低剂量CT结合SHOX2、RASSF1A甲基化在肺癌早期预警中的应用

目的探讨低剂量CT结合Ras相关区域家族蛋白1A(RASSF1A)、矮小同源盒基因2(SHOX2)甲基化在肺癌早期预测中的应用价值。方法选取2021年1月~2023年1月我院90例拟行肺结节手术患者,根据手术病理学分为肺良性结节组和肺癌组。2组均于术前行低剂量CT检查、SHOX2、RASSF1A甲基化检测,采用Kappa指数分析上述检查结果与手术病理学一致性,分析低剂量CT、SHOX2、RASSF1A甲基化与血清肿瘤标志物[癌胚抗原(CEA)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、鳞状细胞癌抗原(SCC-Ag)、细胞角蛋白19片段(CYFRA21)]对肺癌诊断效能,采用Spearman低剂量CT检查、SHOX2、RASSF1A甲基化与临床病理特征相关性。结果低剂量CT、SHOX2、RASSF1甲基化及三者联合分别确定40例、43例、46例、58例肺癌,三者联合与手术病理学诊断肺癌效能一致性Kappa值为0.951;三者联合诊断肺癌敏感度96.67%、准确度97.78%均高于三者单一诊断效能(P<0.05);肺癌患者血清CEA、SCC、NSE、CYFRA21水平均高于肺良性结节患者(P<0.05);低剂量CT联合SHOX2、RASSF1甲基化诊断肺癌效能的AUC为0.983,近似于四种血清肿瘤标志物诊断肺癌效能的AUC 0.933;不同肿瘤直径、临床分期、组织学分化肺癌患者低剂量CT检出率及SHOX2、RASSF1A甲基化阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05);肺癌患者低剂量CT检出率、SHOX2及RASSF1A甲基化阳性率与肿瘤直径、临床分期呈正相关,与组织学分化呈负相关(P<0.05)。结论低剂量CT联合SHOX2及RASSF1A甲基化可用于肺癌早期预警中,临床可通过其进行早期诊断、评估病情进展程度,以针对性展开后续治疗,改善预后。

非小细胞肺癌矮小同源盒基因2和Ras相关结构域蛋白家族1A基因甲基化的意义

目的:探究矮小同源盒基因(SHOX2)和Ras相关结构域蛋白家族1A(RASSF1A)基因甲基化与非小细胞肺癌(NSCLC)浸润、转移的关系。方法:采用甲基化特异性PCR法(MSP)分析NSCLC及其相应癌旁组织中SHOX2和RASSF1A基因启动子区甲基化状态,分析其甲基化状态与患者临床病理特征的关系。结果:NSCLC癌组织中SHOX2和RASSF1A基因启动子区甲基化率分别为68.97%(80/116)、33.62%(39/116),明显高于癌旁正常组织中的12.93%(15/116)、10.34%(12/116)(P<0.05);SHOX2和RASSF1A基因甲基化分布情况与NSCLC患者性别、年龄、吸烟史、肿瘤直径、分化程度无关(P>0.05),与其TNM分期、病理分型、淋巴结转移以及患者生存时间有关(P<0.05),TNM分期中Ⅲa+Ⅲb期患者SHOX2基因甲基化率明显高于Ⅰ+Ⅱ期患者(P<0.05),鳞癌患者基因甲基化率明显高于腺癌患者(P<0.05),有淋巴结转移患者基因甲基化率明显高于无淋巴结转移患者(P<0.05),生存时间<2年患者基因甲基化率明显高于生存时间≥2年患者(P<0.05);TNM分期中Ⅲa+Ⅲb期患者RASSF1A基因甲基化率明显高于Ⅰ+Ⅱ期患者(P<0.05),腺癌患者基因甲基化率明显高于鳞癌患者(P<0.05),有淋巴结转移患者基因甲基化率明显高于无淋巴结转移患者(P<0.05),生存时间<2年患者基因甲基化率明显高于生存时间≥2年患者(P<0.05)。结论:SHOX2和RASSF1A基因启动子区甲基化可能是NSCLC发生浸润以及转移的原因之一,检测SHOX2和RASSF1A基因启动子区甲基化可为NSCLC的诊断及预后评估提供参考价值。

