敲降Ras相关结合蛋白23表达对食管鳞状细胞癌细胞侵袭和迁移的影响及机制

目的探讨Ras相关结合蛋白23(RAB23)在食管鳞状细胞癌(简称食管鳞癌)细胞侵袭和迁移中的作用和机制。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应检测16例配对食管鳞癌及癌旁正常组织中RAB23 mRNA的表达。比较基因表达综合(GEO)数据库的GSE20347数据集中食管鳞癌和配对癌旁正常组织RAB23 mRNA的表达水平。免疫组织化学检测106例配对食管鳞癌和癌旁正常组织、33例淋巴结阳性与10例淋巴结阴性患者原发灶与淋巴结组织中RAB23蛋白含量。在食管鳞癌KYSE30和KYSE150细胞中瞬时敲降RAB23表达(转染si-RAB23-1和si-RAB23-9)或者稳定敲降RAB23表达(转染sh-RAB23), 采用Western blot法验证RAB23敲降效率, 采用细胞计数试剂盒8法和裸鼠皮下成瘤实验检测食管鳞癌细胞的增殖能力, 采用Transwell实验和裸鼠尾静脉-肺转移实验检测食管鳞癌细胞的侵袭和迁移能力, 采用细胞黏附实验检测食管鳞癌细胞的黏附能力, 采用转录组测序技术分析RAB23敲降后对细胞转录谱的影响, 并通过Western blot检测验证相关信号通路。结果 16例食管鳞癌组织中RAB23 mRNA表达水平为0.009 7±0.008 9, 高于癌旁正常组织[0.003 2±0.003 7, P=0.006]。对GEO数据库GSE20347数据集中食管鳞癌和配对癌旁正常组织表达谱的生信分析显示, 食管鳞癌组织中RAB23 mRNA表达水平为4.30±0.25, 高于癌旁正常组织(4.10±0.17, P=0.037)。106例食管鳞癌组织中, 51例RAB23低表达, 55例RAB23高表达;而配对癌旁正常组织中, 82例RAB23低表达, 24例RAB23高表达, 食管鳞癌组织中RAB23表达水平高于配对癌旁正常组织(P<0.001)。33例淋巴结阳性食管鳞癌组织中, 1例RAB23低表达, 32例RAB23高表达;10例淋巴结阴性的食管鳞癌组织中, 3例RAB23低表达, 7例RAB23高表达。淋巴结阳性食管鳞癌组织中RAB23表达水平高于淋巴结阴性食管鳞癌组织(P=0.024)。33例阳性淋巴结组织中, 1例RAB23低表达, 32例RAB23高表达, 而10例阴性淋巴结组织中均为RAB23低表达。阳性淋巴结组织中RAB23表达水平高于阴性淋巴结组织(P<0.001)。瞬时或稳定敲降RAB23后, KYSE30细胞体外和体内的增殖能力无明显变化, KYSE30细胞的细胞侵袭和迁移能力下降, 而KYSE150细胞仅侵袭能力下降, 迁移能力无明显变化。sh-RAB23组KYSE30细胞黏附细胞的数量为(313.75±89.34)个, 少于sh-NC组[(1 030.75±134.29)个, P<0.001]。sh-RAB23组KYSE150细胞的黏附细胞数为(710.5±31.74)个, 也少于sh-NC组[(1 005.75±61.09)个, P<0.001]。转录组测序分析显示, 敲降RAB23后, si-RAB23-1组和si-RAB23-9组KYSE30细胞中黏着斑相关信号通路均被削弱, sh-RAB23组KYSE30和KYSE150细胞中p-FAK和p-paxillin表达水平降低。结论 RAB23在食管鳞癌组织中高表达, 与淋巴结转移有关。敲低RAB23表达后能够削弱黏着斑相关信号通路, 进而抑制食管鳞癌细胞的侵袭、迁移和黏附。

