼠脑动脉瘤进展的影响

目的 探讨山茱萸环烯醚萜苷(CLG)通过Ras同源基因家族蛋白(Rho)/Rho关联含卷曲螺旋结合蛋白激酶(Rock)信号通路对大鼠动脉瘤进展的影响。方法 选取50只雄性大鼠建立脑动脉瘤(CA)模型,48只造模成功大鼠随机分为模型组、CLG低剂量、中剂量和高剂量组(各12只),未造模大鼠取12只为对照组。CLG低剂量、中剂量和高剂量组灌胃100、150、200 mg·kg^(-1)的CLG溶液(蒸馏水配制),连续30 d,对照组及模型组给予等量蒸馏水。检测各组大鼠血压变化;ELISA法检测各组大鼠血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)水平;HE染色观察脑组织病理学变化;RT-PCR和Western blot检测大鼠脑组织Rho、Rock2 mRNA和蛋白表达情况。结果 与模型组比较,3组大鼠收缩压、舒张压、平均动脉压、TNF-α、IL-1、IL-6、Rho、Rock2 mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05),与CLG低剂量组比较,CLG中剂量、高剂量组诸项指标水平降低(P<0.05),与CLG中剂量组比较,CLG高剂量组诸项指标水平降低(P<0.05)。结论 CLG可调节CA大鼠血压水平、降低炎性因子水平,在一定程度上抑制动脉瘤样扩张,可能与抑制Rho/Rock信号通路有关。

阿魏酸钠对角膜内皮功能障碍及CEC损伤的影响及潜在机制

目的 探讨阿魏酸钠(SF)对角膜内皮功能障碍及角膜内皮细胞(CEC)损伤的影响及潜在机制。方法 将雄性新西兰兔分为对照组、苯扎氯铵(BAK)组和BAK+SF组,每组6只。除对照组外,其余组以前房注射BAK建立大泡性角膜病变模型,BAK+SF组于术后次日腹腔注射SF溶液200 mg/kg,每天2次,连续14 d。观察各组兔角膜透明度和基质水肿情况(术前及术后第1、7、14天),检测其角膜厚度(术后第14天)和眼内压(术后第1~14天);于术后第14天,评估其角膜内皮结构并检测功能相关蛋白[鬼笔环肽、胞质紧密连接蛋白1(ZO-1)、钠钾ATP酶、Ki67]的表达情况。于术后14 d采集BAK组角膜组织,分离、培养原代兔CEC,将其分为空白组和不同质量浓度SF组,检测不同培养时间下各组细胞的活力和Ras同源基因家族A(RhoA)、骨形成蛋白受体1A(BMPR1A)、BMRP2蛋白的表达情况。结果 与BAK组比较,BAK+SF组兔角膜透明度和基质水肿情况逐渐好转,且角膜厚度显著减小(P<0.05);其CEC仅缺损至B区,且表现为正常的六边形内皮细胞结构;其角膜内皮组织中鬼笔环肽、ZO-1、钠钾ATP酶、Ki67蛋白的表达均显著升高(P<0.05)。当SF质量浓度≤200 mg/L时,其对兔CEC的增殖有一定的促进作用,具有浓度依赖性(P<0.05)和时间依赖趋势,且50、100、200 mg/L的SF可浓度依赖性地上调细胞中RhoA、BMPR1A、BMPR2蛋白的表达(P<0.05)。结论 SF可改善大泡性角膜病变模型兔受损角膜内皮的透明度,减轻基质水肿,减小角膜厚度,维持角膜内皮结构完整性并促进角膜内皮功能恢复;该成分还可促进兔CEC的增殖,此作用可能与激活RhoA-Rho激酶-骨形成蛋白信号通路有关。