青年食管鳞癌和贲门腺癌组织中Ras相关区域家族1A蛋白的表达

目的探讨青年食管鳞癌(SCC)和贲门腺癌(GCA)组织中Ras相关区域家族1A(RASSF1A)蛋白的表达变化特征。方法采用免疫组织化学检测河南省林州地区青年SCC和GCA组织RASSF1A蛋白表达,将癌组织阳性结果分为弥漫型、灶性、镶嵌型,并分析其与临床病理变化的关系。结果SCC和GCA组织中RASSF1A阳性表达频率均较高(83%(10/12)vs89%(8/9)),与对应正常组织中的表达差异无统计学意义(P>0.05),但表达类型并不相同。食管鳞癌以镶嵌型(4例)和灶性(4例)较多,弥漫型(2例)次之;食管正常组织以乳头性(3例)和灶性(3例)较多,镶嵌型(2例)次之,无弥漫型表达;贲门腺癌组织以灶性为主(6例),镶嵌型(2例)次之,无弥漫型表达;贲门正常组织以弥漫型(5例)较多,另有灶性(4例)表达。RASSF1A蛋白表达与SCC和GCA的转移、分化和浸润程度无相关性。结论RASSF1A蛋白阳性表达是河南高发区青年食管鳞癌和贲门腺癌组织中常见的分子事件,可能在食管和贲门癌变过程中起一定作用。

瑞马唑仑调节EPAC1/RAP1信号通路对急性心肌梗死大鼠心肌损伤的影响

目的探讨瑞马唑仑调节环腺苷酸激活的交换蛋白1(EPAC1)/RAS相关蛋白1(RAP1)信号通路对急性心肌梗死(AMI)大鼠心肌损伤的影响。方法将大鼠按照随机数字表法分为假手术组、模型组、瑞马唑仑组、瑞马唑仑+8-CPT(EPAC1的激动剂)组,每组20只。除假手术组外,其余各组大鼠通过左前降支结扎法构建AMI大鼠模型;小动物超声仪检测心功能指标;HE染色检测心肌组织病理情况;化学比色法检测大鼠心肌组织超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平;JC-1染色法检测大鼠心肌细胞线粒体膜电位;TUNEL染色检测心肌细胞TUNEL阳性率;Western blot检测心肌组织EPAC1、RAP1、胱天蛋白酶3(Caspase-3)蛋白表达水平。结果与假手术组相比,模型组大鼠心肌组织结构被严重破坏且浸润大量炎性细胞;心功能指标左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD),心肌组织MDA水平,心肌细胞TUNEL阳性率,心肌组织EPAC1、RAP1、Caspase-3蛋白表达水平均明显升高;左心室射血分数(LVEF)、左心室短轴缩短率(LVFS),心肌组织SOD水平,心肌细胞线粒体膜电位明显降低(P<0.05)。与模型组相比,瑞马唑仑组大鼠心肌损伤缓解,炎性细胞浸润减轻,心功能指标LVEDD、LVESD,心肌组织MDA水平,心肌细胞TUNEL阳性率,心肌组织EPAC1、RAP1、Caspase-3蛋白表达水平均明显降低;LVEF、LVFS,心肌组织SOD水平,心肌细胞线粒体膜电位明显升高(P<0.05)。EPAC1的激动剂减弱了瑞马唑仑对AMI大鼠心肌损伤的缓解作用。结论瑞马唑仑可能通过抑制EPAC1/RAP1信号通路抑制心肌细胞凋亡,减轻AMI大鼠心肌损伤。

支气管抽吸物中矮小同源盒2和Ras相关结构域家族蛋白1ADNA甲基化检测对早期肺癌诊断价值的Meta分析

目的系统分析支气管抽吸物(包括支气管肺泡灌洗液和冲洗液)中矮小同源盒2(SHOX2)和Ras相关结构域家族蛋白1A(RASSF1A)DNA甲基化对肺癌的诊断效能。方法检索PubMed、Embase、The Cochrane Library、Web of Science、Clinical Trail、CNKI、万方数据库发表的关于SHOX2和RASSF1A甲基化对肺癌诊断价值的文献,检索日期截至2021年5月11日,进行数据提取和质量评价,使用Stata 16.0软件进行Meta分析。结果本研究共纳入20篇文献,中文文献8篇,英文文献12篇。Meta分析结果显示:SHOX2甲基化诊断肺癌合并后的灵敏度、特异度、阳性似然比、阴性似然比和曲线下面积(AUC)分别为0.73、0.90、7.50、0.30和0.86。RASSF1A甲基化诊断肺癌合并后的灵敏度、特异度、阳性似然比、阴性似然比和AUC分别为0.51、0.96、14.10、0.50和0.82。SHOX2和RASSF1A甲基化联合诊断肺癌合并后的灵敏度、特异度、阳性似然比、阴性似然比和AUC分别为0.78、0.87、5.80、0.26、0.90。结论支气管抽吸物中SHOX2和RASSF1A甲基化对肺癌的诊断价值较高,对CT检查可疑肺癌的患者,其可能是肺癌早期筛查的重要手段。