非小细胞肺癌患者血浆 RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO 基因甲基化状态观察

目的观察非小细胞肺癌(NSCLC)患者血浆抑癌基因runt相关转录因子3(RUNX3)、ras相关结构域家族基因1A(RASSF1A)、3-0-硫基转移酶-2(3-OST-2)、死亡相关蛋白激酶(DAPK)、膜结合受体型蛋白酪氨酸磷酸酶O(PTPRO)等基因启动子区域的甲基化状态。方法采用甲基化特异PCR技术对63例NSCLC患者血浆中RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因是否甲基化进行观察,并以25例健康人作对照。结果 NSCLC患者血浆中甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因检出率分别为46.0%、50.8%、26.9%、34.9%、41.3%;健康人血浆中甲基化PTPRO基因检出率为12.0%,而甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK均未检出;两者甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因检出率相比,P均<0.05。NSCLC患者血浆中上述5种甲基化基因联合检测的敏感度为88.9%、特异度为88.0%。血浆甲基化RUNX3基因检出率与NSCLC的病理类型、临床分期以及分化程度有关(P均<0.05);甲基化RASSF1A基因检出率与NSCLC的分化程度有关(P<0.05)。结论 NSCLC患者血浆中甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因检出率明显高于健康人。联合检测血浆中甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因有可能会有助于NSCLC的早期诊断及其生物学行为的判断。

RRAGD-EGFP融合蛋白在MDA-MB-436细胞中的表达定位

目的:构建RRAGD-EGFP融合基因表达载体pQCXIP-RRAGD-EGFP,并检测RRAGD-EGFP融合蛋白在MDA-MB-436细胞中的表达定位。方法:提取HEK293细胞总RNA,逆转录得到cDNA并扩增RRAGD基因,克隆入逆转录载体pQCXIP-EGFP-N1,病毒包装后感染人乳腺癌细胞系MDA-MB-436,活细胞观察其在细胞内的表达定位。结果:构建获得逆转录病毒载体pQCXIP-RRAGD-EGFP,融合蛋白RRAGD-EGFP定位于胞浆囊泡和细胞核。结论:RRAGD-EGFP融合蛋白在MDA-MB-436细胞中表达定位于胞浆囊泡,与其参与溶酶体调节功能一致,为后续分析RRAGD在cell-in-cell中的作用奠定了基础。

LITAF、RAB7、LMNA和MTMR2基因在中国人腓骨肌萎缩症患者的突变分析

为了分析LITAF、RAB7、LMNA和MTMR2基因在中国人腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth disease,CMT)的突变特点,文章分别应用PCR结合DNA序列分析方法和PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)结合DNA序列分析方法对6个常染色体显性遗传家系先证者和27个散发病例进行LITAF和RAB7基因突变分析;应用PCR-SSCP结合DNA序列分析方法对14个常染色体遗传的CMT家系先证者和27个散发患者进行LMNA和MTMR2基因突变分析。结果发现:LITAF基因c.269G→A、c.274A→G序列变异和LMNA基因c.1243G→A、c.1910C→T序列变异,未发现RAB7和MTMR2基因的序列变异。其中LITAF基因c.269G→A、LMNA基因c.1243G→A和c.1910C→T为新发现的单核苷酸多态;LITAF基因c.274A→G为已知多态。说明LITAF、RAB7、LMNA和MTMR2基因突变在中国人CMT患者中罕见。

RRAGA基因的单核苷多态的研究

目的:通过对ras相关GTP结合蛋白A(Ras-relatedGTPbindingA,RRAGA)基因的单核苷酸多态(Singlenucleotidepolymorphism,SNP)进行检测,研究RRAGA基因与肺癌的相关性。方法:对RRAGA基因的启动子、外显子区域,使用PCR扩增和DNA测序方法,分别在24例肺癌患者的肺癌组织及24例正常人的外周血进行测序,比较它们之间可能存在的差异,确定该基因是否与肺癌相关。结果:RRAGA基因有4个SNP,其中3个SNP出现在RRAGA基因的启动子区,1个SNP出现在RRAGA基因的3'非翻译区,这4个SNP在正常人与肺癌患者无差异;但这4个SNP与国际公共数据库公布的SNP完全不同。结论:RRAGA基因与肺癌无相关性,中国人RRAGA基因的SNP与外国人的有很大差别。

