靶向敲减Ras癌蛋白融合型泛素连接酶E3的构建

目的应用蛋白质敲减技术原理,构建理论上能够靶向敲减Ras癌蛋白的融合型泛素连接酶E3的真核表达载体。方法选取Raf-1、PI3K、RalGDS中能够与Ras蛋白相互作用的结合结构域和具有泛素连接酶活性的F-Box及U-Box作为功能结构域,采用分子克隆技术依次将其连入pcDNA3.1中构建融合蛋白表达载体,双酶切、PCR和测序技术检测连入核苷酸片段的正确性,Western blot检测融合蛋白表达载体在真核细胞内表达的正确性和作用有效性。结果成功获得6个融合蛋白E3表达载体,5个能够在真核细胞内有效表达,其中(RBD+CRD)Raf-1-U-Box-pcDNA3.1能够敲减人胰腺癌细胞系PANC-1细胞中Ras蛋白。结论成功构建能够靶向敲减Ras癌蛋白的融合蛋白表达载体,为下一步应用蛋白质敲减技术奠定了实验基础。

蛋白激酶C对鼻咽癌细胞P21ras表达的影响

使用蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）抑制剂与抗Ｐ２１Ｈ－ｒａｓ单抗，通过免疫细胞化学，双参数流式细胞仪等方法，探讨鼻咽癌细胞ＣＮＥ－２Ｚ中ＰＫＣ与Ｈ－ｒａｓ表达的关系。结果：１）Ｐ２１ｒａｓ蛋白在ＣＮＥ－２Ｚ细胞主要在胞膜（２７％）与胞浆（９３．７％）表达。作用于ＰＫＣ调节区的抑制剂ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ（ＳＳ）（２×１０－５ｍｏｌ／Ｌ）与作用于催化区的ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ（ＳＴ）（２×１０－６ｍｏｌ／Ｌ）在明显抑制细胞生长的浓度使Ｐ２１ｒａｓ表达程度均减弱，胞膜阳性率明显降低，分别为５．６％与１．６％。２）蛋白质－ＤＮＡ双参数流式细胞法测定发现在Ｇ１期细胞群Ｒａｓ蛋白表达差异较大，提示Ｒａｓ蛋白主要在Ｇ１期合成逐渐增多；经ＰＫＣ抑制剂ＳＳ与ＳＴ处理后，Ｇ１期细胞表达的差异减小，说明ＰＫＣ抑制剂抑制了Ｇ１期Ｒａｓ蛋白合成。本研究结果提示：ＰＫＣ对Ｒａｓ蛋白向发挥作用的部位胞膜的转移具有一定的调控作用。Ｒａｓ蛋白的表达可能与ＣＮＥ－２Ｚ细胞Ｇ１／Ｓ期的过渡有关。

胰腺癌组织中p21ras蛋白表达与微血管密度的关系及其临床意义

目的检测胰腺癌组织中p21ras蛋白的表达及微血管密度(MVD)计数,探讨两者的关系及其临床意义。方法选择病理证实为胰腺导管腺癌的48例患者的石蜡切块标本,应用EnVision显色系统免疫组织化学方法进行p21ras蛋白检测和MVD计数。结果p21ras蛋白表达率胰腺癌组织为60·41%,癌旁组织为37·5%(P<0·05)。MVD计数p21ras表达阳性组为22·207±5·815,p21ras阴性组为18·053±5·502(t=3·597,P<0·01)。结论胰腺癌组织中p21ras的表达与MVD计数相关,提示ras基因突变可能促进肿瘤微血管的形成。