肺癌侵袭转移与外周血RASSF1A、SHOX2甲基化水平的相关性研究

目的研究肺癌患者血浆Ras相关区域家族蛋白1A(RASSF1A)、矮小同源盒基因2(SHOX2)基因甲基化水平与肺癌侵袭转移的关系。方法选取2016年2月至2017年5月于该院就诊的96例肺癌患者为肺癌组(经组织病理学确诊);选取同期114例健康体检者作为对照组。亚硫酸氢钠处理基因组DNA后采用直接测序法检测血浆中RASSF1A、SHOX2基因甲基化水平;分析肺癌患者血浆RASSF1A、SHOX2基因甲基化与临床病理特征及预后的相关性;多因素COX回归分析影响肺癌预后的因素。结果肺癌组血浆RASSF1A、SHOX2基因甲基化阳性率高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);RASSF1A、SHOX2基因甲基化与肺癌患者年龄、性别、吸烟情况、肿瘤大小、病理类型无关(P>0.05),与肺癌患者组织分化程度、淋巴结转移、TNM分期有关(P<0.05);RASSF1A、SHOX2基因甲基化与肺癌患者预后有关(P<0.05),且RASSF1A、SHOX2甲基化组患者死亡比例高于RASSF1A、SHOX2非甲基化组;RASSF1A、SHOX2基因甲基化、TNM分期是影响肺癌患者死亡的独立危险因素(P<0.05)。结论RASSF1A、SHOX2基因甲基化可能在肺癌侵袭转移过程中发挥重要作用,为肺癌预后评估提供了重要依据,并有可能为其基因治疗提供新的靶点。

经皮冠状动脉介入治疗术后支架内再狭窄患者血浆Rap1A水平变化及其机制

目的:经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI)是冠状动脉疾病(coronary artery disease,CAD)的主要治疗方法之一,PCI术后支架内再狭窄(in-stent restenosis,ISR)是其一种严重的并发症,然而目前缺乏有效的防治手段。本研究拟检测Ras相关蛋白1A(Ras-related protein 1A,Rap1A)在ISR患者血浆中的表达水平及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)炎症损伤模型中的表达差异,并探讨Rap1A在调控TNF-α诱导的HUVECs炎症中的作用,为ISR的防治提供一个新的潜在靶点。方法:纳入2020年12月至2022年7月于中南大学湘雅医院心血管内科接受PCI支架植入术,且术后1年复查经皮冠状动脉造影(coronary arteriography,CAG)的冠心病住院患者共60例。患者入院后根据CAG诊断27例为PCI术后ISR,33例为无支架内再狭窄(non-in-stent restenosis,non-ISR)。收集2组患者的临床资料,并通过酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定患者血浆Rap1A水平,比较2组患者血浆Rap1A水平。在细胞实验中,通过TNF-α(10 ng/mL,24 h)构建HUVECs炎症损伤模型,采用实时反转录聚合酶链反应(realtime reverse transcription PCR,real-time RT-PCR)和蛋白质印迹法检测Rap1A、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)的mRNA及蛋白质表达水平。以TNF-α处理HUVECs诱导内皮细胞炎症,并运用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)敲减Rap1A,以探究Rap1A在调控TNF-α诱导的HUVECs炎症中的作用。结果:与non-ISR患者相比,ISR患者中有吸烟史(P=0.005)及合并糖尿病者比例更高(P=0.028),糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin,HbA1c)(P=0.012)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-c)(P=0.014)及高敏C反应蛋白(hypersensitive C-reactive protein,hs-CRP)(P=0.027)水平升高,余指标在2组间差异均无统计学意义(均P>0.05)。而ISR组的血浆Rap1A水平显著高于non-ISR组[942.14(873.28~1133.81)μg/mL vs 886.93(812.61~930.98)μg/mL;P=0.004]。单因素logistic回归分析结果显示糖尿病、LDL-c、Rap1A是ISR的危险因素(均P<0.05)。在细胞实验中,与对照组相比,以10 ng/mL TNF-α诱导24 h后,HUVECs中炎症因子IL-6、VCAM-1的mRNA及蛋白质表达水平均升高(均P<0.05),同时Rap1A的mRNA及蛋白质水平升高(均P<0.05)。进一步通过敲减HUVECs中Rap1A基因的表达,TNF-α诱导的IL-6、VCAM-1的mRNA及蛋白质表达水平均显著降低(均P<0.05)。结论:在冠心病PCI术后ISR患者血浆及TNF-α诱导的内皮细胞炎症损伤模型中,Rap1A蛋白质水平显著升高,提示Rap1A可能是预测ISR的潜在生物标志物。而在敲减Rap1A基因表达后,TNF-α诱导的内皮细胞炎症反应水平下降,提示Rap1A可能是治疗ISR内皮细胞炎症的潜在靶点。

