Ras相关C3肉毒杆菌毒素底物1在肺部疾病中作用及机制的研究进展

Ras相关C3肉毒杆菌毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1,RAC1)是Ras GTPase超家族的重要成员,在细胞的运动、增殖、黏附等方面发挥核心作用,同时还参与调节血管通透性以及细胞屏障功能。近年来,RAC1在多种肺部疾病发生、发展过程的作用逐渐受到关注,并逐渐成为肺部疾病研究的新方向。本文系统阐述了RAC1的生物学特性并总结了其在肺肿瘤、慢性阻塞性肺疾病、肺损伤和动脉型肺动脉高压中的功能及分子机制,以期为肺部疾病的治疗提供新思路。

Ras相关C3肉毒杆菌毒素底物3在1型糖尿病和树突状细胞中的作用初探

目的初步探索ras相关C3肉毒杆菌毒素底物3(RAC3)在1型糖尿病(T1DM)和树突状细胞(DC)中的作用。方法选取来自广东省T1DM转化医学研究中2011至2016年入组后规律随访的T1DM患者作为病例组,选择2011至2016年来自中山大学附属第三医院就诊的正常糖耐量者作为健康对照组。病例组和对照组均在筛选阶段进行全外显子组测序,在验证阶段进行基因分型。使用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建C57BL/6小鼠背景的RAC3全身敲除(KO)小鼠模型。使用聚合酶链反应(PCR)、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western blotting法分别验证RAC3在DNA、RNA和蛋白水平是否被敲除。通过流式细胞染色检测RAC3 KO小鼠和同窝野生对照(WT)小鼠(每组3只)的DC分化比例以及主要组织相容性复合体Ⅱ类分子(MHCⅡ)、CD86和CD80等成熟活化指标的表达水平。采用logistic回归分析法比较病例组和对照组之间等位基因频率分布的差异。组间比较采用独立样本t检验。结果筛选阶段共纳入72例T1DM患者和487名健康对照,验证阶段共纳入122例T1DM患者和577名健康对照。筛选阶段结果显示,T1DM患者中RAC3 rs4969478位点的等位基因T频率高于健康对照[分别为7.64%(11/144)和1.13%(11/974),OR=9.38,P<0.001]。验证阶段基因分型结果同样显示,T1DM患者中RAC3 rs4969478位点的等位基因T频率高于健康对照[分别为4.50%(11/244)和1.13%(13/1154),OR=4.14,P<0.01]。WT小鼠和RAC3 KO小鼠的DC分化比例差异无统计学意义(分别为85.6%±1.1%和83.3%±0.25%,P=0.08)。WT小鼠和RAC3 KO小鼠DC中MHCⅡ、CD86和CD80等成熟活化指标的表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)。结论遗传学研究提示RAC3可能是人类T1DM的易感基因,但可能不通过DC参与T1DM的发生。

Rac1b与恶性肿瘤关系的研究进展

Ras相关C3肉毒梭菌毒素1b(Rac1b)是Ras相关C3肉毒梭菌毒素1(Rac1)的一种剪接变异体,游走循环于GTP结合和GDP结合状态之间。Rac1b具有较低的GTP酶活性,且不能与GDP黏附,这就导致Rac1b活性的GTP结合状态居于主导地位,细胞的各项生命活动处于持续激活状态,从而引起细胞恶性转化。目前已有大量研究证实,Rac1b与肿瘤的失控增殖、迁移、侵袭等恶性生物学行为密切相关。

miR-7a-5p负调控Rac1表达参与HepG2细胞胰岛素抵抗

目的:探讨软脂酸诱导胰岛素抵抗的HepG2细胞中微小RNA-7a-5p(microRNA-7a-5p,miR-7a-5p)是否通过调控Ras相关C3肉毒毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1,Rac1)表达参与细胞胰岛素抵抗。方法:应用生物信息学分析预测其下游靶分子,构建含Rac13'端非翻译区的野生型及突变型hsa-Rac1萤光素酶报告质粒,与miR-7a-5p表达慢病毒或对照空载慢病毒共转染293T细胞,检测萤光素酶活性。HepG2细胞分为软脂酸诱导的胰岛素抵抗组和正常对照组,RT-qPCR分析两组细胞miR-RNA-7a-5p的表达,Western blot分析下游靶分子蛋白的表达。HepG2细胞分为干扰慢病毒转染组和对照慢病毒转染组,转染之后,软脂酸诱导两组细胞胰岛素抵抗,分析两组HepG2细胞中脂质堆积及葡萄糖消耗情况。结果:生物信息学预测Rac1为miR-7a-5p下游分子。野生型hsa-Rac1萤光素酶报告质粒与miR-7a-5p表达慢病毒共转染后,萤光素酶较对照组显著降低(P<0.05)。胰岛素抵抗的HepG2与对照细胞组相比,miR-7a-5p表达显著下调(P<0.05),Rac1蛋白表达显著上调(P<0.05)。较对照相比,Rac1 mRNA的表达抑制增加了胰岛素抵抗HepG2细胞的葡萄糖消耗(P<0.05),降低了胞质内脂质堆积(P<0.05)。结论:miR-7a-5p的一个潜在靶点是Rac1。miR-7a-5p通过负调节Rac1表达参与软脂酸诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗。