氧自由基对胃癌细胞MGC-803的P53、P21ras蛋白表达的影响

目的:观察氧自由基对人胃癌细胞系MGC-803细胞的P53、P21ras蛋白表达的影响,探讨氧自由基在胃癌发生发展中的作用。方法:通过细胞培养、采用硫代巴比妥酸反应物质法检测细胞内氧自由基中间产物丙二醛(MDA)的含量,应用免疫组织化学技术检测MGC-803细胞内不同浓度的氧自由基对P53、P21ras蛋白表达的影响。结果:氧自由基含量升高可增强MGC-803细胞内P53、P21ras蛋白表达(P<0.01),氧自由基水平降低则P53、P21ras蛋白表达减弱(P<0.01)。结论:胃癌细胞系MGC-803内氧自由基水平的改变可影响其P53、P21ras蛋白表达。

宫颈癌ras癌基因产物P21免疫组织化学检测

用P21高表达质PJCL-E_30制备的P21单克隆抗体,对存档收藏的宫颈癌、宫颈炎组织蜡块进行了ABC免疫组化检测。其结果,在91.6％的宫颈癌和56.2％的宫颈炎切片中,都有P21阳性细胞检出,但阳性强度宫颈癌明显高于宫颈炎(P<0.005);宫颈癌不同型之间P21阳性强度无显著性差异。提示:1)宫颈上皮从正常到恶性表型的转化,与Ha-ras癌基因产物P21高表达相关,2)P 21免疫组化检查可以反应ras基因的表达与分布,其方法敏感、快速,操作简便,可作为肿瘤诊断的一个指标以及作为鉴别良、恶性宫颈疾患的重要参考。

儿童白血病脑脊液p53蛋白和ras癌基因蛋白表达及比值分析

目的 探讨 p5 3蛋白和 ras癌基因蛋白在白血病儿童脑脊液 (CSF)中的表达水平及与白血病化疗的关系。方法 应用 Western斑点印迹法检测 5 4例儿童急性白血病 CSF中 p5 3蛋白和 ras癌基因蛋白表达水平 ,并计算 p5 3 /ras比值。结果 白血病儿童危象期 CSF中 p5 3蛋白明显高于非肿瘤对照水平 (P<0 .0 1)。缓解期 p5 3蛋白和 ras癌基因蛋白与危象期比有增高趋势 (P<0 .0 1) ,同时高于非肿瘤对照水平 (P<0 .0 1)。白血病儿童 CSF危象期 p5 3 /ras比值明显升高 (P<0 .0 1) ,缓解期比值下降接近非肿瘤对照组 (P>0 .0 5 )。 17例白血病儿童化疗前后双份 CSF中 p5 3 /ras比值动态观察发现 ,化疗前比值升高 ,化疗后比值下降 ,其临床表现及预后好 ,如化疗前后比值持续在高水平不下降 ,临床表现差 ,预后不佳 ,骨髓近期将复发。结论 检测急性白血病儿童 CSF中 p5 3蛋白和ras癌基因蛋白 ,计算 p5 3 /ras比值变化有助于指导化疗、评定疗效、监测预后。

p21ras和VEGF在胰腺癌组织中的表达及临床意义

目的检测胰腺癌组织中的p21ras和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达情况,并探讨其与肿瘤临床病理因素的关系。方法选择48例病理证实为胰腺导管腺癌患者的手术切除石蜡切块标本,应用EnVision显色系统免疫组织化学方法进行p21ras和VEGF蛋白检测。结果胰腺癌组织中p21ras蛋白表达率为60·4%,其表达与胰腺癌患者年龄、性别、组织学类型、肿瘤大小、淋巴结转移及肿瘤分期无明显关系;VEGF蛋白表达率为64·6%,其表达与肿瘤大小及TNM分期有关。p21ras表达阳性组的VEGF表达明显高于其阴性组(P<0·05)。结论p21ras和VEGF在胰腺癌组织中均呈高表达,p21ras表达与VEGF蛋白表达有相关性,提示K-ras基因突变可上调VEGF表达。