同型半胱氨酸通过上调Rap1a诱导小鼠小胶质细胞炎性极化

目的:研究不同浓度同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)对BV2小鼠小胶质细胞介导的炎症反应的影响,探讨Ras相关蛋白1a(Ras-related protein 1a,Rap1a)在Hcy诱导的BV2细胞炎症反应中的作用机制。方法:体外培养小鼠小胶质细胞系BV2细胞,用Hcy干预,建立高同型半胱氨酸血症细胞模型,将细胞分成空白对照组、50μmol/L Hcy组、100μmol/L Hcy组和150μmol/L Hcy组,采用RT-qPCR法检测BV2细胞M1型极化标志物、炎症因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)及Rap1a的mRNA表达水平,ELISA法检测BV2细胞炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α的含量;Western blot法检测细胞内Rap1a的蛋白表达水平。进一步利用慢病毒转染过表达和敲减Rap1a对其功能加以验证。结果:100μmol/L以上浓度Hcy干预下,BV2细胞发生炎性极化,M1型极化标志物CD80和CD86 mRNA表达升高(P<0.05);IL-6、IL-1β和TNF-α等炎症因子mRNA及蛋白表达显著上调(P<0.05);Rap1a蛋白及mRNA表达水平均显著升高(P<0.05);Rap1a mRNA水平与CD80 mRNA及IL-1β和TNF-α含量均呈明显正相关(P<0.05)。过表达Rap1a和敲减Rap1a慢病毒的感染复数均为80,荧光显微镜观察可达有效转染率,过表达Rap1a加剧了Hcy诱导的BV2细胞炎性极化(P<0.05);敲减Rap1a可抑制Hcy诱导的BV2细胞炎性极化(P<0.05)。结论:Hcy可促进BV2小鼠小胶质细胞M1型极化、介导炎症反应。Rap1a可能是Hcy诱导BV2细胞炎症反应的重要调节因子。

胃镜活检组织RASSF1基因启动子甲基化检测及其临床意义分析

目的探讨胃镜活检组织RAS相关结构域蛋白1(RASSF1)基因启动子甲基化水平及其临床意义。方法采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测胃癌患者胃镜活检癌组织、癌旁组织及健康者正常胃组织RASSF1基因启动子甲基化状态,并比较其差异;分析胃癌患者RASSF1基因启动子甲基化与不同临床病理因素的关系。结果胃癌患者癌组织RASSF1基因启动子甲基化率为62.7%,癌旁组织甲基化率为4.0%,健康者正常胃组织甲基化率为2.7%,癌组织RASSF1基因启动子甲基化率高于癌旁组织和正常胃组织(P<0.05)。胃癌患者癌组织RASSF1基因启动子甲基化率在不同性别、年龄、病变部位及幽门螺杆菌感染患者间比较差异无统计学意义(P>0.05),在不同分化程度、肿瘤最大径、淋巴结转移、远处转移和TNM分期患者间,比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论胃癌患者胃镜活检癌组织RASSF1基因启动子甲基化率高于癌旁组织和正常胃组织,且甲基化率与癌组织分化程度、肿瘤最大径、淋巴结转移、远处转移和TNM分期有关,可反映胃癌患者的病情及预后。

Rap1A DNA甲基化在Hcy促进巨噬细胞增殖中的作用

目的探讨Rap1A DNA甲基化在同型半胱氨酸(Hcy)促进小鼠单核巨噬细胞RAW264.7增殖中的作用。方法将处于对数生长期的RAW264.7细胞分为对照组(Hcy 0μmol/L)和不同浓度的Hcy(20,40,60,80,100μmol/L)干预组,24 h后用XTT检测细胞活力;Edu检测细胞增殖情况;qRT-PCR和Western blot检测Rap1A的mRNA和蛋白的表达;甲基化特异性PCR法(MSP)检测Rap1A启动子区甲基化改变;激光共聚焦显微镜观察Rap1A的变化;将Rap1A干扰腺病毒转染RAW264.7细胞并用Hcy刺激,检测Rap1A的mRNA和蛋白水平的变化及细胞的增殖情况。结果与对照组相比,不同浓度的Hcy干预细胞后,细胞活力增强,其中100μmol/L Hcy浓度最为明显(P<0.01),且细胞增殖水平明显增加(P<0.01);经Hcy刺激后,细胞Rap1A的mRNA和蛋白表达量显著增加(P<0.01),启动子区甲基化水平降低(P<0.01);干扰Rap1A的表达后能够部分逆转Hcy所致的细胞增殖(P<0.01)。结论 Rap1A启动子区低甲基化介导了Hcy导致的RAW264.7细胞增殖。