阿托伐他汀对氧化型低密度脂蛋白诱导内皮细胞损伤的保护作用

目的基于Ras同源基因家族蛋白A(RhoA)/Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)信号通路研究阿托伐他汀对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导内皮细胞损伤的保护作用。方法用ox-LDL构建HUVEC细胞损伤模型,并将模型细胞分为模型组、对照组和实验组,另取正常细胞作为空白组。空白组和模型组均在培养基中加入等量的0.9%NaCl进行培养;对照组在培养基中加入10μmol·L^(-1) Y-27632 5μL进行培养;实验组在培养基中加入10μmol·L^(-1)阿托伐他汀5μL进行培养。用噻唑蓝法检测细胞活力的变化,用流式细胞术检测细胞凋亡的变化,用蛋白质印迹法检测磷酸化RhoA(p-RhoA)、ROCK1和ROCK2蛋白的表达水平。结果实验组、对照组、模型组和空白组的细胞相对活力分别为0.78±0.08,0.75±0.11,0.43±0.06和1.01±0.02,细胞凋亡率分别为(38.78±0.76)%,(38.56±0.95)%,(69.55±0.36)%和(9.85±0.26)%,p-RhoA相对表达量分别为2.13±0.05,2.15±0.03,4.32±0.05和0.99±0.01,ROCK1相对表达量分别为2.88±0.02,2.86±0.04,4.71±0.06和0.97±0.04,ROCK2相对表达量分别为2.25±0.03,2.21±0.07,4.46±0.02和1.01±0.02。模型组的上述指标与实验组、对照组和空白组比较,差异均有统计意义(均P<0.05)。结论阿托伐他汀对ox-LDL诱导内皮细胞损伤具有保护作用,其作用机制可能与抑制RhoA/Rho信号通路有关。

电针对腹泻型肠易激综合征大鼠结肠动力学及相关蛋白表达的影响

目的:观察电针“天枢”“上巨虚”对腹泻型肠易激综合征(IBS-D)大鼠胃肠道动力障碍、心理异常及结肠组织Ras同源基因家族蛋白A(RhoA)、Rho相关激酶(ROCK)蛋白表达的影响,探讨电针治疗IBS-D的作用机制。方法:SD大鼠随机分为对照组、模型组、电针组、药物组,每组9只。通过二硝基苯磺酸灌胃+慢性束缚应激法建立伴有心理异常的IBS-D大鼠模型。电针组予电针双侧“天枢”“上巨虚”,每次20min,1次/d,持续7d。药物组将匹维溴铵按体质量15mg/kg研磨成粉,与1mL 0.9%氯化钠溶液混合均匀后,灌胃给药,1次/d,持续7d。观察各组大鼠一般状态,测定其体质量及摄食量,进行内脏敏感性检测、糖水偏嗜实验及高架十字迷宫测试,以墨汁灌胃法检测小肠推进率,Western blot法检测结肠组织中RhoA、ROCK蛋白的表达。结果:与对照组比较,模型组大鼠一般状态较差,体质量、摄食量、糖水偏好指数及开臂停留时间百分比均降低(P<0.05),结肠收缩波个数明显增加(P<0.01),收缩波潜伏期明显缩短(P<0.05),小肠推进率及结肠组织中RhoA、ROCK蛋白表达水平均升高(P<0.05)。与模型组比较,电针组、药物组大鼠一般情况有所改善,体质量、摄食量、糖水偏好指数及开放臂停留时间百分比均升高(P<0.05),收缩波个数减少(P<0.05),收缩波潜伏期延长(P<0.05),小肠推进率及结肠组织中RhoA、ROCK蛋白表达水平均降低(P<0.01,P<0.05)。与药物组比较,电针组糖水偏好指数升高(P<0.05)。结论:电针可以同时改善IBS-D大鼠结肠动力障碍及心理异常,其作用机制可能与降低结肠组织RhoA、ROCK蛋白表达水平有关。