胃癌切除术后T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1及Ras相关C3肉毒毒素底物1表达变化分析及临床意义

目的探讨胃癌切除术后T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(Tiam1)与Ras相关C3肉毒毒素底物1(Rac1)表达变化情况及其临床意义。方法选取自2016年1月至2017年5月宜昌市第一人民医院收治的胃癌患者120例,分析患者胃癌组织中Tiam1和Rac1表达与病理特征间的关系,以及切除术治疗前后患者胃癌组织Tiam1和Rac1表达变化情况。结果 Tiam1表达及Racl表达均与胃癌患者的浸润深度、分化程度、淋巴结转移及TNM分期等因素存在显著相关性(P<0.05)。Tiam1表达阳性组织的Rac1阳性率显著高于Tiam1表达阴性的组织(P<0.05)。同时,Tiam1及Rac1阳性表达呈显著正相关(P<0.05)。胃癌切除术后患者Tiam1阳性率及Rac1阳性率显著低于治疗前(P<0.05)。结论胃癌转移发生受各种因素的影响,阻断Tiam1及Racl信号转导通路有利于抑制肿瘤转移,改善胃癌切除术的治疗效果。

HIF-1α和Rac1在宫颈鳞状细胞癌中的表达及意义

目的探讨缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和Ras相关C3肉毒杆菌毒素底物1（Rac1）在宫颈上皮内瘤变（CIN）和鳞状细胞癌中的表达以及临床意义。方法采用免疫组织化学法检测正常宫颈组织20例、宫颈CIN42例（CINI级12例，CINⅡ-Ⅲ级30例）、宫颈鳞状细胞癌58例（高分化15例，中分化24例，低分化19例）中HIF-1α和Rac1蛋白的表达情况，以分析其表达与临床病理特征的关系，并结合临床资料进行分析。结果HIF-1α蛋白在正常宫颈黏膜组织中的阳性表达率为0％（0／20），CINI级组织阳性表达率为16．7％（2／12），CINⅡ～Ⅲ级组织阳性表达率为56．7％（17／30），宫颈鳞状细胞癌组织阳性表达率为81．0％（47／58），其中高分化阳性表达率53．3％，中分化阳性表达率83．3％，低分化阳性表达率100％。HIF-1α蛋白在宫颈鳞状细胞癌发生发展中的表达依次升高，差异具有统计学意义（P〈0．05）。且宫颈鳞状细胞癌组织中HIF-1α蛋白表达与其组织学分级、TNM分期及淋巴结转移有关（P〈0．05）。Rac1蛋白表达在正常宫颈黏膜组织中的阳性表达率为0％（0／20），宫颈CINI级组织阳性表达率为8．3％（1／12），宫颈CINⅡ～Ⅲ级组织阳性表达率为53．3％（16／30），宫颈鳞状细胞癌组织阳性表达率为77．6％（45／58），其中高分化阳性表达率60．0％，中分化阳性表达率73．0％，低分化阳性表达率94．7％。Rac1蛋白在宫颈癌发生发展中的表达依次升高，差异具有统计学意义（P〈0．05）。且宫颈鳞状细胞癌组织Rac1蛋白表达与其组织学分级、TNM分期及淋巴结转移有关（P〈0．05）。HIF-1α蛋白的阳性表达率与Rac1蛋白的阳性表达率呈正相关（r=0．3，P〈0．05）。结论HIF-1α及Rac1联合检测蛋白表达有助于判断宫颈鳞状上皮肿瘤的病变程度及预后。