同型半胱氨酸通过上调Rap1A表达促进小鼠巨噬细胞增殖及M1极化

目的:研究Ras相关蛋白1A(Rap1A)对同型半胱氨酸(Hcy)诱导的ANA-1小鼠腹腔巨噬细胞增殖和M1极化的影响,并探讨其作用机制。方法:体外培养ANA-1细胞,建立高Hcy血症细胞模型,并将细胞分成对照(control)组、Hcy组、Hcy+Rap1A干扰腺病毒(Ad-shRNA/Rap1A)组和Hcy+阴性对照腺病毒(Ad-shRNA/GFP)组。采用CCK-8法和EdU染色检测各组细胞的增殖能力;ELISA检测细胞培养液中炎症因子白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的浓度;RT-qPCR检测各组细胞Rap1A、增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期抑制蛋白p27、M1极化标志物CD80和CD86及M2极化标志物CD163和CD200R的mRNA表达;Western blot检测Rap1A、PCNA和p27蛋白表达。结果:与control组相比,Hcy组细胞活力、EdU阳性细胞数目、细胞培养液中IL-6和TNF-α浓度、CD80和CD86的mRNA表达水平及Rap1A和PCNA的mRNA和蛋白表达水平均显著升高(P<0.05),而CD163和CD200R的mRNA表达水平及p27的mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。与Hcy+Ad-shRNA/GFP组相比,Hcy+AdshRNA/Rap1A组细胞活力、EdU阳性细胞数目、CD80和CD86的mRNA表达水平及Rap1A和PCNA的mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.05),CD163和CD200R的mRNA表达水平及p27的mRNA水平和蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。结论:Hcy能够促进小鼠巨噬细胞增殖及M1极化,其机制与Hcy上调Rap1A表达有关。

微小RNA-433-3p靶向调控RAP1A对结直肠癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨微小RNA-433-3p(miR-433-3p)靶向Ras相关蛋白1A(RAP1A)调控结直肠癌细胞增殖、凋亡、迁移与侵袭的作用及机制。方法 采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测结直肠癌细胞的miR-433-3p水平。向SW480细胞转染miR-433-3p模拟物mimics(miR-433-3p mimics组)或无义序列(NC组),另将miR-433-3p mimics和RAP1A过表达质粒共转染SW480细胞(miR-433-3p mimics+RAP1A组),采用CCK-8法、流式细胞术、划痕实验和Transwell小室实验评估SW480细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭情况。双荧光素酶报告基因实验分析miR-433-3p和RAP1A间的靶向关系。qPCR和Western blotting法检测RAP1A、Bax、Bcl-2和基质金属蛋白酶(MMP)-2的mRNA和蛋白水平。结果 SW480、HCT116和LoVo细胞的中miR-433-3p水平低于Caco-2细胞(P<0.05)。RAP1A是miR-433-3p的作用靶点且miR-433-3p能够抑制SW480细胞中RAP1A的表达。与NC组相比,miR-433-3p mimics组SW480细胞增殖、迁移和侵袭能力减弱且凋亡增加并伴有Bcl-2和MMP-2水平降低和Bax水平升高(P<0.05)。相较于miR-433-3p mimics组,miR-433-3p mimics+RAP1A组SW480细胞增殖、迁移和侵袭能力增强且细胞凋亡降低并伴有Bcl-2和MMP-2水平升高和Bax水平降低。结论 结直肠癌中miR-433-3p表达下调且发挥抑癌基因的作用,miR-433-3p/RAP1A轴有望成为结直肠癌的潜在治疗靶点。

EYA4通过抑制NF-κB依赖的RAP1反式激活抑制肝细胞癌的生长和侵袭

背景与目的我们之前研究表明,眼缺失蛋白同源物4(eyes absent homolog 4,EYA4)是果蝇眼部发育相关的眼缺乏蛋白家族成员之一,在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)标本中常发生甲基化和沉默,并与患者生存期短密切相关。本研究旨在探讨EYA4在HCC中作为肿瘤抑制因子的作用机制。方法转染EYA4表达质粒(pEYA4)构建稳定表达EYA4的人HCC细胞系Huh-7和PLC/PRF/5(PLC)。通过BALB/c裸鼠皮下注射稳定转染细胞建立异种移植肿瘤。组织标本来自75例病理诊断为HCC的患者。采用实时定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)、蛋白质免疫印迹和免疫组织化学的方法检测EYA4在细胞系、异种移植物和临床标本中的表达;研究了稳定转染细胞系的细胞增殖、克隆形成、侵袭性和肿瘤形成。利用基因表达芯片筛选EYA4调节的基因。通过共转染EYA4和带Flag标签的RAS相关蛋白1A(RAS-related protein 1A,RAP1A)基因的表达质粒(pEYA4和Flag-RAP1A)、功能研究、染色质免疫共沉淀、免疫荧光染色和细胞泛素化分析等方法,研究了EYA4对核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)/RAS相关蛋白1(RAS-related protein 1,RAP1)信号通路的影响。结果恢复HCC细胞系中EYA4的表达可抑制细胞的增殖、抑制克隆形成、降低细胞的侵袭性和抑制异种移植肿瘤生长,在体外实验中Flag-RAP1A可逆转pEYA4的抑制作用。用肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)激活NF-κB通路可增加p65与RAP1A基因启动子的结合并上调RAP1蛋白的表达。用BAY 11-7085和p65 siRNA抑制NF-κB通路,成功阻断了TNF-α诱导的RAP1上调。EYA4拮抗了TNF-α诱导的NF-κB抑制因子α(inhibitor of NF-κBα,IκBα)的磷酸化和泛素化以及p65的核易位和反式激活,进而抑制了NF-κB的活性和RAP1的表达。用calyculin A阻断EYA4的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性可显著消除其对NF-κB活性的抑制作用。此外,EYA4的表达与HCC临床标本中IκBα/RAP1活性呈负相关。结论我们的研究结果为明确EYA4是真正的肿瘤抑制因子提供了功能和机制的理论基础,该肿瘤抑制因子可抑制NF-κB/RAP1信号通路的异常激活,从而抑制HCC生长和侵袭。