基于β-arrestin1沉默探讨益肾达络饮对EAE小鼠Rho/ROCK信号通路的影响

目的:基于β-抑制蛋白(β-arrestin1)基因沉默,研究益肾达络饮对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠Ras同源基因家族蛋白(Rho)/Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)信号通路的影响。方法:60只C57BL/6雌性小鼠随机平均分为空白组、模型组、病毒组、益肾达络饮组(中药组)、病毒加益肾达络饮组(病毒加中药组)、醋酸泼尼松组(激素组)6组。除空白组外,每只小鼠均制备EAE模型,于免疫第4天病毒组、病毒加中药组每只小鼠尾静脉注射腺相关病毒(AAV)病毒溶液150μL(1×10^(11) vg·m L^(-1))。造模的第8天给药,空白组、模型组、病毒组给予生理盐水10 m L·kg^(-1),激素组给予醋酸泼尼松混悬液(3.9 g·kg^(-1)),其他组给予益肾达络饮(20 g·kg^(-1)),连续给药14 d并每日进行称重评分。免疫后每天记录各组小鼠的神经功能评分;苏木素-伊红(HE)染色测定小鼠脑组织、脊髓组织的炎症反应和病变位置;蛋白免疫印迹法(Western blot)测定EAE小鼠脊髓组织及脑组织中β-arrestin1、RhoA、ROCKⅠ的蛋白表达。结果:与模型组比较,病毒组、病毒加中药组的神经功能评分显著降低(P<0.01),中药组明显降低(P<0.05)。HE结果显示,模型组中枢神经系统(CNS)存在明显炎症反应,其他各组与模型组比较均有不同程度的减轻。Western blot结果显示,与空白组比较,模型组小鼠脊髓组织中β-arrestin1、RhoA及ROCKⅠ蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。与模型组比较,病毒组、中药组、病毒加中药组、激素组小鼠脊髓组织中β-arrestin1、RhoA及ROCKⅠ蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。与空白组比较,模型组小鼠脑组织中β-arrestin1、RhoA、ROCKⅠ蛋白表达水平均显著升高(P<0.01)。与模型组比较,病毒组、中药组、病毒加中药组、激素组小鼠脑组织中β-arrestin1蛋白表达水平均显著降低(P<0.01);病毒组、中药组小鼠脑组织中RhoA、ROCKⅠ蛋白表达水平均明显降低(P<0.05);病毒加中药组和激素组小鼠脑组织中RhoA、ROCKⅠ蛋白表达水平均显著降低(P<0.01)。结论:益肾达络饮可以改善EAE小鼠的临床症状,改善CNS的炎症反应,其机制可能为益肾达络饮抑制CNS中β-arrestin1的表达,从而降低Rho/ROCK信号通路中RhoA、ROCKⅠ蛋白的表达,并且益肾达络饮与抑制β-arrestin1的基因表达可能存在协同效果。

消渴通痹方含药血清对高糖损伤后HUVEC细胞骨架及RhoA/ROCK信号通路的影响

目的:观察消渴通痹方含药血清对高糖损伤后人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC)F肌动蛋白(F-actin)、Ras基因家族成员A(Ras homolog gene family member A,RHOA)、Rho相关蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil containing kinase, ROCK)蛋白表达的影响。方法:将高糖损伤后HUVEC模型分为高糖模型组、22.5 g/kg消渴通痹方5%、10%、15%含药血清组,另设正常对照组,应用免疫荧光法检测F-actin的动态变化,Western blot检测F-actin、ROCK、p-ROCK和RhoA蛋白表达。结果:高糖刺激HUVEC骨架蛋白F-actin聚集到细胞中央,形成大量的应力纤维;22.5 g/kg消渴通痹方5%、10%含药血清干预后能够改善F-actin的聚集状态,使F-actin重新分布在细胞周边。与正常对照组比较,高糖模型组F-actin积分光密度值升高,F-actin、p-ROCK、RHOA蛋白表达明显上调(P<0.05或P<0.01),ROCK蛋白表达明显下调(P<0.05);与高糖模型组比较,22.5 g/kg消渴通痹方5%含药血清组F-actin积分光密度值明显降低,F-actin、p-ROCK、RHOA蛋白表达明显下调(P<0.05),ROCK蛋白表达明显上调(P<0.05);10%含药血清组F-actin积分光密度值明显降低、F-actin蛋白表达明显下调(P<0.01或P<0.05),RHOA、ROCK蛋白表达明显上调(P<0.05)。结论:益气活血中药消渴通痹方可能通过抑制RHOA/ROCK信号通路的异常激活稳定或保护内皮细胞骨架。