小鼠黑色素瘤细胞外泌体促进成纤维细胞表达Rac1蛋白

目的:探讨小鼠黑色素瘤细胞外泌体对成纤维细胞表达Ras相关C3肉毒毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1,Rac1)蛋白的影响。方法:超高速离心法分离小鼠黑色素瘤B16-F10细胞外泌体,电镜负染色观察外泌体的形态,纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)测定外泌体的粒径分布,Western blot鉴定外泌体标志蛋白肿瘤易感基因101(tumor susceptibility gene 101,Tsg101)和酪氨酸酶相关蛋白2(tyrosinase-related protein 2,Tyrp2)的表达;激光共聚焦显微镜观察在共培养过程中小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)摄取外泌体的过程;免疫细胞化学染色和Western blot实验分析MEF表达Rac1蛋白的情况。结果:B16-F10细胞外泌体在电镜下呈典型茶托状形态,NTA测得其粒径范围在141~255 nm,Western blot测出其标志蛋白Tsg101和Tyrp2。激光共聚焦显微镜观察结果显示,与共培养0 h相比,共培养12 h的MEF内有少量的外泌体,且共培养24和36 h的MEF内聚集了大量的外泌体。Western blot结果表明,与共培养0 h相比,共培养24和36 h的MEF中Rac1蛋白表达水平显著增加(P<0. 01)。免疫细胞化学染色结果表明,与共培养0 h相比,共培养12、24和36 h的MEF中Rac1蛋白阳性表达水平显著增加(P<0. 05或P<0. 01)。结论:小鼠黑色素瘤细胞外泌体可促进成纤维细胞表达Rac1蛋白。

Rac1与肿瘤发生发展关系的研究进展

Ras相关C3肉毒毒素亚基1(Rac1)是Ras超家族Rho亚族Rho GTP酶的经典成员,生理状态下与细胞的多种生理生化活动密切相关。目前越来越多的证据表明,Rac1活性和表达异常与肿瘤发生、存活、转移、抗凋亡、耐药性等肿瘤特性密切相关。因基因突变或其他因素导致的Rac1活性上升或表达增加,可促进肿瘤的发生、发展和转移、侵袭,导致患者预后不良。然而,体外实验发现,使用特异性抑制剂或基因剔除技术等抑制Rac1活性或者降低其表达,可以抑制肿瘤的侵袭、转移等恶性行为。临床上部分抗肿瘤药物也是通过抑制Rac1达到抗肿瘤目的。

Rac1促进异质型细胞叠套结构的形成

异质型细胞叠套结构(heterotypic cell-in-cell structure,heCICs)与肿瘤发生和发展密切相关,在生命科学研究中的重要性逐渐显露。Ras相关C3肉毒毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1,Rac1)属于经典的Rho GTP酶,在细胞骨架以及细胞运动中起到关键调控作用。为研究Rac1在he CICs形成中的作用和机制,利用活细胞示踪剂cell-tracker分别标记肿瘤细胞和免疫杀伤细胞,建立heCICs模型。利用Rac1抑制剂NSC23766抑制Rac1活性后发现,肿瘤细胞与免疫杀伤细胞之间的heCICs形成率显著降低。通过分子克隆技术获得重组质粒pQCXIP-Rac1-EGFP,进行病毒包装感染肿瘤细胞获得Rac1过表达细胞系。进一步检测Rac1过表达对heCICs形成能力的影响,结果表明,Rac1表达水平升高后,heCICs形成率显著升高。本研究显示Rac1具有促进he CICs形成的作用,这为Rac1作为细胞叠套相关疾病的药物治疗靶点奠定了研究基础。

遗忘的神经机制及其与神经系统疾病的相关性

遗忘是记忆系统的重要组成部分。一方面,生理条件下,正常的遗忘有助于维持大脑记忆系统稳态;另一方面,异常的遗忘与多种病理条件下记忆障碍的发生发展密切相关。或者说,遗忘是为了更好的记忆。对不愉快或者不必要记忆的遗忘有利于机体及时地获取新信息以适应环境的变化;而遗忘出现异常很可能会导致相关记忆障碍。例如,阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease, AD)和癫痫患者出现加速遗忘的症状、创伤后应激障碍(post-traumatic stress disorder, PTSD)和自闭症患者无法忘记不愉快的记忆。目前,生理条件下正常的遗忘与病理条件下异常的遗忘之间有何联系和区别仍未完全清楚,如何通过调控遗忘过程以改善患者的记忆障碍也有待进一步研究。本文主要就Ras相关的C3肉毒杆菌毒素底物1 (Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1, Rac1)、细胞分裂周期因子42 (cell division cycle 42, Cdc42)、神经发生、小胶质细胞、多巴胺及α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体(alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors, AMPA receptors)在生理条件下参与遗忘调控,以及阿尔茨海默症、癫痫、创伤后应激障碍、自闭症等病理条件下遗忘机制的异常进行阐述,分别旨在进一步理解遗忘的神经分子机制,为相关神经系统疾病的防治提供新思路。