血浆Ras相关区域家族蛋白1A基因甲基化在肝细胞癌分子诊断中的价值

目的:建立一种可检测微量DNA标本中DNA甲基化的甲基化敏感性限制性内切酶-定量PCR(methylation-sensitive restriction enzymes-based quantitative PCR,MSRE-qPCR)方法,并运用该技术探讨血浆Ras相关区域家族蛋白1A(Ras association domain family1A,RASSF1A)基因甲基化检测在肝细胞癌(hepatocellutar carcinoma,HCC)非侵入性诊断中的价值。方法:用MSRE HhaⅠ消化DNA样品,再用qPCR技术分析酶切结果,建立检测RASSF1A基因甲基化的MSRE-qPCR方法。以45例肝组织(20对HCC患者手术切除肿瘤标本及匹配非癌组织和5例正常肝)为材料,测试该方法的应用价值;运用亚硫酸氢盐测序PCR(bisulf ite sequencing PCR,BSP)技术进行进一步验证,并与甲基化特异性PCR(methylation specif ic PCR,MSP)方法相比较。再运用该技术检测150例血浆标本(包括72例HCC患者、37例肝硬化或慢性肝炎等良性病变患者和41例健康对照)的RASSF1A基因甲基化状态,并分析其与HCC患者临床病理参数的关系。结果:MSRE-qPCR法可定量检测低至1%以下的RASSF1A甲基化片段。20例HCC组织中有14例(70%)发生RASSF1A高甲基化,对应非癌组织中RASSF1A甲基化阳性率为25%,而5例正常肝组织均为阴性。MSRE-qPCR结果经BSP验证无误,且与MSP检测结果具有较好的一致性。HCC患者血浆RASSF1A甲基化阳性率(47/72,65.3%)显著高于健康对照(1/41,2.4%)和肝良性病变组(3/37,8.1%),差异均有统计学意义(P<0.0001)。联合检测血浆RASSF1A甲基化与血清AFP可显著提高HCC诊断效率。结论:建立的MSRE-qPCR方法要求样本少、操作简便、成本低廉,可定量检测RASSF1A基因甲基化水平。血浆RASSF1A甲基化分析对于HCC的非侵入性诊断具有重要价值。

Ras相关域家族蛋白1A基因甲基化在子宫内膜异位症组织中的表达及意义

目的：分析子宫内膜异位症（EMS）中Ras相关域家族蛋白1A（RASSF1A）基因的表达情况及其与启动子甲基化状态的关系。方法选择45例卵巢EMS患者的异位内膜及相对应的在位内膜组织和20例非 EMS 患者的正常子宫内膜组织。免疫组化法检测组织标本中RASSF1A基因的表达情况，甲基化特异性聚合酶链反应（PCR）法检测RASSF1A启动子甲基化状态。结果异位内膜、在位内膜及正常内膜组织中RASSF1A表达率依次升高，分别为37.78%（17/45）、60.00%（27/45）、85.00%（17/20），差异有统计学意义（χ2=13.136，P=0.001）。异位内膜、在位内膜组织中 RASSF1A 启动子甲基化率分别为55.56%（25/45）、33.33%（15/45）、0，三组RASSF1A启动子甲基化率比较差异有统计学意义（χ2=18.770，P=0.000）。异位内膜组织中RASSF1A启动子甲基化率在增生期、分泌期分别为66.67%（14/21）、45.83%（11/24）；在位内膜组织中RASSF1A启动子甲基化率在增生期、分泌期分别为38.10%（8/21）、29.17%（7/24），差异均无统计学意义（P＞0.05）。异位内膜组织中，Ⅲ～Ⅳ期RASSF1A启动子甲基化率明显高于Ⅰ～Ⅱ期（χ2=5.940，P=0.015）。在异位内膜和在位内膜组织中，RASSF1A表达水平与RASSF1A启动子甲基化状态呈负相关（r=-0.594、-0.577，P〈0.01）。结论 RASSF1A启动子甲基化导致的基因转录沉默与EMS的发生、发展密切相关。评估在位内膜组织RASSF1A启动子甲基化水平可作为EMS的表观遗传学标志物，有助于EMS的早期诊断。