RAB25沉默抑制结直肠癌细胞铁死亡的作用研究

目的:探讨沉默RAS相关结合蛋白25(ras-associated binding protein 25,RAB25)在结直肠癌(colorectal cancer,CRC)细胞铁死亡中的作用。方法:利用GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)数据库分析RAB25的表达水平及与铁死亡关键基因表达之间的关联。在CRC细胞系HCT116上构建慢病毒介导的RAB25沉默细胞株(shRAB25),应用定量实时聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和蛋白印迹法检测RAB25的表达情况。应用细胞增殖与毒性检测法(CCK8)检测不同浓度的(0~20μmol/L)铁死亡诱导剂erastin对沉默RAB25后细胞活力的影响;利用荧光显微镜和透射电镜分别观察erastin对沉默RAB25后的细胞形态和线粒体结构的影响;使用C11-BODIPY染色和流式细胞仪检测erastin对沉默RAB25后的细胞脂膜过氧化水平的影响。检测erastin与西妥昔单抗对沉默RAB25后的细胞活力的联合作用。结果:RAB25在CRC中表达升高(P<0.01);RAB25表达与铁死亡关键基因表达明显相关。当erastin≥10μmol/L时,与阴性对照组(空载慢病毒感染阴性组)相比,RAB25沉默组抑制了铁死亡导致的细胞杀伤(P<0.0001),细胞形态和线粒体结构更清晰完整;流式细胞术检测结果提示,细胞脂膜过氧化水平明显下降(P<0.0001)。RAB25表达使erastin和西妥昔单抗对HCT116细胞的联合杀伤作用明显增强。结论:沉默RAB25可抑制erastin诱导的CRC细胞铁死亡;RAB25可协同铁死亡诱导剂erastin诱导铁死亡,增强西妥昔单抗的疗效。

缺氧肾小管上皮细胞Rab7/Caveolin-1/MMP-2轴失调促进肾纤维化

目的:研究肾纤维化晚期Ras相关GTP结合蛋白7(Ras-related GTP binding protein 7,Rab7)可否通过小窝蛋白-1(Caveolin-1)的介导调节基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)的活性,从而对肾纤维化产生影响。方法:通过单侧输尿管结扎(unilateral ureteral obstruction, UUO)法构建C57BL/6小鼠肾纤维化模型,检测肾纤维化组织中缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)、Rab7和Caveolin-1的表达以及MMP-2的活性。利用肾小管上皮细胞株(HK-2)进行体外实验,构建HK-2 Rab7-shRNA细胞,将HK-2和HK-2 Rab7-shRNA细胞分别进行常氧和缺氧培养,并检测各组中HIF-1α、Rab7、Caveolin-1的表达和MMP-2的活性,以及纤维化相关指标I型胶原(Collagen-1)、波形蛋白(Vimentin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)的表达。结果:利用小鼠UUO模型发现,相较正常肾脏组织,肾纤维化组织中Rab7和Caveolin-1的表达均上调,而MMP-2的活性反而下降。进一步体外实验显示,在HK-2细胞中Rab7下调后可通过抑制Caveolin-1的表达进而提高MMP-2的活性,并会使Collagen-1、Vimentin和α-SMA等反映纤维化的指标表达下调。结论:Rab7与MMP-2的活性密切相关;Rab7对MMP-2活性的调节通过Caveolin-1介导;当Rab7表达受抑后,可促进肾纤维化的缓解。