肾癌组织中ras基因产物p21表达和K－ras基因点突变分析

目的研究ｒａｓ基因激活在肾癌发生中的意义。方法应用聚合酶链反应－单链构象多态性分析（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）和免疫组织化学检测肾癌组织Ｋ－ｒａｓ基因第１２位密码子突变及其基因产物ｐ２１蛋白的表达水平。结果４２例肾癌中６例Ｋ－ｒａｓ基因第１２位密码子点突变，１９例ｐ２１蛋白阳性表达，正常肾组织和癌旁组织均阴性。ｐ２１表达与肿瘤分期和分级有关。ｐ２１阳性患者的手术后生存率明显低于ｐ２１阴性患者。结论肾癌Ｋ－ｒａｓ基因第１２位密码子点突变并不常见，ｐ２１表达可能成为肾癌恶性程度和预后评价的指标。

p21^(Ha-ras)原核表达载体的构建、表达及纯化的研究

目的:构建PET-28a(+)-Ha-ras原核表达质粒,并表达、纯化得到p21ras蛋白,为研究p21ras在肿瘤发病中的作用和机制以及p21ras细胞内抗体抗肿瘤的研究奠定基础。方法:培养人肝癌细胞株7703,提取总RNA,通过RT-PCR特异扩增出Ha-ras cDNA,然后应用TA克隆策略将纯化后的Ha-ras插入至中间载体pMD18-T vector中得到重组质粒PMD-18T vector-ras,重组质粒PMD-18Tv ector-Ha-ras经过BamHⅠ和HindⅢ双酶切后纯化回收得到具有黏性末端的Ha-ras cDNA,将PET-28a(+)同样经过BamHⅠ和HindⅢ双酶切后纯化回收得到与ras cDNA相同的黏性末端的线形质粒片段,将具有黏性末端的ras cDNA与酶切后的PET-28a(+)定向连接,构建出重组质粒PET-28a(+)-Ha-ras,经酶切鉴定,并通过核苷酸序列测序证实。将鉴定正确的PET-28a(+)-Ha-ras转入感受态BL-21(DE3)中诱导表达,利用组氨酸"标签"(His-Tag)对p21ras进行金属螯合亲和层析纯化。结果:测序分析证实,克隆入PET-28a(+)的Ha-ras序列与Genbank登录号为"NM_005343"的Ha-ras cDNA序列一致,将重组质粒PET-28a(+)-Ha-ras转化BL21(DE3),用IPTG诱导目的蛋白表达。SDS-PAG和蛋白纯化结果表明,PET-28a(+)-Ha-Ras在E.coli中获得可溶性高表达,经Ni-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了PAGE纯的p21ras蛋白。结论:成功构建了原核表达载体PET-28a(+)-Ha-ras,并经表达、纯化得到活性形式的p21ras蛋白,从而为研究p21ras在肿瘤发病中的作用和机制以及P21ras细胞内抗体抗肿瘤的研究奠定了基础。

肉桂醛对肝癌HepG2细胞p21和CDK4蛋白的影响

目的检测肉桂醛对肝癌HepG2细胞p21和细胞周期依赖性蛋白激酶4(cyclin-dependent kinase 4,CDK4)蛋白表达的影响。方法肉桂醛(3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10 g/L)作用肝癌HepG2细胞后,MTT比色法检测HepG2细胞增殖活性和半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC_(50))。流式细胞术检测肉桂醛对HepG2细胞凋亡影响。免疫荧光法检测HepG2细胞p21和CDK4蛋白的表达。结果肉桂醛能抑制HepG2细胞增殖,且呈剂量和时间依赖性,24小时、48小时和72小时IC_(50)值分别为0.68、0.45、0.35 g/L(P<0.01)。肉桂醛组(0.900、0.450、0.225 g/L)肝癌HepG2细胞凋亡率高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。肉桂醛能增加p21蛋白和降低CDK4蛋白在HepG2细胞中的表达,各浓度肉桂醛组的p21、CDK4蛋白表达与对照组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论肉桂醛可抑制人肝癌细胞HepG2的增殖,可能与调节p21和CDK4的蛋白表达有关。