力调控Talin与Rap1b相互作用的分子动力学模拟

踝蛋白(Talin)的F0结构域与Ras相关蛋白1b(Rap1b)的结合对血栓形成至关重要。然而Talin作为一种力敏感蛋白,力能否调控Talin-F0/Rap1b的相互作用以及如何调控,尚不明晰。为探究力对TalinF0/Rap1b结合亲和力的影响以及相应动力学机制,采用拉伸分子模拟的手段,以Talin-F0/Rap1b复合物结构为对象,观察并比较分析不同作用力下复合物功能-构象信息的变化情况。结果表明,复合物受力解离过程至少存在两种路径且两者机械强度有显著差异,决定机械强度差异的关键事件是F0结构域的β4片层是否从原先的β1-β4片层平行结构被拉出。随着力的增大,复合物的相互作用将先增强后减弱,表现出“逆锁-滑移键”的特性。ASP54-ARG41、GLN18-THR65这两对残基的相互作用受到力学信号的调控,20 pN的机械力能显著增强这些残基的作用指数,从而导致复合物结合亲和力大幅提升。本研究预报了胞内环境中力对Talin-F0/Rap1b相互作用的调控机制,为相关疾病的治疗和药物的开发提供了新的思路。

Rap1蛋白在非创伤性股骨头坏死骨组织血管内皮中的表达

目的分析Ras相关蛋白1(Ras-associated protein 1,Rap1)在非创伤性股骨头坏死(non-traumatic osteonecrosis of the femoral head,NONFH)患者骨组织坏死与正常区域的表达差异。方法分别收集NONFH和创伤性股骨头坏死(traumatic osteonecrosis of the femoral head,TONFH)患者经髋关节置换术后的股骨头组织各30例。NONFH组男19例,女11例;年龄26~69岁,平均49.6岁,国际骨循环协会(ARCO)Ⅲb期8例,Ⅳ期10例,Ⅴ期12例;TONFH组男16例,女14例;年龄37~68岁,平均54.2岁,ARCOⅢb期11例,Ⅳ期9例,Ⅴ期10例。两组间性别及年龄差异无统计学意义(P>0.05),ARCO分期构成比差异亦无统计学意义(Z=-0.769,P=0.442)。取NONFH骨标本坏死区(A区)和正常区(B区),TONFH骨标本正常区域(B’区)(对照组)。采用Western blot、实时荧光定量PCR分析3个区域骨组织中Rap1、血管内皮生长因子(VEGF)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、Akt蛋白及相应mRNA表达差异,HE和免疫组化染色观察各区域的形态学改变。结果Western blot检测结果显示,B区、B’区间Rap1、VEGF、PI3K及Akt蛋白相对表达量差异均无统计学意义(P>0.05)。而A区Rap1、VEGF、PI3K及Ak蛋白相对表达量均较B区减少,差异有统计学意义(P<0.05)。实时荧光定量PCR检测结果显示,与B区比较,A区Rap1、VEGF、PI3K、Akt mRNA相对表达量均较B区降低,差异有统计学意义(P<0.05);B区、B’区两组间Rap1、VEGF、PI3K及Akt mRNA相对表达量差异均无统计学意义(P>0.05)。HE和免疫组化染色:NONFH坏死区域(A区)软骨细胞减少、细胞核消失,软骨下骨小梁断裂,骨小梁增厚,出现空骨陷窝;坏死区周围新生毛细血管和纤维组织构成的肉芽组织增生爬行,但Rap1、VEGF、PI3K和Akt在此区域阳性表达较正常区域弱。同时Rap1、PI3K、Akt在A、B两区域的骨小梁中均有阳性表达,表达强度相似。B区域微动脉、微静脉内膜及周围间质细胞膜上可见Rap1、VEGF、PI3K及Akt均有强阳性表达,但A区较B区阳性表达明显减少;而B’与B区各指标的阳性表达部位与强度相似。结论NONFH的坏死可能与Rap1-PI3K/Akt信号通路受到抑制导致其表达下降所引起的血管内皮损伤有关。