基于RhoA/ROCK信号通路研究消渴通痹方含药血清对高糖诱导的HUVEC屏障功能和细胞凋亡的影响

目的:探讨Rho相关蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil containing kinase, ROCK)抑制剂Y27632和消渴通痹方含药血清对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC)屏障功能和细胞凋亡的影响。方法:制备消渴通痹方含药血清,将SD大鼠随机分为正常对照组和消渴通痹方22.5 g/kg组,每天灌胃1次,连续7 d。根据葡萄糖的浓度和消渴通痹方含药血清的浓度将实验分为正常对照组、高糖模型组、Y27632 10μmol/L组和消渴通痹方22.5 g/kg 5%、10%、15%含药血清联合Y27632 10μmol/L组。各组细胞传代8代~15代时,应用辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase, HRP)检测HUVEC的单层通透性,流式细胞术检测HUVEC凋亡,Western blot检测闭锁小带蛋白1(zonula occludens-1, ZO-1)、闭合蛋白(Occludin)和Ras基因家族成员A (Ras homolog gene family member A, RhoA)、ROCK蛋白的表达。结果:与正常对照组相比,高糖模型组HRP吸光度、细胞凋亡率、RhoA、p-ROCK/ROCK的比值都显著升高,ZO-1、Occludin蛋白表达显著下调(P<0.01)。与高糖模型组相比,Y27632 10μmol/L组HRP吸光度、细胞凋亡率显著降低(P<0.01),ZO-1、RhoA蛋白表达显著上调(P<0.01);消渴通痹方22.5 g/kg含药血清联合Y27632组HRP吸光度、细胞凋亡率显著降低、RhoA蛋白表达显著下调(P<0.01),ZO-1、Occludin蛋白表达显著上调(P<0.01);10%、15%消渴通痹方22.5 g/kg含药血清联合Y27632组p-ROCK/ROCK的比值显著降低(P<0.01)。与Y27632组相比,消渴通痹方22.5 g/kg各浓度含药血清联合Y27632组HRP吸光度、凋亡率明显降低、RhoA蛋白表达明显下调(P<0.01或P<0.05);ZO-1、Occludin蛋白表达上调(P<0.05);15%消渴通痹方22.5 g/kg含药血清联合Y27632组p-ROCK/ROCK的比值降低(P<0.05)。结论:益气活血中药消渴通痹方能改善高糖诱导的HUVEC细胞屏障功能、降低内皮细胞凋亡、增加紧密连接蛋白ZO-1、Occludin的表达,其机制可能与RhoA/ROCK信号通路有关。

牛膝-白芍配伍对帕金森病小鼠神经炎症及RhoA/ROCK2信号通路的影响

目的:观察牛膝和白芍不同剂量对肝阳上亢证帕金森病小鼠神经炎症及多巴胺能神经元的保护作用,并探究其作用机制。方法:将C57BL/6小鼠随机分为正常组、模型组、牛膝-白芍低、中、高剂量组(3.25、6.5、13 g·kg-1)、司来吉兰组(0.01 g·kg-1)。采用附子汤灌胃联合1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)腹腔注射的方法制备肝阳上亢证帕金森病模型。通过小鼠转棒实验和爬杆实验评估其行为学改变;蛋白免疫印迹法(Western blot)测定小鼠脑黑质中Ras同源基因家族蛋白A(RhoA)、Rho相关螺旋卷曲蛋白激酶2(ROCK2)、肌球蛋白轻链1(MLC1)、α-突触核蛋白(α-synuclein)的表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测脑黑质中RhoA、ROCK2、MLC1 mRNA表达水平;采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测各组中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)促炎细胞因子含量;透射电镜观察小鼠神经元超微结构变化。结果:与正常组比较,模型组跌落潜伏期显著缩短及爬杆时长显著增加(P<0.01),脑黑质内RhoA、ROCK2、MLC1、α-synuclein、TNF-α、IL-1β水平均明显升高(P<0.05);与模型组比较,牛膝-白芍低、中、高剂量组、司来吉兰组跌落潜伏期明显增加及爬杆时长明显降低(P<0.05,P<0.01),且ROCK2、MLC1、α-synuclein、TNF-α、IL-1β水平均降低(P<0.05)。电镜下与正常组比较,模型组神经元胞质内细胞器数量明显减少,线粒体肿胀且内质网形态异常,而牛膝-白芍高剂量组和司来吉兰组经元胞核结构完整,细胞轮廓清晰,内质网形态正常。结论:牛膝-白芍配伍改善肝阳上亢证PD小鼠运动能力,下调RhoA/ROCK2信号通路相关蛋白表达,抑制炎性因子表达,减轻多巴胺能神经元损伤,其机制可能与抑制脑内RhoA/ROCK2信号通路介导的神经炎症反应有关。