甲状腺乳头状癌p53基因突变及其与p21^(WAF1/CIP1)蛋白定量表达的关系

目的 初步探讨甲状腺乳头状癌 (PTC)中 p5 3基因突变及其与 p2 1WAF1 /CIP1 蛋白定量表达的关系。 方法 采用 PCR- SSCP、DNA序列分析、免疫组织化学、图像分析等技术 ,检测 4 1例 PTC和 10例甲状腺滤泡性腺瘤标本组织中 p5 3基因突变情况和 p2 1蛋白染色状况。 结果 (1)伴 p5 3基因突变 ( 组 )和不伴突变 ( 组 ) PTC的原发肿瘤 (T)、淋巴结转移 (N)及远处转移 (M)差异无显著性 (P>0 .0 5 )。 (2 ) 、 和 之间 , 和 、 和 、 和 的平均积分光密度值 (D)差异具有显著性意义 (P<0 .0 1)。 结论 (1) PTC的演进和 p5 3基因突变与否无直接关系 ,p5 3蛋白的空间构象可能发挥关键作用。 (2 )在 PTC的发生、发展中存在依赖野生型 p5 3蛋白诱导P2 1WAF 1

p21^(WAF1)蛋白的表达与非小细胞肺癌增殖和预后的关系

目的:检测人非小细胞肺癌(nonsmallcelllungcancer,NSCLC)组织中的p21WAF1/CIP1表达水平,探讨NSCLC中p21WAF1/CIP1的表达与细胞增殖活性和预后的关系。方法:采用流式细胞术检测60例NSCLC中p21WAF1/CIP1的表达量及DNA含量;分析p21WAF1/CIP1表达水平与S期细胞比例、预后的关系。结果:正常肺组织中未见p21WAF1/CIP1的表达,60例NSCLC组织中p21WAF1/CIP1阳性率为60%(36/60),p21WAF1/CIP1阳性表达者的S期细胞比例(10.87±0.69)%低于阴性表达者(13.30±0.93)%,t=3.232,P=0.001。p21WAF1/CIP1的表达与患者的术后累积生存月数和5年生存率有关,p21WAF1/CIP1阳性表达者的术后平均生存月数(40个月)明显高于阴性表达者(25个月),t=2.885,P=0.003;5年生存率(29%)也高于阴性表达者(9%),t=2.712,P=0.004。结论:p21WAF1/CIP1表达是判断NSCLC预后的一个可参考指标。

睾丸精原细胞瘤中p27^(kip1)、p21^(ras)、p16的表达及其临床意义

目的 探讨 p2 7kip1、p2 1ras、p16在精原细胞瘤中的表达及临床意义。方法 采用免疫组化 S- P法检测 4 6例精原细胞瘤组织、10例正常睾丸组织 p2 7kip1、p2 1ras、p16蛋白的表达情况。同时用 PCR法检测 2 7例精原细胞瘤组织 p16和 p2 1基因的缺失情况。结果 p2 7kip1在精原细胞瘤组织中的阳性表达率为 4 8.9% (2 2 / 4 5 ) ,显著低于正常睾丸组织的 90 .0 % (P<0 .0 5 ) ,p2 7kip1蛋白在精原细胞瘤组织中的阳性表达与淋巴结和远处器官转移相关 (P<0 .0 5 ) ,与组织学分型无关 ;p2 1ras、p16蛋白在精原细胞瘤组织中的阳性表达率分别为 4 2 .2 % (19/ 4 5 )和 6 0 .0 % (2 7/4 5 ) ,与正常睾丸组织比较 ,差异无显著性 (P>0 .0 5 )。 p16、p2 1ras蛋白在精原细胞瘤组织中的表达与组织学类型及淋巴结转移无相关性 (P>0 .0 5 )。p2 1基因无纯合子缺失。p16基因纯合子缺失率为 4 4 .4 % (12 / 2 7) ,其缺失率与精原细胞瘤的组织学类型、淋巴结和远处器官转移无关。p2 7kip1、p2 1ras及 p16阳性表达率之间有相关性 (P<0 .0 5 )。结论 p2 7kip1蛋白的低表达或缺失可能与精原细胞瘤的发生、浸润转移有关 ,可作为估计精原细胞瘤预后的良好指标。 p16基因的缺失和表达下降可能是精原细胞瘤发生的早期事件。