LncRNA-HULC靶向miR-597/Rab23分子轴影响肝癌细胞生物学特性的机制研究

该文旨在探讨长链非编码RNA(LncRNA)-肝癌高表达基因(HULC)靶向微小RNA-597(mi R-597)/Ras相关蛋白23(Rab23)分子轴影响肝细胞癌(HCC)细胞生物学特性的机制。以湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院就诊的罹患HCC的76例患者为研究对象,qRT-PCR检测HCC患者组织中Lnc RNA-HULC、mi R-597及Rab23表达水平;并分析上述基因的表达水平与HCC的临床相关性;生物信息学方法和双荧光素酶报告实验分析Lnc RNA-HULC、mi R-597、Rab23信号轴的相互作用机制。以HCC细胞Hep G2为研究对象,将其分为si-NC组、si-HULC组、si-HULC+anti-NC组、siHULC+anti-mi R-597组,分别采用CCK8、Transwell实验、流式细胞仪检测各组Hep G2细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡情况;采用Western blot检测Hep G2细胞中Ki67、Caspase-3、Caspase-9、Rab23蛋白的表达情况。结果发现,HCC组织中Lnc RNA-HULC、Rab23的表达水平高于癌旁组织,miR-597的表达水平低于癌旁组织(P<0.05),且其表达情况与患者的TNM分期、分化程度等临床病理特征相关(P<0.05)。Lnc RNA-HULC靶向负调控mi R-597,miR-597靶向负调控Rab23。si-HULC组Lnc RNAHULC、Rab23 mRNA、增殖率、迁移数、侵袭数、Ki67蛋白、Rab23蛋白的表达水平低于si-NC组,mi R-597、凋亡率、Caspase-3蛋白、Caspase-9蛋白的表达水平高于si-NC组(P<0.05);与si-HULC组、si-HULC+anti-NC组比较,si-HULC+anti-miR-597组中mi R-597、凋亡率、Caspase-3蛋白、Caspase-9蛋白表达水平降低(P<0.05),Rab23 mRNA、增殖率、迁移数、侵袭数、Ki67蛋白、Rab23蛋白表达水平升高(P<0.05)。沉默Lnc RNA-HULC可能抑制肝癌细胞生物学特性,其机制可能是通过靶向mi R-597/Rab23分子轴实现的。

抑制Rac1表达对高糖诱发神经元损伤后线粒体自噬的影响

目的:评价抑制Ras相关的C3肉毒素底物1(ras-related C3 botulinum toxin substrate 1, Rac1)表达对高糖诱发神经元损伤的影响。方法:对数生长期PC12细胞接种于6孔板,采用随机数字表法将细胞分为4组(每组3孔):正常浓度葡萄糖组(C组)、高浓度葡萄糖组(HG组)、高浓度葡萄糖+慢病毒抑制Rac1组(HG+shRac1组)、高浓度葡萄糖+慢病毒阴性对照组(HG+NC组)。C组以葡萄糖浓度为4.5 g/L的DMEM完全培养基培养PC12细胞24 h, HG组以葡萄糖浓度为45 g/L的DMEM完全培养基培养PC12细胞24 h, HG+shRac1组以葡萄糖浓度为45 g/L的DMEM完全培养基培养用Rac1 shRNA慢病毒载体转染的PC12细胞24 h,HG+NC组以葡萄糖浓度为45 g/L的DMEM完全培养基培养用阴性慢病毒载体转染的PC12细胞24 h。Western blot法检测微管相关蛋白1轻链3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3)Ⅰ、LC3Ⅱ、Bcl-2/腺病毒E1B相互作用蛋白3 (Bcl-2/adenovirus E1B protein-interacting protein 3, BNIP3)和p62蛋白水平,并计算LC3Ⅱ/LC3Ⅰ;CCK-8法检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡率;二氢溴化乙啶法检测细胞活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平;荧光定量PCR法检测自噬相关基因7 (autophagy-related gene 7, Atg7)、三磷酸腺苷酶6 (adenosinetriphosphatase 6, ATPase6)和60S核糖体蛋白L13 (60S ribosomal protein L13, Rpl13)相对表达量,并计算ATPase6/Rpl13。结果:与C组比较,HG组和HG+NC组ROS水平和细胞凋亡率升高( P<0.05),细胞活力下降( P<0.05);与HG+NC组比较,HG+shRac1组ROS水平和细胞凋亡率降低( P< 0.05),细胞活力升高( P<0.05),Atg7相对表达量和BNIP3蛋白水平升高( P<0.05),p62蛋白水平降低( P<0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ升高( P<0.05),ATPase6/Rpl13降低( P<0.05)。 结论:抑制Rac1可减轻高糖诱发的神经元损伤,其机制可能与增强线粒体自噬有关。