苦参碱对心力衰竭大鼠心功能的影响

目的探讨苦参碱对心力衰竭大鼠心功能及Ras同源基因家族蛋白A(RhoA)/Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1(ROCK1)信号通路的影响。方法用异丙肾上腺素皮下注射建立心力衰竭模型,并随机分为模型组、对照组和低、中、高剂量实验组,每组16只;另取15只健康大鼠作为空白组,仅给予皮下注射等量0.9%NaCl。模型建立后,模型组和空白组均灌胃给予5 mL·kg^(-1)0.9%NaCl,qd;对照组按5 mL·kg^(-1)的剂量灌胃给予2 mg·mL^(-1)普萘洛尔溶液,qd;低、中、高剂量实验组均按5 mL·kg^(-1)的剂量分别灌胃给予10,20和40 mg·mL^(-1)苦参碱溶液,qd。6组大鼠均给药15 d。比较6组大鼠的左心室射血分数(LVEF)、心肌间质纤维化百分率,以及心肌组织RhoA和ROCK1蛋白的表达水平。结果低、高剂量实验组和对照组、模型组、空白组的LVEF分别为(55.36±6.12)%,(70.23±8.37)%,(71.04±8.19)%,(47.27±5.82)%和(80.63±9.46)%,心肌间质纤维化百分率分别为(2.24±0.25)%,(1.12±0.14)%,(1.09±0.11)%,(4.36±0.31)%和(0.51±0.05)%,RhoA/β-actin分别为(32.48±4.11)×10^(-2),(9.12±1.07)×10^(-2),(9.04±1.02)×10^(-2),(41.65±5.03)×10^(-2)和(5.03±0.74)×10^(-2),ROCK1/β-actin分别为(39.86±3.75)×10^(-2),(27.98±3.17)×10^(-2),(28.65±3.26)×10^(-2),(53.54±7.11)×10^(-2)和(22.36±2.84)×10^(-2),模型组的上述指标与低、高剂量实验组和对照组、空白组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论苦参碱能明显改善心力衰竭大鼠的心功能,减轻心肌纤维化程度,且药物浓度越高作用效果越明显,其作用可能与抑制RhoA/ROCK1信号通路活性有关。