洛伐他汀或辛伐他汀协同组蛋白去乙酰化酶抑制剂对人非小细胞肺癌的抑制作用

目的：研究他汀类药物能否协同增强组蛋白去乙酰化酶抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸（SAHA）对非小细胞肺癌A549细胞的生长抑制和凋亡诱导作用。方法：采用磺酰罗丹明B比色法检测不同浓度的SAHA与洛伐他汀／辛伐他汀合用对A549细胞存活率的影响；采用Annexinv／PI双染结合流式细胞术检测2．5μmol／LSAHA与不同浓度的洛伐他汀联合应用对A549细胞凋亡的影响；并采用蛋白质印迹法检测2．5μmot／LSAHA与5μmol／L洛伐他汀联合作用对凋亡相关标志蛋白聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（c-PARP）及p21蛋白表达水平影响。结果：与SAHA组比较，洛伐他汀／辛伐他汀与SAHA合用组减少A549细胞的存活率。不同浓度的洛伐他汀能协同增加SAHA对A549细胞的凋亡诱导作用，同时合用组c-PARP的表达较单用两组增加，说明洛伐他汀能协同SAHA诱导A549细胞凋亡。2．5μmol／LSAHA单独作用A549细胞48h可以上调A549细胞p21蛋白的表达，5μmol／L洛伐他汀与2．5μmol／LSAHA合用可以回调p21蛋白的表达。结论：洛伐他汀及辛伐他汀能增加SAHA对非小细胞肺癌A549细胞的生长抑制作用，其中洛伐他汀增强SAHA对A549细胞的生长抑制作用可能与其共同作用后p21蛋白表达下调相关。

非霍奇金淋巴瘤组织p53和p21ras的表达及其临床意义

目的 :研究非霍奇金淋巴瘤(non Hodgkin’slymphoma ,NHL )中 p5 3和p2 1ras蛋白的表达情况及相关性。 方法 :应用免疫组化法检测 5 8例NHL的 p5 3和p2 1ras蛋白表达情况 ,并作相关性分析。结果 :5 8例NHL中 ,阳性表达率 p5 3蛋白为 62 1%( 3 6/5 8) ,p2 1ras蛋白为 5 6 9% ( 3 3 /5 8)。p5 3蛋白在低度及高度恶性组表达率为 2 9 2 %( 7/2 4)和 85 3 % ( 2 9/3 4) ,P <0 0 5。p2 1ras蛋白在低度及高度恶性组表达率 2 0 8%( 5 /2 4)和 82 4% ( 2 8/3 4) ,P <0 0 1。结论 :在NHL发展中 ,p5 3和p2

P21基因rsi059234位点多态性与东北地区汉族女性子宫内膜癌发病风险相关性

【目的】研究 p21基因 rs1059234位点多态性与东北地区汉族女性子宫内膜癌之间的相关性。【方法】通过测序及PCR-RFLP方法，对263例子宫内膜癌患者（观察组）及315例健康人群（对照组）的外周血DNA的 p21基因 rs1059234位点进行基因型分型，并分析分型与子宫内膜癌之间的相关性。【结果】观察组中 rs1059234位点C等位基因频率较对照组明显升高（P ＝0．039）。rs1059234位点 CC基因型频率在观察组中与对照组相比呈明显升高趋势（0．335vs 0．219，P＝0．045），CC基因型增加子宫内膜癌的风险（OR＝1．589，95％ CI：1．010～2．502），但是经回归分析校正后，CC 基因型并不增加子宫内膜癌的风险（OR＝1．623，95％ CI：0．720～3．659，P＝0．243）。【结论】在东北地区汉族女性中，p21基因 rs1059234位点的多态性与子宫内膜癌的发生风险无明显关联。