水苏碱调节EPAC1/Rap1信号通路对H/R诱导的心肌细胞凋亡的影响

该文旨在探究水苏碱(STA)调节环腺苷酸直接激活的交换蛋白1(EPAC1)/Ras相关蛋白1(Rap1)信号通路对缺氧/复氧(H/R)诱导的心肌细胞凋亡的影响。将H9C2细胞分为对照组、模型组(H/R)、H/R+STA(5μmol/L STA)组、H/R+8-CPT(EPCA1激动剂8-CPT,30μmol/L)组、H/R+STA+8-CPT组(5μmol/LSTA+30μmol/L8-CPT)、H/R+ESI-09(EPCA1抑制剂ESI-09,1μmol/L)组、H/R+STA+ESI-09组(5μmol/L STA+1μmol/L ESI-09)。利用CCK-8法检测H9C2细胞增殖情况;DCFH-DA法检测H9C2细胞活性氧(ROS)水平;流式细胞术检测H9C2细胞凋亡情况;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测心肌细胞中EPAC1、Rap1的mRNA表达水平;Western blot检测心肌细胞中EPAC1、Rap1、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)蛋白表达水平。结果显示:与对照组比较,H/R组H9C2细胞中ROS水平、细胞凋亡率、Bax蛋白表达水平以及EPAC1、Rap1的mRNA及蛋白表达水平均显著升高,细胞增殖活力和Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.05);与H/R组相比,H/R+STA组和H/R+ESI-09组H9C2细胞中ROS水平、细胞凋亡率、Bax蛋白表达水平以及EPAC1、Rap1的m RNA及蛋白表达水平均显著降低,细胞增殖活力和Bcl-2蛋白表达水平显著升高(P<0.05),而H/R+8-CPT组指标与上述趋势相反(P<0.05);与H/R+STA组相比,H/R+STA+8-CPT组H9C2细胞中ROS水平、细胞凋亡率、Bax蛋白表达水平以及EPAC1、Rap1的mRNA及蛋白表达水平均显著升高,细胞增殖活力和Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.05),而H/R+STA+ESI-09组指标与上述趋势相反(P<0.05)。总之,STA可能通过抑制EPAC1/Rap1信号通路,改善由H/R诱导的心肌细胞凋亡。

RAP1在肝细胞癌中的表达及其功能机制研究

RAS相关蛋白1(RAS-associated protein 1,RAP1)是属于RAS家族的一种小分子G蛋白,被报道与多种癌症有关。然而,RAP1在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的作用及机制尚不清楚。TCGA和GTEx联合分析显示,HCC组织中RAP1A和RAP1B的mRNA水平显著高于正常肝组织。免疫组织化学技术和蛋白质免疫印迹(Western blot,WB)分析均证实,HCC患者癌组织中的RAP1蛋白水平高于其癌旁正常组织。体外研究表明,与对照细胞相比,下调RAP1表达可以减弱HCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力。从机制上说,下调RAP1表达可以促进线粒体氧化磷酸化,抑制糖酵解,并激活p38 MAPK通路,而抑制p38 MAPK通路可以抑制HCC线粒体功能,提示RAP1可以通过抑制p38 MAPK通路促使细胞代谢从氧化磷酸化转为糖酵解,从而促进HCC进程。尽管还需要进一步的研究来阐明RAP1是如何调节p38 MAPK通路及其下游能量代谢重编程的,但该研究结果为HCC的治疗提供了新的潜在靶点。

miR-28调控非小细胞肺癌细胞增殖、迁移与侵袭的作用机制

目的探讨微小RNA-28(miR-28)对非小细胞肺癌细胞株细胞A549和H1299的影响及其作用机制。方法通过转染miR-28 mimics过表达miR-28,转染miR-28 inhibitor抑制miR-28的表达,其中miR-28 NC作为对照组。通过CCK-8实验、克隆形成试验和细胞周期实验分别评估过表达miR-28、抑制miR-28对非小细胞肺癌细胞增殖能力的影响;通过划痕实验、Transwell迁移及Boyden小室侵袭实验分别评估过表达miR-28、抑制miR-28对非小细胞肺癌细胞迁移与侵袭能力的影响;通过生物信息学软件分析发现Ras相关蛋白1b(RAP1B)可能是miR-28的潜在靶基因并利用荧光素酶报告基因实验进行验证;通过RT-qPCR和Western blot方法检测过表达和抑制miR-28表达后A549和H1299细胞RAP1B的表达。结果与miR-28 NC比较,miR-28 mimics组A549和H1299细胞的增殖速度明显减慢,迁移及侵袭能力明显减弱,差异均有统计学意义(P<0.05);miR-28 inhibitor组A549和H1299细胞的增殖速度增快,迁移及侵袭能力明显增强,差异均有统计学意义(P<0.05);在非小细胞肺癌细胞中,荧光素酶报告基因实验表明miR-28可以靶向RAP1B基因;与miR-28 NC比较,miR-28 mimics组A549和H1299细胞RAP1B mRNA和RAP1B蛋白的表达明显减少,差异均有统计学意义(P<0.05);miR-28 inhibitor组A549和H1299细胞RAP1B mRNA和RAP1B蛋白的表达明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论miR-28可能通过下调靶基因RAP1B从而抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移与侵袭。