川芎嗪对两肾一夹高血压模型大鼠心肌的保护作用及机制

目的 探讨川芎嗪对两肾一夹高血压模型大鼠心肌的保护作用及对Ras同源基因家族蛋白A(RhoA)/Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)通路的影响。方法 通过两肾一夹法构建高血压大鼠模型,将SD雄性大鼠50只随机分成5组:假手术组(灌胃等量生理盐水),模型组(造模成功后灌胃等量生理盐水),坎地沙坦组[造模成功后灌胃10 mg/(kg·d)坎地沙坦],川芎嗪低、高剂量组[造模成功后分别灌胃30、50 mg/(kg·d)川芎嗪],每组各10只。每日1次,连续给药4周。通过血压仪测量给药2、4周后各组大鼠动脉收缩压、心率。末次给药24 h后,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组大鼠血浆中内皮素1、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白I(cTnI)含量,HE染色观察各组大鼠左心室心肌细胞形态变化,Masson染色观察心肌胶原组织结构变化,计算心肌胶原容积分数(CVF),实时荧光定量聚合酶链反应和Western blot检测各组大鼠左心室组织RhoA、ROCK1、转化生长因子β;(TGF-β;)mRNA及蛋白表达情况。结果与假手术组相比,干预前,干预2、4周,模型组大鼠收缩压、心率升高(均P<0.05)。干预2、4周,与模型组相比,坎地沙坦组,川芎嗪低、高剂量组大鼠收缩压、心率降低(P<0.05);坎地沙坦组和川芎嗪高剂量组大鼠收缩压低于川芎嗪低剂量组(均P<0.05)。与假手术组相比,模型组大鼠出现心肌细胞排列紊乱、细胞间隙不明显、纤维组织增生、排列不规则、有大量蓝色胶原组织表达等病理变化,心肌CVF升高;与模型组相比,坎地沙坦组,川芎嗪低、高剂量组大鼠上述病理变化明显减轻,心肌CVF降低[心肌CVF:坎地沙坦组(1.71±0.15)%比川芎嗪高剂量组(1.76±0.21)%比川芎嗪低剂量组(3.53±0.37)%比模型组(4.72±0.43)%比假手术组(1.15±0.10)%,F=230.903,P<0.001]。与假手术组相比,模型组大鼠血浆内皮素1、AngⅡ、TNF-α、IL-6、CK-MB、cTnI升高,左心室组织RhoA、ROCK1、TGF-β;mRNA及蛋白表达升高(均P<0.05)。与模型组比较,坎地沙坦组,川芎嗪低、高剂量组血浆内皮素1、AngⅡ、TNF-α、IL-6、CK-MB、cTnI含量,左心室组织RhoA、ROCK1、TGF-β;mRNA及蛋白表达降低(P<0.05)。川芎嗪高剂量组和坎地沙坦组大鼠上述指标低于川芎嗪低剂量组(P<0.05)。结论 川芎嗪降低血压,缓解心肌组织损伤,可能与抑制RhoA/ROCK通路有关。

CHK1通过RhoA/ROCK信号通路对宫颈癌细胞放疗敏感性的影响及机制研究

目的研究细胞周期监测点激酶1(CHK1)通过Ras同源基因家族蛋白A(Rho A)/Rho关联含卷曲螺旋结合蛋白激酶(ROCK)信号通路对宫颈癌细胞放疗敏感性的影响及机制。方法取宫颈癌HeLa细胞随机分为A组(不做处理)、B组(HeLa细胞经8 Gy照射处理)、C组(转染si-CHK1至HeLa细胞)、D组(转染si-CHK1至HeLa细胞+8 Gy照射处理)、E组(转染si-CHK1至HeLa细胞+RhoA信号通路激活剂+8 Gy照射处理)。RT-qPCR检测细胞CHK1 mRNA相对表达量,MTT实验检测细胞增殖能力,平板克隆形成实验检测放疗敏感性,流式细胞术检测细胞周期分布、细胞凋亡,Western blot检测CHK1、RhoA、ROCK蛋白相对表达量。结果与A组比较,B组、C组、D组、E组CHK1 mRNA相对表达量、MTT实验A值、细胞克隆形成率降低,且D组<B组<C组、E组(P<0.05)。与A组比较,B组、C组、D组及E组G1期、S期细胞分布比例增加,G2/M期细胞分布比例减少,且G1期、S期细胞分布比例D组>B组>C组、E组(P<0.05),G2/M期细胞分布比例D组<B组<C组、E组(P<0.05)。与A组比较,B组、C组、D组、E组细胞凋亡率增加,CHK1、RhoA、ROCK蛋白相对表达量降低,且细胞凋亡率,D组>B组>C组、E组,CHK1、RhoA、ROCK蛋白相对表达量,D组<B组<C组、E组(P<0.05)。结论CHK1低表达可增强宫颈癌细胞的放疗敏感性,可能是通过抑制RhoA/ROCK信号通路相关蛋白表达发挥作用。