几项生物学指标与肺癌患者5年生存率的相关性分析

目的:评估p53蛋白、p21,CD44v,P-糖蛋白及常用临床病理指标对判断肺癌患者预后的意义。方法:收集北京协和医院胸外科1998-02/07收治的肺癌患者30例,所有患者在术前均未接受过化疗或放疗。采用流式细胞术检测30例冻存的肺癌及10例相应远离肿瘤部位的正常肺组织中p21,CD44v,P-糖蛋白、p53蛋白的表达,结合临床病理指标,与患者术后5年生存率及生存期进行单因素和多因素分析。计数资料采用精确概率法进行检验,同时用Cox比例风险模型对患者的预后进行多因素分析。结果:①肺癌组织中p53蛋白、p21,CD44v,P-糖蛋白的阳性率明显高于远癌肺组织(P<0.01)。②p53蛋白、CD44v,P-糖蛋白阳性表达者5年生存率显著低于阴性表达者(P<0.05)。吸烟患者5年生存率亦明显低于不吸烟的患者(12%比62%,P<0.05)。随着病理分期的增加、肿瘤直径的增大和分化程度的降低,患者5年生存率亦呈下降趋势(P<0.01或0.05)。③单因素分析表明,影响患者术后5年生存率的因素为p53蛋白、CD44v、P-糖蛋白的异常表达、患者是否吸烟及手术时p-TNM分期、肿瘤大小和分化程度(P<0.05或0.01)。④多因素分析则显示,仅p53的异常表达、患者是否吸烟及p-TNM分期是影响患者术后生存期的独立预后指标。结论:p53蛋白、CD44v、P-糖蛋白的异常表达、患者是否吸烟、p-TNM分期、肿瘤大小及分化程度对肺癌预后有重要意义,其中p53蛋白的异常表达、患者是否吸烟和p-TNM分期可能是更有价值的预后指标。

PTEN、p21基因在新疆哈萨克族食管癌中的表达

目的研究PTEN、p21基因在哈萨克族食管癌中的表达。方法采用RT-PCR法检测PTEN、p21基因在48例哈萨克族食管癌组织及远端无癌组织中的表达,并分析其表达与肿瘤分化、TNM分期、临床分期、淋巴结转移的关系。结果 PTEN基因在癌组织和远端无癌组织中的表达阳性率分别为75%、45.8%,癌组织高于远端无癌组织(χ2=8.537,P<0.05);p21基因在癌组织和远端无癌组织中表达的阳性率分别为95.8%、97.9%,差异无统计学意义(χ2=0.344,P>0.05)。PTEN和p21表达与食管癌分化程度、不同浸润深度及有无淋巴结转移均无相关性。结论 PTEN、p21基因可能均不是哈萨克族食管癌的主要致病基因。

Forskolin对人胃癌细胞增殖影响的实验研究

目的 :探讨毛喉萜 (Forskolin)的抗胃癌作用。方法 :采用MTT比色法、克隆形成法观察Forsko lin对SGC 790 1细胞的作用 ,利用免疫细胞化学方法检测其对rasp2 1、p5 3蛋白表达的影响。结果 :Fors kolin可明显抑制SGC 790 1细胞增殖 ,经Forskolin处理细胞 3d后 ,rasp2 1、p5 3蛋白表达均有明显下降 ,P <0 0 1。结论 :Forskolin能明显抑制人胃癌SGC 790 1细胞增殖 ,其作用可能与降低rasp2 1、p5 3蛋白表达有关。