长链非编码RNA AURKAPS1通过上调RAC1活化细胞外信号调节激酶信号通路促进肝癌进展的机制研究

目的探讨AURKAPS1在肝癌细胞中的表达、功能和分子机制,为肝癌的防治提供新思路。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术对肝癌细胞系和正常肝脏上皮细胞进行检测;将肝癌细胞系随机分为空白组,AURKAPS1组、RAC1组和AURKAPS1+RAC1组,其中空白组表示肝癌细胞不进行任何干预,AURKAPS1组中的肝癌细胞仅接受AURKAPS1干预,RAC1组为转染RAC1的肝癌细胞,AURKAPS1+RAC1组表示同时转染AURKAPS1和RAC1,采用实时荧光定量PCR技术检测4组细胞中RAC1的表达;采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法、流式细胞术和Transwell转移法检测肿瘤细胞的增殖、凋亡和迁移能力;蛋白质免疫印迹法测定各组细胞中细胞外信号调节激酶(ERK)和RAC1蛋白表达;间接免疫荧光检测细胞中ERK的表达。组间独立样本采用t检验,多组间进行F检验、LSD检验。结果肝癌组织中RAC1 mRNA的表达量(0.98±0.08)显著高于正常人肝上皮细胞组织(0.72±0.03),差异有统计学意义(t=30.431,P<0.05);AURKAPS1组(1.03±0.10)、RAC1组(1.05±0.09)及AURKAPS1+RAC1组(1.16±0.07)的RAC1 mRNA的表达量均高于空白组(1.16±0.07),AURKAPS1+RAC1组的RAC1 mRNA表达量也显著高于分别转染AURKAPS1、RAC1的肝癌细胞组,差异有统计学意义(F=5.991,P<0.05);CCK-8法检测肝癌细胞的增殖,随着时间的增加,除空白组,其余3组的吸光度(A)_(450)值均增加,96 h后AURKAPS1+RAC1组的A_(450)值显著高于RAC1组及AURKAPS1组(F_(0 h)=2.941,F_(24 h)=26.454,F_(48 h)=104.60,F_(72 h)=319.555,F_(96 h)=564.65)P<0.05;AURKAPS1组[(5.89±3.82)%]、RAC1组[(5.81±3.85)%]及AURKAPS1+RAC1组[(4.23±4.15)%]的总凋亡率均低于空白组[(6.75±3.36)%],且AURKAPS1+RAC1组的总凋亡率显著低于RAC1、AURKAPS1组,F=77.369,P<0.05;AURKAPS1组(131.24±9.25)、RAC1组(129.87±9.41)及AURKAPS1+RAC1组(153.62±7.48)的穿膜细胞数均高于空白组(117.64±10.53),且AURKAPS1+RAC1组的穿膜细胞数显著高于RAC1组及AURKAPS1组(F=91.118,P<0.05);Western blot法检测4组肝癌细胞的ERK及RAC1蛋白表达,转染后3组的ERK及RAC1蛋白的相对表达量均高于空白组,且AURKAPS1+RAC1组的ERK及RAC1蛋白的相对表达量显著高于RAC1组及AURKAPS1组(F_(β-actin)=0.000,F_(ERK)=68.342,F_(RAC1)=52.868,P<0.05);AURKAPS1组[10(40.00)]、RAC1组[11(44.00)]及AURKAPS1+RAC1组[19(76.00)]的ERK阳性率均高于空白组[4(16.00)],且AURKAPS1+RAC1组的ERK阳性率显著高于RAC1组及AURKAPS1组(χ^(2)=6.650,P<0.05)。结论长链非编码RNA AURKAPS1能够使RAC1蛋白的表达量增加,活化ERK信号通路,进一步影响肝癌细胞的增殖、凋亡和迁移,促进肝癌细胞的生长和进展。

酒精对小鼠海马组织树突棘形态可塑性及记忆功能的影响

目的探讨酒精对小鼠海马组织树突棘形态可塑性及记忆功能的影响。方法15只野生型C57BL/6雄性小鼠随机分成对照组(Control,Con组)、单纯酒精处理组(Ethanol,Et组,给予小鼠20%乙醇2 mL/kg、每天1次,持续2周)及EHOP016治疗组(Et+EHOP016组,给予小鼠20%乙醇2 mL/kg后,立即灌胃EHOP016、持续2周),采用Morris水迷宫实验检测小鼠记忆能力,卢色黄胞内注射检测小鼠海马区域树突棘数量,免疫蛋白印迹法检测小鼠海马脑区Ras相关的C3肉毒杆菌毒素底物1-三磷酸鸟苷(Rac1-GTP)、C3肉毒杆菌毒素底物1总蛋白(Total Rac1)、突触素I(Synapsin I)、突触体素(Synatophysin)和突触后致密蛋白95(PSD95)表达。结果与Con组比较,乙醇处理可明显激活海马Et组小鼠树突棘数量减少、Synapsin I及Synatophysin水平降低,水迷宫实验显示小鼠记忆能力降低;与Et组比较,EHOP016组小鼠海马组织Rac1-GTP水平明显降低、减轻酒精导致的小鼠记忆能力的损伤、抑制酒精导致的成熟型树突棘数量的减少、上调酒精导致的突触相关蛋白的减少。结论酒精可能通过激活Rac1来减少树突棘数量,从而导致记忆功能损害。