MIP-1α在多发性骨髓瘤中导致骨质破坏的可能机制研究

目的建立多发性骨髓瘤(MM)小鼠模型,分析巨噬细胞炎症蛋白1α(MIP-1α)对小鼠骨质破坏可能的影响机制。方法取非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)雌性小鼠24只,随机分为常规建模组、建模抑制组与空白对照组共三组,各组均8只。除空白对照组外,另两组接种RPMI 8226细胞混悬液建立MM小鼠模型。建模抑制组建模成功后经皮下注射Y-27632通路抑制剂,其余两组注射同体积生理盐水,连续注射1周。实验终末期,对各组小鼠进行免疫组化、X线及MIP-1α、骨源性碱性磷酸酶(BALP)、Ras同源基因家族蛋白A(RhoA)/Rho相关螺旋卷曲蛋白激酶(ROCK)表达水平检测,分析MIP-1α对MM建模小鼠骨质破坏的可能影响机制。结果MM常规建模组小鼠观察时间内下肢瘫痪6例(75.00%),建模抑制组下肢瘫痪4例(50.00%)。较之于空白对照组,常规建模组病理切片视野下可见恶性浆细胞,破骨细胞明显增多、骨质破坏严重、胫骨周围组织明显肿大,但接受Y-27632通路抑制剂的建模抑制组破骨细胞减少,骨质破坏轻微,胫骨周围有微肿胀软组织影。MIP-1α表达水平比较,常规建模组(332.80±85.60)pg/ml、建模抑制组(296.40±67.54)pg/ml较空白对照组(8.40±2.36)pg/ml均有显著增高(P<0.01);且常规建模组小鼠的BALP水平降低,RhoA与ROCK1表达水平上升,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);应用Y-27632通路抑制剂后小鼠MIP-1α表达水平降低,BALP回升,RhoA与ROCK1表达被抑制而降低(P<0.05)。结论MIP-1α可能是通过RhoA/ROCK1信号通路对MM建模小鼠的骨质造成破坏,因此抑制MIP-1α表达水平,对延缓MM小鼠的骨质破坏、延长生存期有重要意义。

右美托咪定调节RhoA/ROCK信号通路对子宫平滑肌收缩的影响

目的探究右美托咪定(DEX)是否通过调节Ras同源基因家族蛋白A(RhoA)/Rho相关蛋白激酶(ROCK)信号通路进而影响子宫平滑肌收缩。方法取已孕临产雌性Wistar大鼠20只,每只子宫分离3段平滑肌组织,置于恒温水浴槽中,静息张力设定1.0 g,采用累积给药法观察终浓度为0、1×10^(-7)、1×10^(-6)、1×10^(-5)mol/L的DEX对子宫平滑肌自主收缩的频率和幅度的影响。原代分离大鼠子宫平滑肌细胞通过免疫荧光技术鉴定,激光共聚焦显微镜检测细胞中Ca^(2+)浓度;Western blot检测RhoA、ROCK2和肌球蛋白磷酸酶(MYPT1)磷酸化(p-MYPT1)蛋白以及DEX和RhoA激活剂干预各蛋白质的表达。结果DEX终浓度为1×10^(-6)和1×10^(-5)mol/L时离体大鼠子宫平滑肌收缩强度减弱,收缩频率与时间延长(P<0.05);DEX处理大鼠子宫平滑肌细胞显著降低Ca^(2+)浓度(P<0.05),DEX与水仙环素(narciclasine,Nac)联合处理大鼠子宫平滑肌细胞Ca^(2+)浓度增加(P<0.05)。DEX处理大鼠子宫平滑肌细胞,RhoA、ROCK2和p-MYPT1蛋白表达降低(P<0.05),RhoA激活剂水仙环素干预后,RhoA、ROCK2和p-MYPT1蛋白表达有所升高(P<0.05)。结论右美托咪定通过调节RhoA/ROCK信号通路,影响子宫平滑肌收缩。